具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明的实施例中所用的：

出发毒株名称：Porcine circovirus type 2-B strain NDSU 41513，衣壳蛋白氨基酸序列来自protein_id＝"ALD62452.1"；

pEM质粒，来源于德泰生物科技(南京)有限公司

质粒pcDNA3.1(+)，德泰生物科技(南京)有限公司

大肠杆菌DH5α，德泰生物科技(南京)有限公司；

HEK 293F(人胚胎肾细胞293F)，来源于华东理工大学实验室；

引物序列如下：

大肠杆菌DH5α细胞培养所使用的LB液体培养基，按质量百分比计算，其组成及含量为1.0％氯化钠，1.0％蛋白胨，0.5％的酵母提取物，余量为水。

HEK 293F细胞培养所使用的培养基，为市售无血清Union-293培养基，本发明实施例采用无血清Union-293培养基的是永联生物科技(上海)有限公司生产的。

细胞转染，利用上海懋康生物科技有限公司提供的40-kDa linearpolyethylenimine(PEI)转染试剂，根据说明书进行操作。

本发明实施例中所用的SDS-PAGE和Western Blot分析方法如下：

浓度为12.5％聚丙烯酰胺凝胶上采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分离鉴定细胞裂解液和富集的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白组份蛋白条带。聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝G250染色以显示蛋白质条带。在SDS-PAGE凝胶上分离的蛋白质凝胶上，再通过湿式Western印迹转移模式将分离蛋白转移到PVDF膜上。将蛋白已转移到PVDF膜在QuickBlockTM Western封闭缓冲液中于4℃封闭过夜，然后与抗猪圆环病毒单抗(1：1000稀释；Abcam，美国)在TBST中于室温孵育2h。使用HRP标记的山羊抗兔抗体(SAB，中国)作为二抗。用TBST洗涤3次后，使用ECL化学发光系统BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)(P0018S)、碧云天生物技术有限公司和Tanon的凝胶图像系统(GIS)软件包、上海天能科技有限公司的全自动数码凝胶图像分析系统进行检测成像后的蛋白条带。

本发明的所用的主要试剂的名称、规格、生产厂家信息如下：

本发明的实施例中的细胞数量的测定方法采用台盼蓝染色法测定此方法是细胞数量测定最常见的方法，测定所用的仪器CountStar自动计数细胞分析仪。

BCA蛋白定量试剂盒方法(碧云天生物科技有限公司)，按照产品说明书操作测定。

数据统计

数据以平均值±标准误差表示使用Student’s t-检验(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA，USA)。使用GraphPadPrism 8执行图形和数据统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。*0.05<P<0.01，**0.01<P<0.001

实施例1

一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因，其碱基序列见SEQ IDNo.1，其编码由PCV2衣壳区段序列，linker区段序列和Fc区段序列三部分组成；其中所述PCV2衣壳区段序列为SEQ ID No.3；所述linker区段序列为SEQ ID No.5；所述Fc区段序列为Pig IgG重链Fc片段的编码序列为SEQ ID No.7,其构建过程的具体步骤如下：

(1)表达新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因序列密码子优化

首先，选以Porcine circovirus type 2-B strain NDSU 41513毒株编码PCV2衣壳蛋白基因，即序列ID为Gen Bank accession number ALD62452.1为基础，去除该衣壳蛋白N端41个氨基酸后，采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化得到PCV 2b衣壳区段序列；以linker为连接肽(连接肽的氨基酸序列为SEQ ID No.4)，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化得到linker区段序列；以猪IgG重链Fc区域基因，序列ID为Gen Bank accession number AAD38418.1的Fc区段序列；将上述三部分区段序列采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件，按照哺乳细胞的密码子偏好性进行密码子优化，进行全基因合成得到新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白基因；其序列见SEQ ID No.1。

(2)添加表达新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因N端、C端表达序列元件

在上述步骤(1)所得的新型PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的前后两端设计添加含有酶切位点EcoRI-HindIII，插入Kozak序列和人IgG2H重链信号肽序列，其顺序依次为Kozak序列,人IgG2H重链信号肽序列。将上述添加了Kozak序列,人IgG2H重链信号肽序列元件的新型表达PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因进行密码子优化，按照哺乳细胞的密码子偏好性，采用德泰生物科技(南京)有限公司密码子优化软件进行密码子优化。

