具体实施方式

下面参照附图描述本公开的一些非限制性实施例。该描述的实施例仅仅是本发明的部分，而非全部实施例。本领域的一般技术人员基于本公开实施例所获得的所有其他实施例应落入本公开的范围。

在各种实施例中，本公开提供了确定目标颗粒尺寸信息的方法。该方法包括:测量卡盒内目标颗粒和参考颗粒的信号；分析所测信号以获得目标颗粒的信号信息和参考颗粒的信号信息；通过使用参考颗粒的信号信息修正目标颗粒的信号信息来确定目标颗粒的尺寸信息。在各种实施例中，该方法还包括将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息。在一些实施例中，分析仪执行这些步骤中的一个或多个(例如测量信号、分析被测信号和确定尺寸信息)。在某些实施例中，该分析仪配置用于接收卡盒，并且该方法进一步包括接收卡盒到分析仪中。

在各种实施例中，本公开提供了确定目标颗粒尺寸信息的方法。所述方法包括:接收卡盒进入分析仪；使用分析仪测量卡盒中来自于目标颗粒和参考颗粒的信号；分析所测信号以获得目标颗粒的信号信息和参考颗粒的信号信息；利用参考颗粒的信号信息修正目标颗粒的信号信息，来确定目标颗粒的尺寸信息。在各种实施例中，该方法还包括将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息。

在各种实施例中，本公开提供了用于确定目标颗粒尺寸信息的设备。该设备包括:卡盒和分析仪。分析仪配置用于:接收卡盒进入分析仪；测量卡盒来自于目标颗粒和参考颗粒的信号，分析所测量的信号以获得目标颗粒的信号信息和参考颗粒的信号信息；利用参考颗粒的信号信息修正目标颗粒的信号信息来确定目标颗粒的尺寸信息。在各种实施例中，分析仪进一步配置用于将目标颗粒的信号信息区分与参考颗粒的信号信息。在一些实施例中，分析仪还配置用于测量两种或两种以上类型的信号以将目标颗粒信号信息区分于参考颗粒的信号信息。

在各种实施例中，卡盒包括配置用于目标颗粒和参考颗粒流经的流动室。在各种实施例中，当目标颗粒和参考颗粒流经卡盒中的流动室时，测量来自于目标颗粒和参考颗粒的信号。在各种实施例中，卡盒配置以形成目标颗粒和参考颗粒的样品混合物。

在各种实施例中，卡盒包括参考颗粒，并配置以形成目标颗粒和参考颗粒的样品混合物。在各种实施例中，卡盒包括多个参考颗粒。在各种实施例中，该卡盒包括两种或更多种类型的参考颗粒。例如，与简单具有一个尺寸、一种荧光强度和一种荧光团相比，参考颗粒可具有各种尺寸、各种荧光强度和各种荧光团。

在各种实施例中，卡盒还包括表面活性剂，并配置以形成目标颗粒、参考颗粒和表面活性剂的样品混合物。在各种实施例中，卡盒还包括荧光染料，并配置以形成目标颗粒、参考颗粒和荧光染料的样品混合物。

在各种实施例中，卡盒还包括配置以标记目标颗粒的荧光染料或表面活性剂。卡盒配置以形成:(a)目标颗粒、参考颗粒和荧光染料的样品混合物，或(b)目标颗粒、参考颗粒和表面活性剂的样品混合物。

在各种实施例中，在目标颗粒和参考形成样品混合物之后测量来自于目标颗粒和参考颗粒的信号。在各种实施例中，在目标颗粒和参考颗粒和表面活性剂形成样品混合物后测量来自于目标颗粒和参考颗粒的信号。

在各种实施例中，在目标颗粒和参考颗粒形成样品混合物后测量来自于目标颗粒和参考颗粒的信号。在各种实施例中，在目标颗粒、参考颗粒和荧光染料形成样品混合物后，测量来自于目标颗粒和参考颗粒的信号。测量来自目标颗粒的信号包括荧光强度信号。

在各种实施例中，所测信号包括光信号、电信号、声信号或磁信号、或其组合。在各种实施例中，光信号包括前向散射信号、或荧光信号、或其组合。在一些实施例中，测量两种或更多种类型的信号以将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息。

