井冈羟胺a酯类衍生物及其制备和应用
阅读说明：本技术 井冈羟胺a酯类衍生物及其制备和应用 (Validamine hydroxylamine A ester derivative and preparation and application thereof ) 是由 陆跃乐 吕旭浩 叶康 范永仙 陈小龙 陈翰驰 朱林江 于 2021-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了井冈羟胺A酯类衍生物及其制备和应用。所述井冈羟胺A酯类衍生物的结构如式(1)所示,其中R＝A-(B)-m-,A为苯基、取代苯基、马来酰亚胺基或取代马来酰亚胺基,所述取代苯基或取代马来酰亚胺基的取代基为1或2个,所述的取代基各自独立为F、Cl、Br、I、羟基或C1-C4烷基；m＝0或1,当m＝1时,B为碳原子数为1-10个的亚烷基或者含有至少一个双键的脂肪烃基链。本发明提供一种以固定化酶Novozym 435为催化剂的井冈羟胺A酯类衍生物的制备方法。本发明还提供了所述井冈羟胺A酯类衍生物在制备蚕豆蚜虫杀虫剂、水稻纹枯病菌抑制剂或油菜菌核病菌抑制剂中的应用,表现出良好的杀虫或抑菌活性。(The invention discloses a valienamine A ester derivative and a preparation method and application thereof. The valienamine A ester derivative has a structure shown in a formula (1), wherein R is A- (B) m -, A is phenyl, substituted phenyl, maleimide or substituted maleimide, the substituents of said substituted phenyl or substituted maleimide being 1 or 2, each of said substituents being independentIs F, Cl, Br, I, hydroxy or C1-C4 alkyl; and m is 0 or 1, and when m is 1, B is an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms or an aliphatic hydrocarbon chain having at least one double bond. The invention provides a preparation method of validoxylamine A ester derivatives by using immobilized enzyme Novozym 435 as a catalyst. The invention also provides application of the valienamine A ester derivative in preparing broad bean aphid insecticides, rice sheath blight bacteria inhibitors or rape sclerotinia sclerotiorum inhibitors, and the valienamine A ester derivative shows good insecticidal or bacteriostatic activity.)
(一)
技术领域
本发明涉及井冈羟胺A酯类衍生物及其制备和在杀虫、抑菌方面的应用。
(二)
背景技术
井冈霉素(Validamycin)，由吸水链霉菌井冈变种合成的一类农用抗生素，具有低毒、高效、廉价等优势，现已是我国产量最大、发酵单位最高的生物源杀菌剂之一。井冈羟胺A(Validoxylamine A)作为井冈霉素中的活性结构，具有抑菌、杀虫活性，是重要的生物农药中间体(式1)。研究表明井冈羟胺A作为一种海藻糖酶抑制剂，能够高效竞争性抑制海藻糖的水解，阻断生物体内能量代谢，达到抑制病虫害的效果，在离体实验中，对海藻糖酶表现出极强的抑制活性。但是，由于井冈羟胺A的多羟基结构，其水溶性极好，透皮效果较差，故在活体实验中并未能表现出很好的生物活性。因此，如何提高井冈羟胺A的透皮效果，成为研究的热点和难点。郑鹛[郑鹛.井冈羟胺A的衍生及其生物活性研究[D].杭州:浙江工业大学,2006.]合成了菊酰基井冈羟胺A化合物，在500mg/L浓度下蚜虫死亡率能达到96.7％。郑辉[郑辉.以井冈羟胺A和新型含吡啶杂环化合物为先导的化学修饰及生物活性研究[D].杭州:浙江工业大学,2008.]通过化学法合成多种井冈羟胺A衍生物库，一定程度上拓宽了井冈羟胺A的应用范围。