(3)添加新型表达PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因N端、C端表达序列元件的序列基因合成

对上述序列进行全基因合成从而得到包含表达重组猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因序列，其序列见SEQ ID No.13。上述的Kozak序列见SEQ ID No.11；上述的人IgG2H重链信号肽序列见SEQ ID No.12；采用Applied Biosystems公司的3730XL测序仪对上述所得的表达猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的基因进行测序，结果与SEQ IDNo.13结果一致。

实施例2

一种含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的重组质粒，其构建过程具体如下：

(1)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建

在PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因的N端和C端两端，设计酶切位点EcoRI和HindIII，序列通过人工基因合成方式合成，再通过双酶切法将PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的基因插入到表达载体pEM质粒中，得到pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；

(2)含有PCV 2b Capsid-Fc的基因的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的构建

将酶切位点NheI和HindIII设计在序列如SEQ ID No.9的引物PcfF序列和序列如SEQ ID No.10引物PcfR序列中，通过引物PcfF和PcfR对合成表达PCV2b Capsid-Fc的基因序列如SEQ ID No.1进行PCR扩增，获得包含有酶切位点NheI和HindIII的氨基酸表达片段，然后再将PCR扩增片段进行NheI/HindIII双酶切，再连接到同样NheI/HindIII双酶切处理的pCDNA3.1(+)质粒表达载体上，得到pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒；

上述所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCR鉴定结果示意图见图1；其中M,DNA marker 1kb DNA；1-2.PCV 2b Capsid-Fc PCR产物，从图1中可以看出重组质粒中含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白基因。

上述所得的pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc的NheI/HindIII酶双酶切后的核酸片段的示意图见图2，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.NheI/HindIII酶双酶切pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc，从图2中中可以看出成功构建了表达质粒pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc。

上述所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的PCV 2b Capsid-Fc的NcoI/ApaI酶双酶切后的核酸片段的示意图见图3，其中M.DNA Marker；1.提取的重组质粒；2.用NcoI/ApaI酶双酶切，从图3中可以看出成功构建了pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒。

实施例3

转染级pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的制备，具体包括如下步骤：

(1)pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒转染到大肠杆菌DH5α；吸取实施例2所得的pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒80-100ng加入到已制备的DH5α感受态细胞中，然后加入到LB液体培养基，放入摇床控制温度为37℃、转速为200rpm震荡培养约30min，然后分离出DH5α感受态细胞，得到含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的重组大肠杆菌DH5α；

(2)转染级质粒的提取

将上述步骤(1)得到的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的大肠杆菌DH5α，在新鲜的培养板中挑取单克隆于2-5mLLB培养基，控制温度为37℃、转速200rpm培养8h后得种子液，然后按体积比1/500的比例，将种子液接种于200mL LB培养基中，继续控制温度为37℃、转速200rpm培养16h后得含有上述重组质粒的菌液，然后将菌液控制转速4000rpm离心10min，去掉上清，收获所得的沉淀采用Omega Biotek公司的E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid DNA Maxi Kit质粒大抽试剂盒，D6926-01，按试剂盒所述的方法进行转染级质粒的提取，最终得到转染级pEM-PCV 2bCapsid-Fc重组质粒或转染级pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒。

实施例4

一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其通过使用40kDa线性聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，将实施例3所得的转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒瞬时转染至HEK 293F悬浮细胞，然后依次经培养、分离、纯化最终得到PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其制备过程具体包括如下步骤：

