一种尘螨致敏蛋白Der p 1的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种尘螨致敏蛋白Der p 1的分离纯化方法 (Separation and purification method of dust mite allergenic protein Der p 1 ) 是由 陈晴 何韶衡 张杨 张丹丹 张晓楠 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种尘螨致敏蛋白Der p 1的分离纯化方法,包括以下步骤：1)尘螨水溶蛋白粗提液的制备：取包含尘螨的灰尘样品,加入PBS-T溶液,在4℃下搅拌过夜,5000×g离心,取上清液；再向上清液中加入醋酸钠缓冲液,在4℃下透析3-4天,4℃保存待用；2)阳离子交换层析：将上述步骤1)所制备的尘螨水溶蛋白粗提液上样,使用结合缓冲液进行冲洗,随后固定结合缓冲液并利用洗脱缓冲液进行梯度洗脱,收集洗脱峰,获得目的产物。本方法具有快速、高效、生产稳定,成本低等特点；所制备的提取液或纯化蛋白可用于患者血清样品中主要致敏蛋白的检测,同时还可进一步制备重组过敏原,设计低过敏衍生物以及预防性疫苗方面具有广泛应用。(The invention discloses a separation and purification method of dust mite allergenic protein Der p 1, which comprises the following steps: 1) preparing a coarse extract of dust mite water-soluble protein: adding PBS-T solution into dust sample containing dust mite, stirring overnight at 4 deg.C, centrifuging at 5000 × g, and collecting supernatant; adding sodium acetate buffer solution into the supernatant, dialyzing at 4 deg.C for 3-4 days, and storing at 4 deg.C; 2) cation exchange chromatography: loading the crude extract of the dust mite water soluble protein prepared in the step 1), washing by using a binding buffer solution, fixing the binding buffer solution, performing gradient elution by using an elution buffer solution, and collecting an elution peak to obtain a target product. The method has the characteristics of high speed, high efficiency, stable production, low cost and the like; the prepared extracting solution or purified protein can be used for detecting main allergic protein in a serum sample of a patient, and meanwhile, the recombinant allergen can be further prepared, and the method has wide application in the aspects of designing hypoallergenic derivatives and preventing vaccines.)
技术领域
本发明涉及蛋白质的分离纯化技术领域，特别涉及一种尘螨致敏蛋白 Der p 1的分离纯化方法。
背景技术
过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎和食物过敏等，是临床上常见病、多发病。过敏是由机体对通常无害的大分子(如蛋白质)物质的免疫反应所引起的。尘螨是引起全世界过敏性疾病的主要原因之一。尘螨可导致过敏性哮喘、鼻炎等呼吸系统的过敏性疾病，2004年，世界卫生组织估计全球约有3亿哮喘和鼻炎患者，并呈上升趋势(Chen K W,Hypoallergenic Der p 1/Der p 2combination vaccines for immunotherapy of housedust mite allergy，2012)。在家庭内尘螨中Der p 1的含量大概为 0.02-14.30μg/g，Derp 1的氨基酸个数为320，是分子量为25kDa的糖蛋白，等电点4.7-7.4。在Der p 1的二级结构中，43.75％为α螺旋结构，作为木瓜蛋白酶家族成员，包含了组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和镁结合位点等活性位点，在与后期产生过敏反应的过程中起到关键作用。然而，为尘螨开发的特殊提取过程，包括长时间的提取过程，可能会导致糖蛋白降解和聚集。