在各种实施例中，所获得的信号信息包括峰高、峰宽、峰面积、平均峰高、平均峰宽、平均峰面积、峰高分布、峰宽分布、或峰面积分布、或其组合。

在各种实施例中，所确定的尺寸信息包括颗粒直径、颗粒体积、平均颗粒直径、平均颗粒体积、颗粒直径的分布、或颗粒体积的分布、或其组合。

在各种实施例中，参考颗粒具有已知的尺寸。

在各种实施例中，目标颗粒是血细胞。在各种实施例中，确定的尺寸信息包括选自列表中的至少一项:平均微粒体积(MCV)、红细胞分布宽度(RDW)、红细胞压积(HCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)，以及包括血细胞样品的血小板压积。

图1示出了确定颗粒尺寸信息的方法的非限制性示例。首先在步骤S101中，测量来自于具有颗粒的样品的信号。再者在步骤S102中，分析该信号以获得颗粒的信号信息。其三在步骤S103中，将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息。其四在步骤S104中，利用参考颗粒的信号信息修正目标颗粒的信号信息以确定目标颗粒的尺寸信息。

图2A示出了用于确定颗粒尺寸信息的设备的非限制性示例。该设备可包括卡盒200和分析仪201。分析仪201接收卡盒，测量卡盒内来自于颗粒的信号、分析信号以获得信号信息、并利用信号信息确定颗粒的尺寸信息。在本例中，分析仪201具有如图2B所示三个模块。接收模块202接收卡盒200到分析仪201中。侦测模块203侦测卡盒200中的来自于颗粒的信号。分析模块204分析由侦测模块203侦测到的信号以获得信号信息，将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息，并确定目标颗粒的尺寸信息。

图3A示出如何测量卡盒中来自于颗粒的信号的非限制性示例。该卡盒包括流动室，其中该流动室的部分由来自于分析仪的入射光束照射。当具有颗粒的样品流经流动室的被照射区域时，分析仪的侦测模块测量包含通过颗粒尺寸信息的光信号。该被测信号发送至分析仪的分析模块。当颗粒流经照射区域时，可在测量信号中侦测到峰。当多个颗粒流经照射区域时，测量信号中可以侦测到多个峰值。可用于确定尺寸信息的光学信号的非限制示例可能包括前向散射光、侧向散射光和荧光等。如一例，当使用正向散射光时，较大的颗粒比较小的颗粒散射更多的入射光，并产生更高强度的的信号峰。如另一例，当使用荧光时，较大的颗粒比较小的颗粒含有更多的发出荧光的荧光团并产生更高强度的信号峰。可用于确定尺寸信息的各种其他类型的信号可包括但不限于电信号(如阻抗)、声信号和磁信号等。

图3B示出了如何分析被测信号并从被测信号中获得信号信息的非限制性示例。峰数N(本例中，N＝1)和峰高h可获取为通过颗粒的信号信息。还可以获得的其他信号信息可能包括但不限于峰的面积大小、峰的宽度和半高宽等。

图4A-4C示出了如何测量信号、分析信号以获得信号信息、以及将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息的非限制性实施例。用于接收样品的卡盒可以包括流动室，并且当卡盒放置在分析仪中时，流动室的一部分被来自分析仪的入射光束照射。当具有颗粒的样品通过流动室的被照射区域时，分析仪中的侦测模块测量前向散射信号(图4A)。该前向散射信号发送到分析仪的分析模块。每个通过流动室被照射区域的颗粒对应于前向散射信号的峰值。前向散射峰数N和每个前向散射峰高(h_i,i＝1,2,3,…,N)可以获得为通过颗粒的信号信息(图4B)。为了将参考颗粒的信号信息区分于目标颗粒的信号信息，可获取前向散射峰的频率对于前向散射峰高的直方图(图4C)。可通过设置峰高的阈值来将直方图中的两个族群彼此区分。由于本例中的参考颗粒的尺寸小于目标颗粒的尺寸，峰高小于阈值的族群识别为参考颗粒。该族群中的峰数N_r每个峰高度(h_r(j),j＝1,2,3,…,N_r)可以获取为参考颗粒的信号信息。此外，诸如参考颗粒平均前向散射(FS)峰高h_r(avg)的信号信息可以按照如下的等式(1)来计算。

同时，峰高大于阈值的族群识别为目标颗粒。该族群中的峰数Nt和每个峰高(h_t(k),k＝1,2,3,…,N_t)可获取为目标颗粒的信号信息。类似地，目标颗粒前向散射(FS)平均峰高h_t(avg)可由以下等式(2)计算。