(1)HEK293细胞复苏与传代

①提前将水浴锅打开37℃，Union-293无血清新鲜培养基提前在37℃预热；从液氮罐中取出冻存的装有HEK293F细胞冻存管，把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动使其约1min内快速融化，取出后用75％乙醇消毒装有HEK293F细胞冻存管的外壁，放入生物安全柜内，转移到装有10mLUnion-293无血清培养基中培养基的15mL离心管中，控制转速为800rpm离心5min，离心后离心管去掉上清，取少许新鲜培养基重悬离心管中的HEK293F细胞，然后转移到培养瓶中，加入Union-293无血清培养基轻轻摇动，使细胞分散均匀，取细胞计数及活力检测，控制活细胞密度在6-8×10⁵个细胞/mL，测定细胞活力(所述的细胞活力即为活细胞与总细胞的比例)，当细胞活力低于80％时，重新复苏，当细细胞活力在大于80％，细胞培养液置于CO₂体积百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，至密度达到2-3×10⁶个HEK293细胞/mL培养液中时，去除10mL细胞培养液，再添加10mL新鲜培养基，直至细胞活力大于90％，得到含有复苏HEK293细胞的培养液；②将上述①中所得的含有复苏HEK293细胞的培养液置于CO₂体积百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养2-3天，至细胞浓度达到2-3×10⁶个HEK293细胞/mLHEK293细胞培养液，完成对HEK293细胞进行第一次细胞扩增培养：将30mL新鲜培养基添加到上述15mL第一次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO₂体积百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2×10⁶个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第二次细胞扩增培养，培养体积达到约45mL；将90mL新鲜培养基添加到上述45mL第二次细胞扩增培养后所得的HEK293细胞培养液中，然后放入CO₂体积百分比浓度为5％的CO₂培养箱中，控制温度为37℃、转速为110rpm进行继续培养，每天需对HEK293细胞浓度及细胞活力检测，当细胞浓度达到2-3×10⁶个HEK293细胞/mL培养液，完成对HEK293细胞进行第三次细胞扩增培养，培养体积达到约135mL；

(2)含有pEM-PCV 2b Capsid-Fc或pCDNA3.1(+)-PCV 2b Capsid-Fc转染级质粒的Union-293无血清培养液的制备：

将实施例3所得的转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒添加到的Union-293无血清培养基中，得到20μg/ml的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液；

(3)含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液的制备：

将转染试剂聚乙烯亚胺添加到Union-293无血清培养基中，得到80μg/ml的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液；

(4)PEI/DNA的Union-293无血清培养液的制备：

将上述所得的20μg/ml的含有转染级pEM-PCV 2b Capsid-Fc重组质粒的Union-293无血清培养液与80μg/ml的含聚乙烯亚胺的Union-293无血清培养液按照体积比为1:1的比例混合，在室温下静止20-30min后，得到PEI/DNA的Union-293无血清培养液；

(5)质粒转染HEK293细胞：

取13.5ml PEI/DNA的Union-293无血清培养液加入到135mL步骤(1)中①所得的经过三次扩增培养后的HEK-293F培养液中，然后放入CO₂体积百分比浓度为5％的CO₂培养箱中控制温度为37℃、转速为110rpm进行培养4-6天，得到的细胞培养液控制转速为1000rpm离心10min，所得的沉淀即含有PCV2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞；

(6)PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的分离：

将步骤(5)所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞，用超声裂解缓冲液重悬，然后使用Qsonica LLC公司的型号Q125的超声破碎仪，控制振幅强度输出为34％，工作3秒，停息7秒，总工作时间30min进行超声裂解液，然后控制温度为4℃、转速为12,000rpm离心20min，收集上清液；

所述的超声裂解缓冲液，按每升计算，含50mM Tris、300mM NaCl、20mM pH8.0的咪唑、10g TritonX-100、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，余量是水；

含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞和超声裂解缓冲液的用量，按含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重:超声裂解缓冲液为1g:10mL的比例计算；

所述的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的HEK293F细胞的湿重，即为步骤(5)离心后所得的沉淀的实际质量；

(7)PCV2 Capsid-Fc融合蛋白的纯化：

将步骤(6)中离心后收集的上清液上样到Protein A琼脂糖凝胶层析柱(德泰生物科技(南京)有限公司)，按Protein A琼脂糖凝胶层析柱的使用要求进行，依次进行平衡色谱柱、上样、洗杂、洗脱、收集、收集样品中和，再经0.22微米过滤器过滤，得到含有PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白的过滤液。