因此，为了减少在主要过敏原水平上引入任何可能的人工制品的风险，本申请开发了一种快速的提取方法，从而得到一种主要的过敏原富集物，并制定了一种旨在获得适当数量的25kDa过敏原的分离纯化方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种尘螨致敏蛋白Der p 1的分离纯化方法，其解决了现有技术的上述问题。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种尘螨致敏蛋白Der p 1的分离纯化方法，包括以下步骤：
1)尘螨水溶蛋白粗提液的制备：取包含尘螨的灰尘样品，加入PBS-T 溶液，在4℃下搅拌过夜，5000×g离心，取上清液；再向上清液中加入醋酸钠缓冲液，在4℃下透析3-4天，4℃保存待用；
2)阳离子交换层析：将上述步骤1)所制备的尘螨水溶蛋白粗提液上样，使用结合缓冲液进行冲洗，随后固定结合缓冲液并利用洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰，获得目的产物。
优选地，还包括：
3)冻干：将步骤2)的目的产物进行冻干处理，获得尘螨致敏蛋白Der p 1纯品。
优选地，步骤1)中，包含尘螨的灰尘样品与PBS-T溶液的固液比为 1:(100-200)，单位为g/mL。
优选地，步骤2)中结合缓冲液为10～100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲液。
优选地，步骤2)中洗脱缓冲液为100～1000mM的NaCl溶液。
优选地，步骤2)具体为：
21)配制结合缓冲液和洗脱缓冲液，过滤后室温保存；
22)上样、洗脱和收集：先用20％乙醇清洗系统泵，然后将柱子连接到层析系统仪器上，再用结合缓冲液清洗样品泵，然后用2个柱体积结合缓冲液平衡柱子；通过样品泵上样，进样体积为1mL，进样5min后，用1 个柱体积结合缓冲液清洗柱子，再使用0-30％洗脱缓冲液对柱子进行梯度洗脱，冲洗10个柱体积，洗脱完成后，使用结合缓冲液平衡柱子，平衡5个柱体积。
优选地，所述结合缓冲液为10～100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲液，溶液配制后经0.2μm滤纸过滤，室温保存待用；所述洗脱缓冲液为100～1000mM NaCl溶液，溶液配制后经0.2μm滤纸过滤，室温保存待用。
优选地，还包括将步骤2)收集的洗脱峰通过SDS-PAGE鉴定Der p 1 蛋白。
一种根据上述的尘螨致敏蛋白Der p 1分离纯化方法制备得到的尘螨致敏蛋白Der p 1。
一种根据上述的尘螨致敏蛋白Der p 1分离纯化方法制备得到的尘螨致敏蛋白Der p 1在制备重组过敏原、低过敏衍生物以及预防性疫苗中的应用。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
(1)本发明提供的主要致敏蛋白的分离纯化方法，通过改良尘螨蛋白提取液成分，可以显著提高尘螨粗提液中主要致敏蛋白Der p 1的含量，然后通过阳离子交换层析对尘螨粗提液中目的蛋白进行分离纯化，获得纯度较高且数量适当的25kDa过敏原。
(2)目前临床中使用的过敏原体外检测方法-ImmonoCAP中并不包含Der p 1，本发明有助于将该蛋白的粗提液或纯化蛋白应用于制备重组过敏原、设计低过敏衍生物以及预防性疫苗接种，还有望开发新一代脱敏治疗候选药物。
附图说明
被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
图1为本申请的尘螨粗提液中主要蛋白质分布。其中，Lane 1：蛋白marker； Lane2：尘螨提取液。
图2为本申请的阳离子交换层析色谱结果。箭头所指为含目的蛋白的收集峰。
图3为本申请的阳离子交换层析SDS-PAGE结果。其中，M：蛋白marker； Lane 1是收集液I；Lane 2是收集液II；其中Lane 3是收集液III的SDS-PAGE 可见明显25kDa蛋白条带(即目的蛋白)；Lane 4是收集液IV；Lane 5是收集液V。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
实施例1
尘螨原料：包含尘螨的灰尘样品由锦州市锦州医科大学提供。
操作方法：本申请采用的常规操作方法详见《实验过敏反应学，何韶衡， 2010》。
(1)粗提液的制备：称量包含尘螨的灰尘样品0.10g，加入到20mL PBS-T 溶液中，4℃下搅拌过夜，5000×g离心尘螨混悬液20min取上清液，向其中加入10-100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液20mL后进行透析，在4℃下透析 3-4天。透析完成后，4℃保存。该方法提取的尘螨粗提液中主要蛋白分布如图 1。
通过采用PBS-T溶液对尘螨中的过敏原蛋白质进行粗提取，利用10-100 mM pH4.5的醋酸钠缓冲溶液对其进行透析，尘螨粗提液中目标过敏原蛋白质Der p 1含量最高(25.0kDa)，而其他蛋白质含量较少。
(2)阳离子交换层析：
21)溶液配制：
结合缓冲液：10～100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲液，0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
洗脱缓冲液：100～1000mM NaCl、0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
22)上样、洗脱和收集：首先用20％乙醇清洗系统泵，然后将HiTrap Capto MMC(1ml，GE Healthcare)柱子连接到AKTA pure仪器上，再用结合缓冲液清洗样品泵，然后用2个柱体积结合缓冲液平衡柱子。通过样品泵上样，进样体积为1mL，进样5min后，用1个柱体积结合缓冲液清洗柱子，然后使用 30％洗脱缓冲液对柱子进行梯度洗脱，冲洗10个柱体积，洗脱完成后，使用结合缓冲液平衡柱子，平衡5个柱体积。收集目的洗脱液，获得目的产物。