图5A-5C显示了如何测量信号、分析信号以获得信号信息、以及将目标颗粒的信号信息区分于参考颗粒的信号信息的另一个非限制性示例。用于接收样品的卡盒可包括流动室，并且当卡盒被放置在分析仪中时，流动室的一部分被来自分析仪的入射光束照射。当具有颗粒的样品通过流动室的被照射区域时，分析仪中的侦测模块同时测量前向散射信号(FS)和荧光(FL)信号(图5A)。所测得的前向散射信号(FS)和测得的荧光信号(FL)都发送到分析仪中的分析模块。每对前向散射(FS)信号中的峰和荧光(FL)信号中的峰对应于通过流动室被照射区域的颗粒，前向散射(FS)信号中的前向散射(FS)峰数N_FS和每个前向散射(FS)峰高(h_i,i＝1,2,3,…,N_FS)可以获取为前向散射信号(FS)信息，荧光(FL)信号中的荧光(FL)峰数N_FL和每个荧光(FL)峰的高度(l_i,i＝1,2,3,…,N_FL,N_FL＝N_FS)可以获取为荧光信号信息(图5B)。可以获得测量颗粒的荧光(FL)峰高l_i对于前向散射(FS)峰高h_i的散点图(图5C)。在本例中，可以通过在该散点图中设置荧光(FL)峰高的阈值来区分两个族群，荧光((FL)峰高大于阈值的族群来自于参考颗粒，因为在本例中参考颗粒具有比目标颗粒更高的荧光(FL)强度。该群体中的前向散射(FS)峰数N_r和每个前向散射(FS)峰高(h_r(j),j＝1,2,3,…,N_r)可获取为参考颗粒的光前向散射信号信息。另外，参考颗粒的平均前向散射(FS)峰高h_r(avg)可以通过上述等式(1)获得。同时，荧光(FL)峰高小于阈值的另一个族群来自于目标颗粒。该族群中前向散射(FS)峰数N_t和每个前向散射(FS)峰高(h_t(k),k＝1,2,3,…,N_t)可获取为目标颗粒的前向散射(FS)信号信息。类似地，目标颗粒的平均前向散射(FS)峰高h_t(avg)可以通过上述等式(2)获得。

图6A-6B示出确定目标颗粒直径D_t的方法的一些非限制性示例。在图6A中，目标颗粒和参考颗粒流经流动室并被入射光束照射，在本例中，入射光束与流动室的中心对齐。测量和分析前向散射(FS)信号以获得目标颗粒的前向散射(FS)峰高h_t和参考颗粒的前向散射(FS)峰高h_r，目标颗粒的直径D_t可以通过示于下面等式(3)的参考颗粒的h_r修正目标颗粒的h_t来确定，其中Dr是参考颗粒的已知直径。

在图6B中，目标颗粒和参考颗粒通过流动室并被入射光束照射。在本例中，入射光束与流动室的中心错位。测量和分析前向散射(FS)信号以获得目标颗粒的前向散射(FS)峰高h_t’和参考颗粒的前向散射(FS)峰高h_r’。本例中的目标颗粒的直径D_t’可以通过示于等式(4)的参考颗粒的h_r’修正目标颗粒的h_t’来确定，其中D_r是参考颗粒的已知直径。

图6B中所测得的h_t’可能与图6A中所测得的h_t不同，因为图6B中的入射光束与流动室的中心错位。例如，当入射光束在光束中心具有较高的强度而在光束边缘具有较低的强度时，图6B中所测得的h_t’小于图6A中所测得的h_t。当前向散射(FS)峰高用于确定目标颗粒的直径而不使用本公开中所述的参考颗粒时，h_t’和h_t之间的差异可能导致相同目标颗粒直径的测量结果不一致。当卡盒被接收进入到分析仪中时，可能会频繁发生错位并因此导致测量不一致。可以使用本公开所述的方法来减少或避免这种不一致性。例如，当图6A和图6B的修正如下列等式(5)中所示相同时，所确定的直径D_t可能等于D_t’。这可以通过使参考颗粒和目标颗粒通过流动室的相同位置来实现。