对上述所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的过滤液中PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白进行氨基酸序列的测定，其与预期的氨基酸序列与SEQ ID No.2是一致的。

上述所得的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白，其组成结构示意图如图4所示，从图4中可以看出；PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白通过Fc片段的二硫键，能够将单体的PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白形成PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白二聚体；

使用I-TRASSER Server以丝带模型对上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的3D结构进行预测，其预测结构图如图5所示，从图5中可以看出；PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的衣壳蛋白部分与Fc部分在结构上，不会产生互相干扰，分别有足够的空间构想来发挥个自的功能。

上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的SDS-PAGE和Western Blot分析图见图6，其中的A为HEK293F细胞表达后的细胞裂解物和纯化的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在变性条件下在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳图，其中M为marker，泳道1，超声处理后细胞裂解物的上清液泳道2为流穿液，泳道3-8为洗脱液；泳道a超声处理后细胞裂解液的上清液，泳道b为流穿液，泳道c-e为洗脱液，凝胶用考克兰染色进行的SDS-PAGE分析，B为Western Blot蛋白质印迹分析，检测到约59kDa蛋白的特异性条带。从图6中可以看出，在约59kDa位置上有预期条带。由此表明了对细胞表达的裂解物进行纯化，最终获得目标蛋白产物，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白。

应用实施例

上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白在制备用于抗猪圆环病毒2b型感染的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗中的应用，所述的PCV2 Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗由活性成分PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白和佐剂组成，按质量体积比计算，其中PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白∶佐剂为3.3mg∶100mL；

其中所述的佐剂为完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂；

其中的活性成分为PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒。

上述的一种PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗的制备方法，具体步骤如下：

将上述实施例4的步骤(7)中所得的含有PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白的过滤液通过透析的方法置换到pH 7.4、含有甘油的体积百分比浓度为10％的1xPBS中后，用0.22微米滤器过滤，然后将经0.22微米滤器过滤后所得的滤液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白浓度为66μg/mL。

PCV 2b将上述用0.22微米滤器过滤后所得的滤液取1体积，用pH7.4的1xPBS溶液稀释一倍后，均分两等分，分别与1体积预热至37℃的弗氏完全佐剂和1体积预热至37℃的弗氏非完全佐剂等体积振荡混合，以实现对PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白进行乳化，直至形成稳定的乳化体系，即得到PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗。

上述的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗，经扫描电镜测定，活性成分PCV2b Capsid-Fc融合蛋白自组装成病毒样纳米颗粒，其粒径约为41nm。

以商业亚单位疫苗(以下简称CSV，即青岛易邦生物工程有限公司生产的抗PCV2亚单位疫苗)、灭活病毒(德国勃林格殷格翰(上海)动物保健品有限公司生产的)为对照，将上述所得的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗分别采用透射电镜进行扫描，所得的扫描透射电镜图如图7、8、9、10、11、12、13、14、15所示，从图7、8、9的对比中可以看出灭活病毒，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗形态各不相同，从图10、11、12的对比中可以看出灭活病毒与PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗都能形成有规则颗粒状，而商业亚单位疫苗以穗状无规则；从图13、14、15的对比中可以看出灭活病毒大小在15-20纳米左右，PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗纳米颗粒大小约41nm；由此表明了PCV2b Capsid-Fc融合蛋白能够自发形成形态规则的纳米颗粒，平均大小约41n m，为更好激发机体产生免疫响应提供了结构基础。

动物细胞实验

以商业亚单位疫苗(即青岛易邦生物工程有限公司生产的抗PCV2亚单位疫苗)、灭活病毒(德国勃林格殷格翰(上海)动物保健品有限公司生产的)为对照，将上述所得的PCV2b Capsid-Fc蛋白亚单位疫苗分别进行动物细胞免疫实验；

以雌性BLAB/c小鼠(6-8周龄)为实验对象，在华东理工大学生物工程学院特定无病原体动物(SPF)级动物实验室饲养，在正式实验前饲养7天，然后将动物随机分为三个实验组(n＝3只小鼠/组)，并保持在温度和光照受控的环境以及可随意获取食物和水条件；

