一种两色金鸡菊的新用途及分析方法
阅读说明：本技术 一种两色金鸡菊的新用途及分析方法 (New application and analysis method of coreopsis bicolor ) 是由 陈晓鹏 刘静 李春霞 何巧玉 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了两色金鸡菊在制备肠道菌群调节药物方面的新用途,分析方法通过建立动物糖尿病模型,引入高通量测序技术,为后期研究两色金鸡菊治疗糖尿病的作用机制拓展新的方向和思路。(The invention provides a new application of coreopsis bicolor in preparing intestinal flora regulating drugs, and an analysis method develops a new direction and thought for later-stage research on an action mechanism of coreopsis bicolor for treating diabetes by establishing an animal diabetes model and introducing a high-throughput sequencing technology.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种两色金鸡菊的新用途及分析方法。
背景技术
两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又名昆仑雪菊，为菊科金鸡菊属植物的干燥头状花序，始载于《新华本草纲要》，味甘，性平，归大肠经，具有清热解毒、活血化瘀等的功效，可治疗燥热烦渴、高血压、高血糖、心慌、胃肠不适等症状。两色金鸡菊作为新疆地区临床应用广泛的维吾尔族民族药，其药用价值正在被逐渐发现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种两色金鸡菊的新用途。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法。
本发明采用的技术方案是：
两色金鸡菊在制备肠道菌群调节药物方面的新用途。
优选的，上述两色金鸡菊的新用途，所述肠道菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、密螺旋体属(Treponema)和/或未明确瘤胃菌属(unidentified-Ruminococcaceae)。
优选的，上述两色金鸡菊的新用途，所述两色金鸡菊是由下述方法制备得到的：精密称量两色金鸡菊样品50～100g于2L烧杯中，倒入1～2L沸水，盖上锡箔纸，冲泡25～35min，将茶汤滤出，继续加1～2L沸水冲泡25～35min，模拟茶叶冲泡过程，滤出茶汤，合并两次茶汤，摇匀，滤液经减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏。
优选的，上述两色金鸡菊的新用途，所述两色金鸡菊是由下述方法制备得到的：精密称量两色金鸡菊样品60～100g于2L烧杯中，倒入1.5～2L沸水，盖上锡箔纸，冲泡30～35min，将茶汤滤出，继续加1.5～2L沸水冲泡30～35min，模拟茶叶冲泡过程，滤出茶汤，合并两次茶汤，摇匀，滤液经减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏。
优选的，上述两色金鸡菊的新用途，所述减压条件为温度50～55℃，真空度0.001Mpa至0.01Mpa。
一种用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，步骤如下：
(1)向动物模型中灌胃方式进行给药，收集动物粪便样本，提取DNA，以16S rDNA可变区引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行混样及纯化，之后构建文库，进行上机检测；
(2)对测序数据进行处理，作OUT聚类和物种注释，比较分析肠道菌群的alpha和beta多样性。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(1)采用CTAB或SDS方法对样本地基因组DNA进行提取。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(1)中使用带Barcode的特异引物进行PCR。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(1)中PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(1)中构建文库使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(2)中将步骤(1)获得的下机数据进行处理，根据Barcode序列和PCR扩增引物序列拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的reads进行拼接，得到原始数据，后经过严格的过滤处理得到高质量的数据。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(2)中OUT聚类利用Uparse算法对所有样本的高质量数据进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成OTUs。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(2)中对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA138的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息统计各样本的群落组成。