图7A–7D示出确定多个目标颗粒的平均尺寸或体积的方法的一些非限制性示例V_t(avg)。在图7A中，当多个目标颗粒和参考颗粒通过用入射光束照射的流动室时，所有颗粒对齐于流动室的中心。测量和分析前向散射(FS)信号，并且前向散射(FS)峰数N和每个前向散射信号(FS)峰高(h_i,i＝1,2,3,…,N)可获取为通过颗粒的信号信息。可以获得前向散射(FS)峰频率对于前向散射(FS)峰高的直方图(图7B)。可通过在直方图中设置前向散射信号(FS)峰高阈值来区分两个族群。峰高小于阈值的族群被识别为参考颗粒，并且峰数N_r和每个峰高(h_r(j),j＝1,2,3,…,N_r)可获取为参考颗粒的信号信息。参考颗粒的平均前向散射(FS)峰高h_r(avg)可通过等式(1)获得。同时，将峰高大于阈值的另一族群识别为目标颗粒，并且其峰数N_t和每个峰高(h_t(k),k＝1,2,3,…,N_t)可获取为目标颗粒的信号信息。目标颗粒的平均前向散射(FS)峰高h_t(avg)可通过等式(2)获得。因此，目标颗粒的平均体积V_t(avg)可以通过如下面等式(6)中所示的用h_r(avg)修正h_t(avg)来确定，其中V_r(avg)是参考颗粒的已知平均体积。

当流动室具有大于颗粒尺寸的横截面尺寸或没有鞘流聚焦颗粒时，难以保持所有颗粒对齐于流动室中心。相反，颗粒将在不同位置通过流动室。如图7C所示，当目标颗粒和参考颗粒在通过流动室各个位置时，测量前向散射(FS)信号，并且前向散射信号(FS)峰数N和每个前向散射(FS)峰高(h_i’,i＝1,2,3,…,N)可获取为信号信息。可以获得峰频率对于前向散射(FS)峰高的直方图(图7D)，并且通过设置前向散射信号(FS)峰高的阈值来区分两个族群。峰高小于阈值的族群被识别为参考颗粒，并且峰数N_r’和每个峰高(h_r(j)’,j＝1,2,3,…,N_r’)可获取为参考颗粒的信号信息，参考颗粒的平均前向散射(FS)h_r(avg)’峰高可通过等式(1)获得，同时，峰高大于阈值的另一族群被识别为目标颗粒，并且该族群中的峰数N_t’和每个峰高(h_t(k)’,k＝1,2,3,…,N_t’)可获取为目标颗粒的信号信息。目标颗粒的平均前向散射(FS)峰高h_t(avg)’可通过等式(2)获得。由此，目标颗粒的平均体积V_t(avg)’可以通过如下面等式(7)中所示的h_r(avg)’修正h_t(avg)’来确定，其中V_r(avg)是参考颗粒的已知平均体积。

当并非所有颗粒都对齐于流动室的中心或入射光束具有不均匀强度(例如，光束中心附近的强度较高，边缘附近的强度较低)时，图7D中测量的h_t(avg)’可能不同于图7B中测量的h_t(avg)，当平均前向散射(FS)峰高用于确定目标颗粒的平均体积而不使用本公开所述的参考颗粒时，h_t(avg)或h_t(avg)’之间的差异可能导致相同目标颗粒平均体积的测量不一致，当流动室的具有大于颗粒的横截面尺寸或没有鞘流聚焦颗粒时，这种错位可能会频繁发生，并导致测量不一致。可以使用本公开所述的方法来减少或避免这种不一致性。例如，确定的体积V_t(avg)可以等于V_t(avg)’，如以下等式(8)所示。这可以通过使多个参考颗粒和目标颗粒通过流动室来实现。

当存在多个颗粒时，其通过不同位置的概率可由流速分布确定，对于参考颗粒和目标颗粒，流速分布可能相同。

除了上面讨论的峰高和平均峰高外，各种其他类型的信号信息(例如，峰宽、峰面积、峰高分布和峰高分布宽度)也可用于修正，以确定目标颗粒的尺寸信息。例如，如图7B所示，参考颗粒族群的前向散射(FS)峰高分布为F_r(x)，且目标颗粒族群的前向散射(FS)峰高分布为F_t(x)。目标颗粒的直径分布G_t(x)可通过使用F_r(x)校正F_t(x)来确定，如以下等式(9)所示，其中符号Deconv{}表示去卷积的数学运算。也可使用包括但不限于傅里叶变换的其它方法计算去卷积结果。

G_t(x)＝Deconv{F_t(x),F_r(x)} (9)

类似地，如图7D所示，参考颗粒族群的前向散射(FS)峰高分布为F_r’(x)，目标颗粒族群的前向散射(FS)峰高分布为F_t’(x)。目标颗粒的直径分布G_t’(x)可通过使用F_r’(x)修正F_t(x)来确定，如以下面等式(10)所示。