以腹膜内方式免疫小鼠，用6.6ug疫苗/只小鼠的用量，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和市售抗PCV2亚单位疫苗。对照组为仅接受无菌PBS溶液。PBS溶液配制如下，按每升所含的各物质含量；NaCl，8.0g；KH₂PO₄，0.2g；Na₂HPO₄.12H₂O，2.9g；KCl，0.2g；再定容至1000mL，调pH值至7.4；

初次免疫后第12、24、36、59、64和70天，从每组小鼠中收集血清，分别测定血清中抗PCV2衣壳蛋白抗体浓度。

淋巴细胞增殖测定和细胞因子测定

从小鼠免疫70天后的免疫小鼠中分离出脾细胞。将脾细胞(5×10⁵细胞/孔)接种到96圆孔板中，添加200μl含10％FBS的RPMI 1640进行培养。用伴刀豆球蛋白ConA(5μg/mL)或疫苗刺激这些脾细胞。在37℃下培养72小时后，然后按等体积100uL的试剂添加到每孔中，并在37℃下孵育15分钟。所使用发光细胞活力测定试剂盒(美国Promega)，根据制造商的规程操作，使用自动细胞分析仪在96孔，平坦，透明底部，不透明壁的微孔板中测量淋巴细胞的增殖情况，结果表示为刺激指数(SI)，其根据下式计算：SI＝(免疫组的细胞数–空白对照的细胞数)/(阴性对照组的细胞数–空白对照的细胞数)。

淋巴细胞的增殖情况具体如图16所示，图中EFSV为本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗，CSV为商业亚单位疫苗、ConA为阳性对照、Control为RPMI 1640对照组，从图16中可以看出，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗均具有强烈的淋巴细胞刺激作用，并引起增殖反应。用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫的两组小鼠的SI分别为1.728±0.259，1.430±0.212，都高于RPMI 1640对照组(P<0.05)，而本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫组SI数值也高于商业亚单位疫苗免疫组。ConA(阳性对照)对照的SI值为2.967±0.713，表明ConA有效地发挥了作用。这些结果表明，本发明的Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗在小鼠中诱导了显著的细胞免疫应答。

抗体滴度的测定

为了进一步研究本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗即PCV 2bCapsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗免疫应答的程度，通过间接ELISA分析，再对取得的自免疫小鼠血清测量PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体水平，具体结果见图17、图18；

从图17中可以看出，初次免疫后第12天，抗体水平微弱增加，第二次加强免疫后，能够高水平产生针对PCV2 Capsid的特异性抗体，抗体浓度超过500ng/ml，并且在整个实验阶段，抗体浓度并保持很高水平，由此表明本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够激发小鼠产生高浓度的PCV2 Capsid特异性抗体抗体，抗体浓度维持高水平；

进一步，从图17中可以看出，用本发明的PCV2 Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫的组中针对PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体的平均水平，在12和24天时间抗体浓度快速提高，从222.38ng/mL提升到461.23ng/mL。36天后，抗体浓度都维持在540ng/mL以上的浓度水平。

图18中对照组为PBS溶液免疫小鼠，EFSV免疫小鼠组为本发明的PCV2bFc融合蛋白亚单位疫苗免疫小鼠组、CSV表示商业亚单位疫苗免疫小鼠组，其中*P＜0.05，**P＜0.01，从图18中可以看出，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗都能诱导产生抗小鼠PCV2抗体，而本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗免疫的小鼠组诱导产生的抗体浓度显著高于商业亚单位疫苗免疫的小鼠组，在用商品亚基疫苗免疫的小鼠组，PCV2 Capsid衣壳蛋白的特异性抗体的水平在200-250ng/mL，因此，本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗与商业亚单位疫苗免疫的小鼠组相比抗体浓度水平提高1倍以上，统计分析，具有显著性差异(P<0.05)，由此表明，本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够很好的刺激小鼠机体产生高浓度的抗体从而提高细胞和体液的免疫力。