酯化是常见的用于改善化合物极性的药物设计手段，但是，井冈羟胺A的多羟基结构加大了其化学酯化修饰的难度。尽管如此，与井冈羟胺A结构类似的糖类，在脂肪酶介导作用下合成糖酯已实现工业化生产，并广泛用于食品、化妆品以及药品等领域。脂肪酶催化的酯化反应具有高度的选择性，能针对单一位点酯化且反应条件温和。本发明以井冈羟胺A为先导化合物，将不同的有机酸引入井冈羟胺A，设计合成了酯类衍生物，并测定了其对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌以及蚕豆蚜虫的抑制活性。
(三)
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种良好的蚕豆蚜虫抑制活性的井冈羟胺A酯类衍生物。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种井冈羟胺A酯类衍生物的制备方法。
本发明要解决的第三个问题是提供所述井冈羟胺A酯类衍生物在制备蚕豆蚜虫杀虫剂中的应用。
本发明要解决的第四个技术问题是提供所述井冈羟胺A酯类衍生物在制备水稻纹枯病菌抑制剂或油菜菌核病菌抑制剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种井冈羟胺A酯类衍生物，其结构如式(1)所示：
其中R＝A-(B)m-，A为苯基、取代苯基、马来酰亚胺基或取代马来酰亚胺基，所述取代苯基或取代马来酰亚胺基的取代基为1或2个，所述的取代基各自独立为F、Cl、Br、I、羟基或C1-C4烷基；m＝0或1，当m＝1时，B为碳原子数为1-10个的亚烷基或者含有至少一个双键的脂肪烃基链。
作为优选，A为苯基、取代苯基或马来酰亚胺基，所述取代苯基的取代基为1或2个，所述的取代基各自独立为F、Cl、Br、I、羟基或甲基。
作为优选，当m＝1时，B为-CH2-、-C2H4-、-CH＝CH-或-C10H20-。
作为进一步的优选，A为苯基、取代苯基或马来酰亚胺基，所述取代苯基的取代基为1或2个，所述的取代基各自独立为F、Cl、Br、I、羟基或甲基；m＝0或1，当m＝1时，B为-CH2-、-C2H4-、-CH＝CH-或-C10H20-。
作为更进一步的优选，所述井冈羟胺A酯类衍生物选自化合物I～化合物VII中的一种，所述化合物I～化合物VII中的R的定义如下所示：
第二方面，本发明提供一种式(1)所示的井冈羟胺A酯类衍生物的制备方法，包括：式(2)所示的井冈羟胺A在叔丁醇中于90-110℃回流4-6h制得井冈羟胺A饱和溶液，然后在反应容器中加入井冈羟胺A饱和溶液、固定化酶Novozym 435、有机酸RCOOH和分子筛进行酯化反应，充分反应后经分离纯化得到式(1)所示的井冈羟胺A酯类衍生物；反应式如下所示：
其中，RCOOH中的R的定义同式(1)。
本发明中，所述有机酸RCOOH与井冈羟胺A的投料摩尔比为2-4:1，最优选4:1。
本发明中，所述Novozym 435酶加量以井冈羟胺A的摩尔数计为100-150g/mol，优选120g/mol。
本发明所述反应体系中加入分子筛，其作用是除去酯化反应过程中生成的水，促使酯化反应向正方向进行，提高转化率。所述分子筛的用量以井冈羟胺A的摩尔数计为0.4-2g/mmoL，更优选为1.2-2.0g/mmoL，最优选为1.2g/mmoL。
本发明中，酯化反应温度为40-60℃，优选为60℃。
本发明中，合成井冈羟胺A酯类衍生物的反应过程采用薄板层析(展开剂为正丙醇：水：乙酸＝4:1:1，显色剂为碘蒸气与茚三酮溶液)进行监控并确定反应终点。酯化反应时间一般在30-80h，延长反应时间有利于提高转化率，但同时也会增加副产物，优选为40-72h。
作为优选，为使反应更为彻底，在反应进行24h时补加井冈羟胺A粉末，补加的井冈羟胺A粉末与反应开始时加入的井冈羟胺A等量。
本发明在反应结束后，所得反应液通过分离纯化可得到产物。作为优选，所述的分离纯化步骤为：反应结束，将反应液过滤除去固定化酶及分子筛，减压脱去溶剂，用正丁醇与饱和NaCl溶液萃取，舍弃水相，减压蒸馏除去有机溶剂，柱层析(V(正丙醇)：V(乙酸)＝8:1)纯化，干燥后即得到井冈羟胺A酯类衍生物。
第三方面，本发明提供了所述井冈羟胺A酯类衍生物在制备蚕豆蚜虫杀虫剂中的应用。
作为优选，所述井冈羟胺A酯类衍生物为化合物VI，该化合物对于蚕豆蚜虫的杀虫效果最佳。
第四方面，本发明提供了所述井冈羟胺A酯类衍生物在制备水稻纹枯病菌抑制剂或油菜菌核病菌抑制剂中的应用。