G_t′(x)＝Deconv{F_t′(x),F_r′(x)} (10)

与上述讨论类似，当存在多个目标颗粒和参考颗粒以确保满足以下等式(11)的要求时，确定的目标颗粒直径分布相等，如以下等式(12)所示。

G_t′ (x)＝G_t(x) (12)

这意味着使用描述于此的方法，对于相同目标颗粒在不同场景下的确定的直径分布是一致的。

图8示出了确定血细胞尺寸信息的方法。首先，在S801中，卡盒接收具有血细胞的样本，并将卡盒放置在如图2所述的分析仪中。其次在S802中，分析仪测量来自于卡盒中血细胞和参考颗粒的信号。第三步在S803中，对信号进行分析以获得信号信息。第四步在S804中，将血细胞的信号信息区分于参考颗粒的信号信息。第五步在S805中，可以通过用参考颗粒的信号信息修正血细胞的信号信息来确定血细胞的大小信息。确定的尺寸信息的示例可包括但不限于红细胞(RBC)的尺寸、多个红细胞(RBC)的平均尺寸(即平均红细胞体积(MCV))、多个红细胞(RBC)的尺寸分布(即红细胞分布宽度(RDW))、血液中红细胞(RBC)的体积百分比(即红细胞压积HCT)、多个血小板的平均体积(即平均血小板体积(MPV))、血液中血小板(PLT)体积百分比(即血小板压积)等。

图9A示出了描述于此的流控卡盒的非限制性示例。所述流控卡盒可包括：配置用于接收样品的第一腔室901，通过流体导管903与第一腔室901流体连接的流动室902，以及通过流体导管905与流动室902流体连接的第二腔室904.接收到第一腔室901的样品可离开第一腔室901并进入流动室902以被入射光束照射。分析仪可测量和分析来自流动室中样品的信号。流出流动室902的样品可收集于第二腔室904中。可施加气动压力到第一腔室901，以驱动样品进入流动室902进行信号测量。作为气动压力的替代，可以使用各种其他类型的驱动机构，这些驱动机构的非限制性示例可包括但不限于重力、毛细管力、电泳和离心力等。在本例中，具有目标颗粒(例如血细胞)和参考颗粒的样品可接收进入第一个腔室901。

图9B示出了描述于此的流控卡盒的另一个非限制性示例。在本例中，第一腔室901包含参考颗粒906(例如：微珠)。具有目标颗粒(例如血细胞)的样品可接收进入到第一腔室901中并与参考颗粒906混合以形成样品混合物。然后在流动室902中测量该样品混合物。

图9C示出描述于此流控卡盒的另一个非限制性示例。在本例中，第一腔室901包含具有参考颗粒(例如：微珠)的试剂907。首先，可在流动室902中测量具有参考颗粒的试剂907并将其收集到第二腔室904中。其次，具有目标颗粒的样品(例如：血细胞)可接收进入到第一腔室901中，然后测量于流动室902中。测量来自于具有参考颗粒的试剂907的信号，并测量来自于具有目标颗粒(例如：血细胞)的样品的另一信号。

图9D示出描述于此的流控卡盒的另一个非限制性示例。在本例中，第一腔室901包含具有参考颗粒(例如：微珠)试剂908和表面活性剂。表面活性剂的示例可包括但不限于十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基硫酸钠等。

图10A–10C示出了确定血细胞尺寸信息的方法的非限制性示例。在本例中，血细胞为红细胞(RBC)，参考颗粒为微珠。首先，如图9B所述，具有多个红细胞(RBC)的样品接收进入到流控卡盒中，并与流控卡盒中的微珠形成样品混合物。流控卡盒放置于分析仪中。当包括红细胞(RBC)和微珠的样品混合物流通过流动室时，分析仪同时测量前向散射(FS)和荧光(FL)信号(图10A)。每对前向散射(FS)峰和荧光(FL)峰代表在样品混合物流中侦测到的红细胞(RBC)或微珠。前向散射(FS)峰数N_FS和每个前向散射(FS)峰高(h_i,i＝1,2,3,…,N_FS)可获取为该前向散射(FS)信号的信号信息。荧光(FL)峰数N_FL和每个荧光(FL)峰高(l_i,i＝1,2,3,…,N_FL,N_FL＝N_FS)可获取为该荧光(FL)信号的信号信息。可以获得荧光(FL)峰高l_i对于前向散射(FS)峰高h_i的散点图(图10B)。通过在散点图中设置荧光(FL)峰高的阈值使得两个族群可以相互区分。荧光(FL)峰高大于阈值的族群来自微珠。这是通过使用微珠的荧光强度比红细胞强加以实现的。该族群中前向散射(FS)峰数N_bead和每个前向散射信号峰高(h_bead(j),j＝1,2,3,…N_bead)可获取为微珠的前向散射(FS)信号信息。此外，可根据以下等式(13)计算微珠的平均前向散射(FS)峰高h_bead(avg)。