为了进一步表征用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗(EFSV)和商业亚基疫苗(CSV)免疫的小鼠的抗原特异性细胞免疫特性，本发明人评估了使用本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚单位疫苗来刺激免疫小鼠脾脏T细胞所分泌的细胞因子。测定采用商业化小鼠IFN-γ和IL-10ELISA试剂盒测定(江苏酶免实业有限公司)。与PBS对照组相比，细胞因子IFN-γ分泌浓度为230.76±16.97和237.28±20.11pg/ml，使用本发明的PCV2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗和商业亚基疫苗刺激的免疫小鼠T细胞，T细胞分泌产生的IFN-γ细胞因子分别达到292.17±13.80和293.80±30.50pg/ml，从该数据结果统计学分析，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05，结果见图19所示；

此外，在以EFSV免疫小鼠脾T细胞用培养基刺激，对比以EFSV免疫小鼠脾T细胞用PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白(PCFFP)刺激，两者平均细胞因子IL-10的分泌浓度分别为17.17±0.85ng/mL和19.11±0.26ng/mL，统计学对两组数据分析显示，具有显著性差异(P<0.05)，然而，在用CSV免疫和用CSV刺激的小鼠中未检测到IL-10分泌的显着差异，结果见图20所示；以上结果表明了本发明的PCV 2b Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够更好的诱导小鼠的体液和细胞的免疫反应。

综上所述，本发明提供的一种猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白的表达基因所编码的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白，其作为活性成分所得的猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白亚单位疫苗能够更好诱导小鼠的体液和细胞产生免疫反应。

猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白能够形成类病毒样纳米颗粒，具有很好的结构属性，易于激发机体的免疫系统产生应激免疫反应。以上数据结果显示，猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白不仅能够诱导小鼠体液免疫和细胞免疫反应，在与商业化亚单位疫苗相比较，以猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白为活性成分的实验疫苗，在有些指标更优于商业化亚单位疫苗。因此，猪圆环病毒2b型Capsid-Fc融合蛋白是一种具有很好潜力的防治猪圆环病毒感染的候选疫苗。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海中鹰科技实业有限公司

<120> 猪圆环病毒2b型 Capsid-Fc融合蛋白及其制备方法、基因及构建方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacggcatct tcaacaccag gctgtccagg accttcggct acaccatcaa gcggaccacc 60

