二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用
阅读说明：本技术 二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用 (Application of copper dibenzyl dithiocarbamate medicament to treatment of triple negative breast cancer ) 是由 吴超君 于 2021-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用,二苄基二硫代氨基甲酸铜药物的具体制备方法如下：步骤一：二苄基二硫代氨基甲酸钠的合成,将0.06moL的质量为11.8g的二苄胺和150ml的乙腈在冰水浴中搅拌,加入0.09mol的质量为6.96g二硫化碳6.96g和0.09mol的质量分数为50%的氢氧化钠,搅拌反应16小时后出抽滤,将滤液旋蒸后得到产品,将产品用乙醚洗涤后干燥得产物13.04g,粗产品用乙腈重结晶得到二苄基二硫代氨基甲酸钠的质量为11.1g；在双硫仑抗癌结构基础上,重新合成新的药物二苄基二硫代氨基甲酸铜,不需要体内转化,且脂溶性提高,在实际实验过程中,二苄基二硫代氨基甲酸铜有很好的对耐药性三阴性乳腺癌具有抑制效果。(The invention relates to an application of a copper dibenzyl dithiocarbamate medicament in treating triple negative breast cancer, wherein the specific preparation method of the copper dibenzyl dithiocarbamate medicament comprises the following steps: the method comprises the following steps: synthesizing sodium dibenzyl dithiocarbamate, namely stirring 0.06moL of dibenzylamine with the mass of 11.8g and 150ml of acetonitrile in ice water bath, adding 0.09moL of carbon disulfide with the mass of 6.96g and 0.09moL of sodium hydroxide with the mass fraction of 50%, stirring for reacting for 16 hours, performing suction filtration, performing rotary evaporation on the filtrate to obtain a product, washing the product with diethyl ether, drying to obtain 13.04g of the product, and recrystallizing the crude product with acetonitrile to obtain 11.1g of sodium dibenzyl dithiocarbamate; on the basis of a disulfiram anticancer structure, a new medicament copper dibenzyl dithiocarbamate is synthesized again, in-vivo transformation is not needed, the fat solubility is improved, and in the actual experimental process, the copper dibenzyl dithiocarbamate has a good effect of inhibiting drug-resistant triple negative breast cancer.)
技术领域
本发明涉及乳腺癌治疗
技术领域
，尤其涉及二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用。背景技术
乳腺癌是最常见的女性癌症，占癌症总数的23％左右，三阴性乳腺癌是一组异质性乳腺癌；化疗是目前改善其预后的唯一的全身性治疗方式，主要用药为紫杉醇和蒽环类药物，但没有任何特定的化疗药物在特定的乳腺癌表型中具有优越性，即使对化疗药物具有良好的反应，肿瘤仍可能处于快速进展状态，对于化疗失败的晚期TNBC 患者，迫切需要开发出新的、更有针对性的治疗方案来达到治疗目的；而双硫仑是19世纪发现的用于戒酒的药物，近40年来，其相关的抗癌作用，让人们重新产生了兴趣，但目前国内外相关研究，都是以双硫仑或其金属螯合物进行抗癌效果研究。
发明内容