作为优选，所述所述井冈羟胺A酯类衍生物为化合物II或化合物VII，这两个化合物对于水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌均具有较好的抑制活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一系列新型井冈羟胺A酯类衍生物，改善了底物井冈羟胺A的脂溶性，丰富了井冈类化合物库，该类酯化物具有良好的抑菌和杀虫效果。
(2)本发明提供的井冈羟胺A酯类衍生物的制备方法，可准确控制反应位点，并最终得到一酯产物。
附图说明
图1是实施例制备的井冈羟胺A酯类衍生物对离体油菜菌核病菌的抑制情况(200μM)。
图2是实施例制备的井冈羟胺A酯类衍生物的杀虫活性测定(500μg/mL)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1-7
8g井冈羟胺A加入500mL叔丁醇中，于100℃回流5h制备井冈羟胺A-叔丁醇饱和溶液备用。
单口圆底烧瓶中依次加入井冈羟胺A-叔丁醇饱和溶液21mL(含井冈羟胺A0.5mmol)、有机酸RCOOH 2mmol、Novozym 435脂肪酶60mg、分子筛600mg。反应在60℃恒温磁力搅拌水浴锅中进行，24h后补加井冈羟胺A固体170mg(0.5mmol)，继续反应24h，TLC(V(正丙醇)：V(乙酸)：V(水)＝4:1:1)监控至反应终点。反应结束后过滤，减压脱去溶剂，用10mL正丁醇与10mL饱和NaCl溶液萃取，舍弃水相，减压蒸馏除去有机溶剂，柱层析(V(正丙醇)：V(乙酸)＝8:1)纯化，干燥后即得到井冈羟胺A酯类衍生物。
其中有机酸RCOOH分别为对氟苯乙酸(实施例1)、对氯苯乙酸(实施例2)、3-苯丙酸(实施例3)、肉桂酸(实施例4)、水杨酸(实施例5)、阿魏酸(实施例6)、马来酰亚胺十一酸(实施例7)。
制备得到的7种新型井冈羟胺A酯类衍生物的结构经1H NMR、13C NMR和HRMS的验证，相关数据如下。
井冈羟胺A对氟苯乙酸酯(化合物I)：淡黄色油状液体，收率34％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.31(dd,J＝8.4,5.5Hz,2H),7.13(t,J＝8.8Hz,2H),5.75(d,J＝4.1Hz,1H),4.20(d,J＝3.1Hz,1H),4.18(d,J＝3.0Hz,1H),4.00(s,1H),3.98(s,1H),3.96–3.96(m,2H),3.95(s,2H),3.91(s,2H),3.74(d,J＝5.9Hz,2H),3.66(s,2H),3.43–3.32(m,4H),3.26–3.22(m,1H),3.08–3.01(m,2H),2.99–2.92(m,1H),1.99–1.92(m,1H),1.75–1.66(m,1H),1.02(t,J＝13.4Hz,1H)。13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.19,160.29(d,J＝242.6Hz),140.72,131.46(d,J＝8.1Hz),130.78,120.00,114.99(d,J＝20.8Hz),74.61,73.39,72.61,71.61,71.11,70.18,65.47,61.45,54.10,52.09,38.40,35.97,27.52。HRMS:C22H30FNO9[M+H]+，测试值472.1979，计算值472.1977。
井冈羟胺A对氯苯乙酸酯(化合物II)：淡黄色油状液体，收率39％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.40–7.34(m,2H),7.33–7.28(m,2H),5.74(dd,J＝15.2,4.0Hz,1H),4.68(d,J＝13.3Hz,1H),4.61–4.54(m,2H),4.50(s,3H),4.20(dd,J＝10.7,3.1Hz,2H),3.99(t,J＝8.0Hz,2H),3.74(d,J＝9.5Hz,1H),3.68(s,1H),3.48(dd,J＝10.4,3.7Hz,1H),3.45–3.38(m,2H),3.35(td,J＝9.1,8.7,3.9Hz,2H),3.28–3.22(m,1H),3.12(s,1H),3.05(s,1H),3.01(d,J＝9.2Hz,1H),2.96(d,J＝9.3Hz,1H),1.97(s,1H),1.71(dd,J＝10.9,3.6Hz,1H),1.06(dt,J＝13.4Hz,1H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.87,140.68,135.07,131.51,131.38,128.28,119.85,74.57,73.33,72.65,70.58,70.16,70.07,65.52,61.40,54.05,52.04,38.40,35.90,27.48。HRMS:C22H30ClNO9[M+H]+，测试值488.1677，计算值488.1682。