gtgcggacac cttcttgggc cgtggacatg atgcgcttca acatcaacgc cttcctgccc 120

ccaggcggag gctctaatcc tagaagcgtg cctttcgagt actaccggat ccggaaggtg 180

aaggtggagt tttggccttg cagccccatc acccagggag atagaggagt gggaagtagc 240

gccgtgatcc tggacgacaa cttcgtgacc aaggccacag ccctgaccta cgatccttac 300

gtgaactaca gcagccggca caccatcacc cagcccttca gctaccacag ccgctacttc 360

acccctaaac ccgtgctgga cagcaccatc gactacttcc agcccaacaa caagcggaac 420

cagctctggc tgagactgca gacagcaggc aacgtggatc acgtgggact gggaacagcc 480

ttcgagaaca gcatctacga ccagggctac aacatccgcg tgaccatgta cgtgcagttc 540

cgggagttca acctgaagga cccccccctg aatccaggaa gcggaggagg aagcggagga 600

ggaggaagcg gaggaggaag cgcccctaaa acagctccta gcgtgtatcc tctggcccct 660

tgtggcagag atacaagcgg ccctaacgtg gctctgggct gtctggcctc tagctacttc 720

ccagagcccg tgaccatgac ttggaacagc ggagccctga caagcggagt gcacaccttt 780

cctagcgtgc tgcagcctag cggactgtat agcctgagca gcatggtgac agtgccagcc 840

tctagcctga gcagcaagag ctacacttgc aacgtgaacc accccgccac cacaacaaag 900

gtggacaagc gcgtgggcac caagacaaag cctccttgcc ccatttgtcc aggttgcgag 960

gtggccggcc ctagcgtgtt tatcttccct cctaagccca aggacaccct gatgatcagc 1020

cagaccccag aagtgacttg cgtggtggtg gacgtgtcta aggagcacgc cgaggtgcag 1080

ttcagttggt acgtggacgg cgtggaagtg cacacagccg agacaagacc caaggaggag 1140

cagttcaaca gcacctaccg cgtggtgtcc gtgctgccta tccagcacca ggattggctg 1200

aagggcaagg agttcaagtg caaggtcaac aacgtggacc tgccagcccc tatcaccaga 1260

acaatcagca aggccatcgg acagagcagg gagcctcagg tgtacacact gcctcctcca 1320

gcagaggagc tgagcaggag caaagtgacc gtgacctgcc tggtcatcgg cttttacccc 1380

ccagacatcc acgtcgagtg gaagagtaac gggcagccag agccagaggg caactacaga 1440

accacacctc ctcagcagga cgtggacgga acattcttcc tgtacagcaa gctggccgtg 1500

gacaaagctc gctgggatca cggggagacc ttcgaatgcg cagtgatgca cgaggccctg 1560

cataaccact acacccagaa gagcatcagc aagacccagg gcaag 1605

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile

1 5 10 15

Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg

20 25 30

Phe Asn Ile Asn Ala Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg

35 40 45

Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

50 55 60

Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser

65 70 75 80

Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr

85 90 95

Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro

100 105 110

Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser

115 120 125

Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu

130 135 140

Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Gly Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met

165 170 175

Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

180 185 190

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala

195 200 205

Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg Asp

210 215 220

Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr Phe

225 230 235 240

Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

245 250 255

Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

260 265 270

Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser Tyr

275 280 285

Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys Arg

290 295 300

Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu

305 310 315 320

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

325 330 335

Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

340 345 350

Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val

355 360 365

Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser

370 375 380

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu

385 390 395 400

Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala

405 410 415

Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro

420 425 430

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys

435 440 445

Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His

450 455 460

Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg

465 470 475 480

Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser

485 490 495

Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu

500 505 510

Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

515 520 525

Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys

530 535

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacggcatct tcaacaccag gctgtccagg accttcggct acaccatcaa gcggaccacc 60

gtgcggacac cttcttgggc cgtggacatg atgcgcttca acatcaacgc cttcctgccc 120

ccaggcggag gctctaatcc tagaagcgtg cctttcgagt actaccggat ccggaaggtg 180

aaggtggagt tttggccttg cagccccatc acccagggag atagaggagt gggaagtagc 240

gccgtgatcc tggacgacaa cttcgtgacc aaggccacag ccctgaccta cgatccttac 300

gtgaactaca gcagccggca caccatcacc cagcccttca gctaccacag ccgctacttc 360

acccctaaac ccgtgctgga cagcaccatc gactacttcc agcccaacaa caagcggaac 420

cagctctggc tgagactgca gacagcaggc aacgtggatc acgtgggact gggaacagcc 480

ttcgagaaca gcatctacga ccagggctac aacatccgcg tgaccatgta cgtgcagttc 540

cgggagttca acctgaagga cccccccctg aatcca 576

<210> 4

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Ile

1 5 10 15

Lys Arg Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg

20 25 30

Phe Asn Ile Asn Ala Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg

35 40 45

Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

50 55 60

Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser

65 70 75 80

Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr

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Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro

100 105 110

Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser

115 120 125

Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu

130 135 140

Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Gly Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met

165 170 175

Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

180 185 190

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaagcggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaagc 45

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

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<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcccctaaaa cagctcctag cgtgtatcct ctggcccctt gtggcagaga tacaagcggc 60

cctaacgtgg ctctgggctg tctggcctct agctacttcc cagagcccgt gaccatgact 120

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ggactgtata gcctgagcag catggtgaca gtgccagcct ctagcctgag cagcaagagc 240

tacacttgca acgtgaacca ccccgccacc acaacaaagg tggacaagcg cgtgggcacc 300

aagacaaagc ctccttgccc catttgtcca ggttgcgagg tggccggccc tagcgtgttt 360

atcttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatcagcc agaccccaga agtgacttgc 420