优选的，上述用于测定两色金鸡菊对肠道菌群影响的分析方法，所述步骤(2)中比较分析肠道菌群的alpha和beta多样性，其中发现乳杆菌属(Lactobacillus)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、密螺旋体属(Treponema)和未明确瘤胃菌属(unidentified-Ruminococcaceae)相对丰度变化显著。
本发明的有益效果是：
上述两色金鸡菊的新用途，为制备肠道菌群调节药物提供了新的思路。分析方法通过建立动物(大鼠)糖尿病模型，引入高通量测序技术，旨在探究两色金鸡菊对宿主肠道菌群的调节作用、评估其对肠道菌群组成结构和代谢产物的影响，以及糖尿病发病机制与肠道微生物间的联系，初步探讨两色金鸡菊抗糖尿病作用的可能机制，为后期研究两色金鸡菊治疗糖尿病的作用机制拓展新的方向和思路。
附图说明
图1为探究两色金鸡菊对糖尿病大鼠肠道菌群影响分析技术流程图。
图2为实施例1中样品Genus分类水平中物种丰度图。NC-正常组；Mod-模型组；Met-二甲双胍组；JH-两色金鸡菊高剂量组；JL-两色金鸡菊低剂量组。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
探究两色金鸡菊对糖尿病大鼠肠道菌群影响，方法如图1所示：
(1)两色金鸡菊浸膏的制备
精密称量两色金鸡菊样品80g于2L烧杯中，倒入2L沸水，盖上锡箔纸，冲泡30min，将茶汤滤出，继续加2L沸水冲泡30min，模拟茶叶冲泡过程，滤出茶汤，合并两次茶汤，摇匀，滤液在温度50℃，真空度0.005Mpa下减压回收纯水，浓缩至稠膏状，即得两色金鸡菊浸膏。
(2)糖尿病大鼠模型的建立
SD雄性大鼠，体重180-200g，高脂高糖饲料喂养4周以上，造成胰岛素抵抗，糖耐量检测合格后，尾静脉注射STZ(由pH4.5的柠檬酸缓冲液配制)诱导糖尿病，以空腹血糖高于16.7mmol/L为造模成功。
(3)动物分组、剂量设置及给药方法
将步骤(2)中造模成功的糖尿病大鼠随机分为以下4组：模型组、阳性对照组(250mg/kg)、两色金鸡菊低剂量组(1000mg/kg)、两色金鸡菊高剂量组(2000mg/kg)，加上正常对照组，共5组。两色金鸡菊组和阳性对照组分别采用两色金鸡菊浸膏的水溶液与二甲双胍水溶液进行灌胃，对照组和模型组的大鼠通过灌胃的方式给予相同体积的生理盐水，持续干预8周。
(4)血糖、血脂及胆固醇测定
给药前及给药期间每周测定1次血糖，监测各组血糖值、血脂值以及总胆固醇值，采血当天各组大鼠禁食(不禁水)12h，使用血糖仪测定大鼠血糖，使用迈瑞BS-240VET动物专用全自动生化仪测定总胆固醇和甘油三脂。与正常组相比，模型组总胆固醇水平升高，与模型组相比，两色金鸡菊低剂量组的总胆固醇水平表现出下降趋势，它的治疗作用表现出了显著性(p<0.05)。
(5)16s高通量测序
收集步骤(3)中各组动物粪便样本，采用CTAB或SDS方法对样本地基因组DNA进行提取，使用带Barcode的特异引物(515F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’/806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)以16S rDNA可变区引物进行PCR，用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标定量，根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，之后使用DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
(6)微生物多样性分析
对步骤(5)中得到的测序数据根据Barcode序列和PCR扩增引物序列拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH对每个样本的reads进行拼接，得到原始数据，后经过严格的过滤处理得到高质量的数据，利用Uparse算法对所有样本的高质量数据进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成OTUs对OTUs序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA138的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息统计各样本的群落组成。如图2所示，比较分析肠道菌群的alpha和beta多样性，其中发现乳杆菌属(Lactobacillus)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、密螺旋体属(Treponema)和未明确瘤胃菌属(unidentified-Ruminococcaceae)相对丰度变化显著。
其中，致病(2型糖尿病)使菌群中有益菌乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度显著降低，而有害菌琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、密螺旋体属(Treponema)和未明确瘤胃菌属(unidentified-Ruminococcaceae)相对丰度显著升高。且给予两色金鸡菊模拟茶饮得到的提取物能够使上述菌群回调，趋于正常。
以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。