井冈羟胺A3-苯丙酸酯(化合物III)：黄色油状液体，收率26％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.27(t,J＝7.5Hz,2H),7.21(d,J＝7.6Hz,2H),7.18(t,J＝7.3Hz,1H),5.78(d,J＝4.5Hz,1H),4.72–4.34(m,8H),4.18(dd,J＝10.9,3.1Hz,1H),4.00(d,J＝6.2Hz,1H),4.00–3.95(m,2H),3.74(d,J＝6.3Hz,1H),3.43(dd,J＝8.9,5.7Hz,1H),3.38(t,J＝4.2Hz,1H),3.36(d,J＝9.0Hz,1H),3.27(dd,J＝9.4,4.4Hz,1H),3.12(d,J＝4.7Hz,1H),3.06(q,J＝4.2,3.7Hz,1H),3.00(t,J＝9.7Hz,1H),2.85(t,J＝7.6Hz,2H),2.61(t,J＝7.6Hz,2H),1.98(tdt,J＝10.2,6.8,4.0Hz,1H),1.70(dt,J＝14.4,3.5Hz,1H),1.04–0.98(m,1H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ172.75,141.05,141.00,128.77,128.65,126.49,120.32,75.07,73.75,73.70,73.06,71.45,70.60,65.33,61.86,54.62,52.58,36.33,35.59,30.76,27.91.HRMS:C23H33NO9[M+H]+，测试值498.2681，计算值498.2688。
井冈羟胺A肉桂酸酯(化合物IV)：黄色油状液体，收率33％。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.69(dd,J＝16.0,7.1Hz,1H),7.58(dd,J＝6.2,2.8Hz,2H),7.38(dd,J＝4.6,2.2Hz,3H),6.53(dd,J＝16.0,11.0Hz,1H),5.94(d,J＝4.4Hz,1H),4.90(s,1H),4.85(s,1H),4.36–4.25(m,1H),4.18(d,J＝14.1Hz,1H),4.12(d,J＝14.1Hz,1H),3.99(dd,J＝19.9,5.5Hz,1H),3.66(d,J＝6.8Hz,1H),3.64(d,J＝5.6Hz,1H),3.61(d,J＝3.4Hz,1H),3.59(d,J＝9.1Hz,1H),3.57(d,J＝5.3Hz,1H),3.56(d,J＝6.0Hz,1H),3.54(d,J＝9.2Hz,1H),3.48(dd,J＝9.8,4.1Hz,1H),3.42(d,J＝4.3Hz,1H),3.32(s,2H),3.31–3.29(m,1H),3.26(s,1H),3.23(t,J＝9.3Hz,1H),2.17(s,1H),2.04–1.99(m,1H),1.78(d,J＝18.0Hz,1H)。13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ177.21,145.19,141.16,134.35,130.17,124.27,117.43,75.00,74.56,73.26,72.92,71.42,64.95,64.12,54.99,53.39,38.51,27.29。HRMS:C23H31NO9[M+H]+，测试值466.2069，计算值466.2062。
井冈羟胺A水杨酸酯(化合物V)：黄色油状液体，收率14％。δ7.86(s,1H),7.44(s,1H),6.89(dd,J＝7.2,3.8Hz,1H),6.87–6.84(m,1H),5.93(d,J＝14.7Hz,1H),4.68(s,1H),4.56(s,1H),4.45(s,2H),4.23(d,J＝5.1Hz,1H),4.16(s,1H),4.14(m,1H),4.10(s,1H),4.02(s,1H),3.93(d J＝4.9Hz,2H),3.83(s,1H),3.64–3.61(m,2H),3.58(s,2H),3.52(s,1H),3.45(d,J＝6.7Hz,2H),3.04(s,1H),2.24–2.19(m,1H),1.80(s,2H),1.51–1.47(m,1H)。13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ170.23,164.06,141.65,134.19,133.24,126.13,119.02,112.90,112.49,73.68,73.47,73.09,71.14 70.05,69.78,65.72,61.84,56.11,55.93,37.07,25.75。HRMS:C21H29NO10[M+H]+，测试值456.1860，计算值456.1864。