同时，另一个荧光(FL)峰高小于阈值的族群是红细胞(RBC)。该族群中前向散射(FS)峰数N_RBC和每个前向散射(FS)峰高(h_RBC(k),k＝1,2,3,…,N_RBC)可获取为红细胞(RBC)的前向散射(FS)信号信息。类似地，可根据以下等式(14)计算红细胞的平均前向散射(FS)峰高h_RBC(avg)。

样品的平均红细胞体积(MCV)可通过以下所示等式(15)使用h_bead(avg)来修正h_RBC(avg)来计算，其中a是平均红细胞体积(MCV)预定校正曲线1已知常数(图10C)。

此外，样品的红细胞压积HCT可按以下等式(16)所示来确定，其中Vs是接收到流控卡盒中的样品的已知体积。

图11A–11C示出确定血细胞尺寸信息的方法的另一个非限制性示例。在本例中，血细胞为血小板(PLT)且参考颗粒为微珠。首先，如图9B所述，将具有多个血小板(PLT)的样品接收到流控卡盒中，并与流控卡盒中的微珠形成样品混合物。流控卡盒放置在分析仪中。当包括血小板(PLT)和微珠的样品混合物流通过流动室时，分析仪同时测量前向散射(FS)和荧光(FL)信号(图11A)。每对前向散射信号峰和荧光峰代表样品混合物流中的血小板或微珠。前向散射(FS)峰数N_FS和每个前向散射(FS)峰高(h_i,i＝1,2,3,…,N_FS)可获取为该前向散射(FS)信号的信号信息。荧光(FL)峰的数目N_FL和每个荧光(FL)峰高(l_i,i＝1,2,3,…,N_FL,N_FL＝N_FS)可获取为该荧光(FL)信号的信号信息。可以获得荧光(FL)峰高l_i和前向散射(FS)峰高h_i的散点图(图11B)。通过在散点图中设置荧光(FL)峰高阈值，可以区分两个族群。荧光(FL)峰高大于阈值的族群来自微珠，因为用于流控卡盒中的微珠具有比血小板(PLT)更高的荧光强度。该族群中前向散射(FS)峰数N_bead和每个前向散射(FS)峰高(h_bead(j),j＝1,2,3,…,N_bead)可获取为微珠的前向散射(FS)信息。此外，可通过等式(13)获得微珠的平均前向散射(FS)峰高h_bead(avg)。同时，荧光(FL)峰高小于阈值的其他族群来自血小板(PLT)。该族群中前向散射(FS)峰数N_PLT和每个前向散射(FS)峰高(h_PLT(k),k＝1,2,3,…,N_PLT)可获取为血小板的前向散射(FS)信号信息。类似地，可根据以下等式(17)计算血小板(PLTs)平均前向散射峰高h_PLT(avg)。

样品的平均血小板压积(MPV)可以根据以下等式(18)通过h_bead修正h_PLT(avg)来计算，其中b是平均血小板压积(MPV)预定校正曲线2已知常数(图11C)。

此外，利用进入流控卡盒的样品的已知体积Vs，可由以下等式(19)确定样品的血小板压积(Plateletcrit)