gtggtggtgg acgtgtctaa ggagcacgcc gaggtgcagt tcagttggta cgtggacggc 480

gtggaagtgc acacagccga gacaagaccc aaggaggagc agttcaacag cacctaccgc 540

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aaggtcaaca acgtggacct gccagcccct atcaccagaa caatcagcaa ggccatcgga 660

cagagcaggg agcctcaggt gtacacactg cctcctccag cagaggagct gagcaggagc 720

aaagtgaccg tgacctgcct ggtcatcggc ttttaccccc cagacatcca cgtcgagtgg 780

aagagtaacg ggcagccaga gccagagggc aactacagaa ccacacctcc tcagcaggac 840

gtggacggaa cattcttcct gtacagcaag ctggccgtgg acaaagctcg ctgggatcac 900

ggggagacct tcgaatgcgc agtgatgcac gaggccctgc ataaccacta cacccagaag 960

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<210> 8

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Cys Gly Arg

1 5 10 15

Asp Thr Ser Gly Pro Asn Val Ala Leu Gly Cys Leu Ala Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Met Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Pro Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Leu Ser Ser Lys Ser

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Pro Ala Thr Thr Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys

100 105 110

Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

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Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu

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Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile

245 250 255

His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr

260 265 270

Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr

275 280 285

Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe

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Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

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Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys

325

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcactatag ggagacccaa gctggctagc ccgccgccac catgggctgg agct 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actagtggat ccgagctcgg taccaagctt ttatcacttg ccctgggtct tgct 54

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccgccacca tgg 13

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggctgga gctgcatcat cctgttcctc gtggccacag ccacaggagt gcactct 57

<210> 13

<211> 1691

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctagcccgc cgccaccatg ggctggagct gcatcatcct gttcctcgtg gccacagcca 60

caggagtgca ctctaacggc atcttcaaca ccaggctgtc caggaccttc ggctacacca 120

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cctacgatcc ttacgtgaac tacagcagcc ggcacaccat cacccagccc ttcagctacc 420

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acaacaagcg gaaccagctc tggctgagac tgcagacagc aggcaacgtg gatcacgtgg 540

gactgggaac agccttcgag aacagcatct acgaccaggg ctacaacatc cgcgtgacca 600

tgtacgtgca gttccgggag ttcaacctga aggacccccc cctgaatcca ggaagcggag 660

gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaagcgcccc taaaacagct cctagcgtgt 720

atcctctggc cccttgtggc agagatacaa gcggccctaa cgtggctctg ggctgtctgg 780

cctctagcta cttcccagag cccgtgacca tgacttggaa cagcggagcc ctgacaagcg 840

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tgacagtgcc agcctctagc ctgagcagca agagctacac ttgcaacgtg aaccaccccg 960

ccaccacaac aaaggtggac aagcgcgtgg gcaccaagac aaagcctcct tgccccattt 1020

gtccaggttg cgaggtggcc ggccctagcg tgtttatctt ccctcctaag cccaaggaca 1080

ccctgatgat cagccagacc ccagaagtga cttgcgtggt ggtggacgtg tctaaggagc 1140

acgccgaggt gcagttcagt tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaca gccgagacaa 1200

gacccaagga ggagcagttc aacagcacct accgcgtggt gtccgtgctg cctatccagc 1260

accaggattg gctgaagggc aaggagttca agtgcaaggt caacaacgtg gacctgccag 1320

cccctatcac cagaacaatc agcaaggcca tcggacagag cagggagcct caggtgtaca 1380

cactgcctcc tccagcagag gagctgagca ggagcaaagt gaccgtgacc tgcctggtca 1440

tcggctttta ccccccagac atccacgtcg agtggaagag taacgggcag ccagagccag 1500

agggcaacta cagaaccaca cctcctcagc aggacgtgga cggaacattc ttcctgtaca 1560

gcaagctggc cgtggacaaa gctcgctggg atcacgggga gaccttcgaa tgcgcagtga 1620

tgcacgaggc cctgcataac cactacaccc agaagagcat cagcaagacc cagggcaagt 1680

gataaaagct t 1691