井冈羟胺A阿魏酸酯(化合物VI)：黄色油状液体，收率12％。δ7.69(d,J＝14.2Hz,1H),7.22(s,1H),7.10(s,1H),6.95–6.88(m,1H),6.87–6.76(m,1H),6.41(d,J＝12.5Hz,1H),6.01–5.95(m,1H),4.77(d,J＝7.3Hz,1H),4.74(d,J＝12.1Hz,1H),4.72–4.69(m,1H),4.36–4.30(m,1H),4.29–4.25(m,1H),4.21(s,1H),4.19(s,1H),4.13(s,1H),4.03(s,1H),4.00(s,1H),3.96(s,2H),3.89(s,3H),3.70(s,2H),3.65–3.60(m,2H),3.57(s,1H),3.52(s,1H),3.51(s,1H),3.05(s,1H),2.25–2.17(m,1H),1.88(s,1H),1.64(s,1H)。13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ177.36,147.11,145.55,144.14,140.29,127.19,125.73,124.87,120.03,115.06,75.14,73.68,73.13,71.57,71.01,69,89,63.32,61.92,55.36,55.08,52.87,38.52,25.24。HRMS:C24H33NO11[M+H]+，测试值512.2131，计算值512.2126。
井冈羟胺A11-马来酰亚胺十一酸酯(化合物VII)：褐色油状液体，收率52％。1HNMR(500MHz,Methanol-d4)δ6.14–5.75(m,1H),4.82–4.71(m,1H),4.59(s,1H),4.51(s,1H),4.29(t,J＝6.7Hz,1H),4.19(s,1H),4.18–4.07(m,2H),4.02(q,J＝7.0Hz,1H),3.99–3.93(m,1H),3.91–3.84(m,1H),3.78(s,1H),3.70–3.61(m,2H),3.61–3.57(m,2H),3.50(s,1H),3.48–3.47(m,2H),3.35–3.22(m,3H),3.05–2.94(m,1H),2.66–2.50(m,4H),2.40–2.21(m,2H),2.16–2.01(m,1H),1.92(s,1H),1.65–1.52(m,5H),1.33–1.23(m,12H)。13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ177.08,173.55,141.25,124.61,75.03,73.80,73.13,71.55,71.08,70.65,65.28,64.36,54.67,52.68,38.99,37.52,34.08,29.11,28.93,28.71,28.15,28.03,24.96,24.93。HRMS:C29H48N2O11[M+H]+，测试值601.3294，计算值601.3292。
实施例8
采用菌丝生长速率法[康卓,顾宝根.《农药生物活性测试标准操作规范——杀菌剂卷》[J].农药学学报,2017.19(05):137.]测定实施例1-7制备的衍生物对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)的抑制活性，水稻纹枯病菌由浙江大学提供。以井冈霉素A和井冈羟胺A作为对照品。
用0.1％Tween-80的无菌水配置2000μM的含药母液，梯度稀释成500、250、125、62.5μM的含药溶液后，分别取含药溶液与琼脂培养基(2％琼脂)充分混匀制备浓度依次为200、100、50、25、12.5、6.25μM的含药培养基，每个浓度设置3个平行，分别测试对水稻纹枯病菌的抑制率，再用SPSS软件计算EC50。
药物毒力回归方程和有效中浓度EC50的计算：以菌丝生长抑制率表示药物对R.solani的毒力。对菌丝生长的抑制率换算成抑制几率值(y)，药剂浓度换算成浓度对数(x)，按最小二乘法求出药物对R.solani抑制几率值的回归方程决定系数R，根据毒力回归方程计算药物对菌丝生长的抑制中浓度EC50值。
表1井冈羟胺A酯类衍生物对R.solani的抑制情况及EC50值
a:井冈霉素A；
b:井冈羟胺A.