图12A–12B示出确定血细胞尺寸信息的方法的再一个非限制性示例。在本例中，血细胞为红细胞(RBCs)和血小板(PLTs)，而参考颗粒为微珠。首先，如图9B所示，具有多个红细胞和血小板的样品接收进入到流控卡盒中，并与流控卡盒中的微珠形成样品混合物。流控卡盒放置在分析仪中。当具有红细胞(RBC)、血小板(PLT)和微珠的样品混合物流通过流动室时，分析仪同时测量前向散射(FS)信号和荧光(FL)信号(图12A)。每对前向散射(FS)峰和荧光(FL)峰对应于样品混合物流中的红细胞、血小板或微珠。前向散射(FS)峰数N_FS和每个前向散射(FS)峰高(h_(i),i＝1,2,3,…,N_FS)作为信号信息。荧光(FL)峰数N_FL和每个荧光(FL)峰高(l_(i),i＝1,2,3,…,N_FL)可获取为信号信息。可以获得荧光(FL)峰高l_(i)和前向散射(FS)峰高h_(i)的散点图(图12B)。通过在散点图中设置前向散射(FS)峰高阈值1和荧光(FL)峰高阈值2，可以将三个族群彼此区分开来。前向散射(FS)峰高大于阈值1且荧光(FL)峰高小于阈值2的族群来自红细胞(RBC)。前向散射(FS)峰高小于阈值1的族群来自血小板(PLT)。前向散射(FS)峰高大于阈值1且荧光(FL)峰高大于阈值2的族群来自微珠。这种分离是通过使用尺寸大于血小板而荧光强度大于红细胞的微珠实现的。红细胞族群中前向散射(FS)峰数N_RBC和每个前向散射(FS)峰高(h_RBC(j)j＝1,2,3,…,N_RBC)可获取为红细胞(RBC)的前向散射(FS)信号信息。此外，可通过等式(14)获得红细胞(RBC)的平均前向散射(FS)峰高h_RBC(avg)。血小板(PLT)族群中前向散射(FS)峰数N_PLT和每个前向散射(FS)峰高(h_PLT(k),k＝1,2,3,…,N_PLT)可获取为血小板(PLT)的前向散射(FS)信号信息。此外，可通过等式(17)获得微珠的平均前向散射(FS)峰高h_PLT(avg)，微珠族群中前向散射(FS)峰数N_bead和每个前向散射信号峰高(h_bead(m),m＝1,2,3,…,N_bead)可获取为微珠的前向散射(FS)信息。此外，可通过等式(13)获得微珠的平均前向散射(FS)峰高h_bead(avg)。因此，可使用等式(15)确定样品的平均红细胞体积(MCV)，且可使用等式(16)确定样品的红细胞压积(HCT)。同时，可使用等式(18)确定样品的平均血小板压积(MPV)，且可使用等式(19)确定样品的血小板压积。

图13A–13B示出确定血细胞尺寸信息的方法的又再一个非限制性示例。在本例中，血细胞为红细胞(RBC)和血小板(PLT)，而参考颗粒为微珠。首先，如图9D所示，具有多个红细胞(RBC)和血小板(PLT)的样品接收进入到流控卡盒中，并与流控卡盒中的微珠和表面活性剂形成样品混合物。表面活性剂用于两个目的。首先，它有助于防止微珠在流控卡盒中储存和在流动室中测量期间聚集。第二，它将红细胞(RBC)从双凹面形状变为球形，且因此在流动室中测量球形红细胞(RBC)(图13A)。将流控卡盒放置在分析仪中。当具有红细胞(RBC)、血小板(PLT)和微珠的样品混合物流通过流动室时，分析仪同时测量前向散射(FS)信号和荧光(FL)信号。每对前向散射(FS)峰和荧光(FL)峰对应于样品混合物流中的红细胞(RBC)、血小板(PLT)或微珠。前向散射信号(FS)峰数N_FS和每个前向散射(FS)峰高(h_(i),i＝1,2,3,…,N_FS)可获取为前向散射(FS)信号信息。荧光(FL)峰数N_FL和每个荧光(FL)峰高(l_(i),i＝1,2,3,…,N_FL)可获取为荧光(FL)信号信息。可以获得荧光(FL)峰高l(i)和前向散射(FS)峰高h(i)的散点图(图13B)。

为了比较，可不使用表面活性剂获得来自于从相同样品中的另一散点图(图13C)。在图13C中而不是在图13B中的微珠颗粒族群群有旁瓣，该旁瓣是由于没有表面活性剂的微珠聚集引起的。此外，图13B中来自于球形红细胞(RBC)的前向散射(FS)信号具有比图13C中来自于双面凹的红细胞(RBC)的前向散射(FS)信号更大前向散射(FS)峰高，因此，图13B中阈值2可以实现比图13C中的阈值3更清晰的红细胞(RBC)与微珠的分离。此外，球形红细胞(RBC)的前向散射(FS)峰高具有比双凹面红细胞(RBC)的前向散射信号(FS)峰高更窄的分布，在确定诸如平均红细胞体积(MCV)和红细胞压积(HCT)等的血细胞尺寸信息时，可获得更准确的红细胞信号(RBC)信息。