阳离子交换层析结果见图2，其中箭头所指为含目的蛋白的收集峰，选择 III峰收集液。
(3)根据收集峰选择不同洗脱液进行SDS-PAGE电泳以分析蛋白分离效果。
选择III峰收集液进行SDS-PAGE分析，如图3所示，其中III峰收集液 SDS-PAGE可见明显25kDa蛋白条带(即目的蛋白)。
实施例2
尘螨原料：包含尘螨的灰尘样品由锦州市锦州医科大学提供。
操作方法：本申请采用的常规操作方法详见《实验过敏反应学，何韶衡， 2010》。
(1)粗提液的制备：称量包含尘螨的灰尘样品0.10g，加入到10mL PBS-T 溶液中，4℃下搅拌过夜，5000×g离心尘螨混悬液20min取上清液，向其中加入10-100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液20mL后进行透析，在4℃下透析 3-4天。透析完成后，4℃保存。
(2)阳离子交换层析：
21)溶液配制：
结合缓冲液：10～100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲液，0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
洗脱缓冲液：100～1000mM NaCl、0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
22)上样、洗脱和收集：首先用20％乙醇清洗系统泵，然后将HiTrap Capto MMC(1ml，GE Healthcare)柱子连接到AKTA pure仪器上，再用结合缓冲液清洗样品泵，然后用2个柱体积结合缓冲液平衡柱子。通过样品泵上样，进样体积为1mL，进样5min后，用1个柱体积结合缓冲液清洗柱子，然后使用 30％洗脱缓冲液对柱子进行梯度洗脱，冲洗10个柱体积，洗脱完成后，使用结合缓冲液平衡柱子，平衡5个柱体积。收集目的洗脱液，获得目的产物。
(3)根据收集峰选择不同洗脱液进行SDS-PAGE电泳以分析蛋白分离效果。
实施例3
尘螨原料：包含尘螨的灰尘样品由锦州市锦州医科大学提供。
操作方法：本申请采用的常规操作方法详见《实验过敏反应学，何韶衡， 2010》。
(1)粗提液的制备：称量包含尘螨的灰尘样品0.10g，加入到15mL PBS-T 溶液中，4℃下搅拌过夜，5000×g离心尘螨混悬液20min取上清液，向其中加入10-100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液20mL后进行透析，在4℃下透析 3-4天。透析完成后，4℃保存。
(2)阳离子交换层析：
21)溶液配制：
结合缓冲液：10～100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲液，0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
洗脱缓冲液：100～1000mM NaCl、0.2μm滤纸过滤溶液，室温保存。
22)上样、洗脱和收集：首先用20％乙醇清洗系统泵，然后将HiTrap Capto MMC(1ml，GE Healthcare)柱子连接到AKTA pure仪器上，再用结合缓冲液清洗样品泵，然后用2个柱体积结合缓冲液平衡柱子。通过样品泵上样，进样体积为1mL，进样5min后，用1个柱体积结合缓冲液清洗柱子，然后使用 0-30％洗脱缓冲液对柱子进行梯度洗脱，冲洗10个柱体积，洗脱完成后，使用结合缓冲液平衡柱子，平衡5个柱体积。收集目的洗脱液，获得目的产物。
(3)根据收集峰选择不同洗脱液进行SDS-PAGE电泳以分析蛋白分离效果。
结果分析：
(1)粗提液的制备：通过采用PBS-T溶液对尘螨中的过敏原蛋白质进行粗提取，利用10-100mM pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液对其进行透析，尘螨粗提液中目标过敏原蛋白质Derp 1含量最高(25.0kDa)，而其他蛋白质含量较少，此操作绿色温和、简单易行，并且，蛋白质不易降解，其中目标过敏原蛋白为提取液的主要蛋白成分。该方法提取的尘螨粗提液中主要蛋白分布如图1。
(2)阳离子交换层析：阳离子交换层析结果见图2，其中箭头所指为含目的蛋白的收集峰，选择III峰收集液。
(3)SDS-PAGE电泳：选择III峰收集液进行SDS-PAGE分析，如图3 所示，其中III峰收集液SDS-PAGE可见明显25kDa蛋白条带(即目的蛋白)。
根据上述实施例的分离纯化方法得到的尘螨致敏蛋白Der p 1，其可以在多个领域中得到应用，例如在制备重组过敏原、低过敏衍生物以及预防性疫苗中的应用。这将是未来探索的一个主要方向。
上述图1、图2和图3是实施例1的结果图。实施例2、实施例3与实施例1的结果相近，在此不再赘述。
由此可见，本发明提供了一种尘螨主要致敏蛋白Der p 1分离纯化方法。所述的分离纯化方法包括制备尘螨水溶蛋白粗提液，随后通过阳离子交换层析 HiTrap Capto进一步分离纯化，以pH 4.5醋酸钠缓冲液作为结合液(10～100 mM)，30％NaCl溶液(100～1000mM NaCl)作为洗脱液，最终获得纯化的主要致敏蛋白Der p 1。本方法具有快速、高效、生产稳定，成本低等特点。所制备的提取液或纯化蛋白可用于患者血清样品中主要致敏蛋白的检测，同时还可进一步制备重组过敏原，设计低过敏衍生物以及预防性疫苗方面具有广泛应用。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
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