结果显示，除了化合物I和III外，其余化合物在200μM下对水稻纹枯病菌R.solani的抑制活性均大于50％，如表1所示，从表中的抑制率结果分析化合物II保持了较高的生物活性，为73.48％。而在相同浓度下，对照药井冈霉素A和井冈羟胺A对R.solani的抑制率分别为76.23％和71.40％，说明通过对井冈羟胺A酯化后的产物对具R.solani有较好的抑菌活性。在EC50测试中化合物II、VII表现出优于先导化合物井冈羟胺A的生物活性。
实施例9
采用菌丝生长速率法[康卓,顾宝根.《农药生物活性测试标准操作规范——杀菌剂卷》[J].农药学学报,2017.19(05):137.]测定实施例1-7制备的衍生物对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制活性，其由浙江省农业科学院提供。以井冈霉素A和井冈羟胺A作为对照品。
用0.1％Tween-80的无菌水配置2000μM的含药母液，梯度稀释成500、250、125、62.5μM的含药溶液后，分别取含药溶液与PDA培养基充分混匀制备浓度依次为200，100，50，25，12.5，6.25μM的含药培养基，每个浓度设置3个平行，测试对植物致病菌的抑制率。当浓度为200μM时，抑制率结果如图1所示。
结果显示，在200μM下，先导化合物井冈羟胺A并未表现出较高的抑制活性，而通过酯化反应引入不同酰基供体的衍生物部分表现出了更强的生物活性，如化合物II、VII对S.sclerotiorum的抑制率相比于井冈霉素A，提高了1.5倍。证明了通过对井冈羟胺A进行衍生化反应，能够拓宽其抗菌谱，有利于开发以井冈羟胺A为先导化合物的杀菌剂。
实施例10
采用浸叶法[顾宝根,刘学.《农药生物活性测试标准操作规范——杀虫剂卷》[J].农药学学报,2017.19(05):103.]测定实施例1-7制备的衍生物的杀虫活性，供试虫蚕豆蚜虫(Aphis craccivora)由浙江省农业科学院提供。
首先，准确称取待测化合物50mg(精准至1mg)分别用正丙醇溶解，配置成质量浓度为500mg/L的样品。其次，将感染蚜虫的蚕豆叶片浸入待测化合物溶液中10s，取出悬挂10-20min风干水分后，放置于带有湿滤纸片的培养皿中，设置3个平行组。于23-26℃室内培养，24h后统计结果。以井冈羟胺A与井冈霉素A为阳性对照，正丙醇为阴性对照，另设空白对照(CK)。以毛笔拨动虫体无反应记为死亡，CK大于10％，判定实验无效。
杀虫活性结果如图2所示，在500mg/L的浓度下，井冈羟胺A与井冈霉素A的校正死亡率分别为7.71％和32.74％，所有衍生物的杀虫活性相对于井冈羟胺A都得到了提高，其中化合物VI的校正死亡率最高，为64.60％。
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