表1示出了使用或不使用本公开所述方法测量的血细胞尺寸信息的比较。对含有红细胞(RBC)的样品进行三次重复测量。平均红细胞体积(MCV)和红细胞压积(HCT)遵循图10A-10C中所示的示例确定。如表1所示，计算三个重复测量的变异系数(CV)。使用公开的方法，红细胞压积(HCT)测量的变异系数(CV)从9.3％降至0.9％。使用所公开的方法，平均红细胞体积(MCV)测量的变异系数CV从5.1％降至1.5％。这些结果表明，可以使用本公开所述的方法更准确地确定血细胞的尺寸信息。

表1

图14A–14B示出了确定血细胞尺寸信息的方法的另一个示例。在本例中，血细胞为白细胞(WBC)，而参考颗粒为微珠。首先，如图9C所示，具有多个白细胞(WBC)的样品接收进入到流控卡盒中。样品接收进入到包含具有微珠的试剂907以及荧光染料的腔室901中，荧光染料用于通过与绑定核酸来选择性标记白细胞(WBC)。荧光染料的示例可包括但不限于吖啶橙、碱性橙21等。然后将流控卡盒放入分析仪中。分析仪提供一种启动方法，以驱动卡盒中的流体传输。使用该驱动方法，接收到的样品和试剂907在腔室901中形成样品混合物。样品混合物在流动室902中进一步传输和测量，流动室902可以是无鞘流流动室，其中前向(FS)信号和荧光(FL)信号由分析仪同时测量(图14A)。

在图14A中，每对前向散射(FS)峰和荧光(FL)峰对应于样品混合流中的白细胞(WBC)或微珠。与图13B中的示例类似，可通过设置前向散射信号阈值、荧光(FL)阈值或其前向散射(FS)与荧光(FL)的组合来区分微珠族群与白细胞(WBC)族群。同时，可由不同水平的前向散射(FS)和荧光(FL)将白细胞(WBC)区分为包括淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的亚族群。微珠的平均前向散射(FS)和荧光(FL)峰高FS_bead(avg)和FL_bead(avg)可获得于测量信号。微珠的该信号信息随后可用于修正血细胞的尺寸信息。例如，单核细胞亚族群的平均前向散射(FS)和荧光(FL)峰高FS_MON(avg)和FL_MON(avg)可根据以下等式(20)和(21)进行修正。

在上述等式(20)和(21)中，FS’_MON(avg)和FL’_MON(avg)是单核细胞亚族群的修正峰高。FS’_MON(avg)可用于单核细胞尺寸的定量测量，因为前向光散射(FS)强度与细胞尺寸成正比。FL’_MON(avg)也可用于单核细胞尺寸的定量测量。

(Susan A.Moore,Cell size specific binding of the fluorescentdyecalcofluor to budding yeast,Biochimica at BiophysicaActa,Vol.1035,

1990,Pages 206-213).

对于如图14B所示另一个例子，单核细胞亚族群在前向散射(FS)和荧光(FL)峰高的分布宽度、FS_MON(width)和FL_MON(width可根据以下等式(22)和(23)进行修正

在上述等式(22)和(23)中，FS’_MON(width)和FL’_MON(width)是单核细胞亚族群在前向散射(FS)和荧光(FL)峰高中的修正分布宽度。类似地，它们可以用作单核细胞的尺寸测量，例如单核细胞的单核细胞分布宽度(MDW)。

诸如单核细胞的平均尺寸和单核细胞分布宽度(MDW)的单核细胞的尺寸测量，已显示出微有用的临床生物标记物(美国专利申请：US2019/0324035A1)。然而，测量对分析仪的性能漂移非常敏感，例如单核细胞测量中激光光斑和流动室之间的对准漂移。因此，需要定期经常进行系统校准以保持测量精度。通过使用诸如微珠的参考颗粒测量来修正单核细胞的测量值，可以避免系统校准的负担，并使在诸如医院急诊室的及时诊疗场所测量这种临床生物标记物成为可能。

在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所示的各种部件以及未示出的部件进行多种不同的布置。描述本发明的实施例的意图是说明性的而不是限制性的。对于本领域技术人员来说，不偏离其范围的替代实施例将变得显而易见。本领域技术人员可在不脱离本发明范围的情况下开发实施上述改进的替代方法。应当理解，某些特征和子组合是实用的，可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用，并且在权利要求的范围内考虑。除非另有说明，否则不需要按照所述的特定顺序执行各种图中列出的所有步骤。