本发明解决的问题在于提供二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用，在双硫仑抗癌结构基础上，重新合成新的药物二苄基二硫代氨基甲酸铜，不需要体内转化，且脂溶性提高。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用，二苄基二硫代氨基甲酸铜药物的具体制备方法如下：
步骤一：二苄基二硫代氨基甲酸钠的制备
将0.06moL的质量为11.8g的二苄胺和150ml的乙腈在冰水浴中搅拌，加入0.09mol的质量为6.96g二硫化碳6.96g和0.09mol的质量分数为50％的氢氧化钠，搅拌反应16小时后出抽滤，将滤液旋蒸后得到产品，将产品用乙醚洗涤后干燥得产物13.04g，粗产品用乙腈重结晶得到二苄基二硫代氨基甲酸钠的质量为11.1g；
步骤二：二苄基二硫代氨基甲酸铜的制备
在烧杯中加入8ml的N，N-二甲基甲酰胺、1mmol的质量为0.295g 的二苄基二硫代氨基甲酸钠、1mmol的质量为0.171g的CuCl2·2H2O 和2ml的H2O搅拌使其全部溶解，将溶液转入25ml的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在80℃反应72小时，反应结束后以10℃ /min的速度冷确至室温，反应釜内壁析出墨绿色的晶体即为二苄基二硫代氨基甲酸铜。
优选的，所述冰水浴中的温度为0－4℃。
优选的，该应用的具体操作步骤如下：
S1、首先建立紫杉醇耐药细胞，MDA-MB-231细胞株属于三阴性乳腺癌，诱导其对紫杉醇耐药，建立耐药细胞系，JL-1912与蒽环类药物对照，比较IC50；
第一步，建立MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系，筛选紫杉醇作用浓度；
第二步，耐药细胞株筛选；
第三步，耐药细胞株耐药倍数计算；
S2、将紫杉醇耐药细胞分别加入表柔比星、二苄基二硫代氨基甲酸铜以及完全培养液，进行对照培养后比色。
优选的，所述第一步的具体操作步骤如下：
预先将细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105个/ml，体积100 μL/孔，细胞贴壁后无血清同步化培养24h，分别加入含不同浓度紫杉醇的培养基，100μL/孔，细胞培养72h后，吸取每孔培养液，加入100μL新鲜无血清1640培养基和10μLMTT检测试剂，37℃放置4h，吸弃细胞上清，加入10％SDS的MTT试剂裂解液，充分溶解沉淀，490nm下读取吸光值，选择细胞存活率在高于90％的浓度作为后续作用浓度，同时计算紫杉醇对MDA231细胞IC50浓度。
优选的，所述第二步的具体操作步骤如下：
预先将细胞铺于6孔板内，铺板密度为1x105个/ml，体积1500 μL/孔，细胞贴壁后更换含紫杉醇的培养基，持续作用细胞，每个3-5 天更换一次培养基，待细胞未出现明显死亡时，增加紫杉醇的作用浓度一倍，如此反复增加紫杉醇作用浓度处理MDA231细胞4-5个月的时间，确认MDA231紫杉醇耐药细胞株MDA231-TAXO。
优选的，所述第三步的具体操作步骤如下：
预先将MDA231和MDA231-TAXO细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105个/mL，体积100μL/孔，细胞贴壁后无血清同步化培养24h，分别加入含不同浓度紫杉醇的培养基，100μL/孔，细胞培养 72h后，吸取每孔培养液，加入100μL新鲜无血清1640培养基和10 μlMTT检测试剂，37℃放置4h，吸弃细胞上清，加入10％SDS的 MTT试剂裂解液，充分溶解沉淀，490nm下读取吸光值，计算MDA231 和MDA231-TAXO细胞半抑制浓度IC50得出耐药倍数，其中耐药倍数＝MDA231-TAXO细胞IC50/MDA231细胞IC50，5.4RI＝8.13，细胞可用。
优选的，所述S2的具体操作步骤如下：
预先将MDA231-TAXO细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105 个/ml，体积100μL/孔，常规培养24h，浓度设置为EPI组、JL-1912 组，对照组仅加入完全培养液，空白孔内为不含细胞和待测物质的培养基用于去除实验背景干扰，加药后培养20h，每孔加入5mg/mL的 MTT溶液20ul，37℃，继续孵育4h；小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，比色：选择 490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。
优选的，EPI组浓度分别为0.5μM、1μM、2μM和5μM，JL-1912 组浓度为0.5μM、1μM、2μM和5μM。
本发明的有益效果是：在双硫仑抗癌结构基础上，重新合成新的药物二苄基二硫代氨基甲酸铜，不需要体内转化，且脂溶性提高，在实际实验过程中，二苄基二硫代氨基甲酸铜有很好的对耐药性三阴性乳腺癌具有抑制效果。
附图说明
图1为本发明二苄基二硫代氨基甲酸铜立体结构示意图；
图2为本发明MDA231和MDA231-TAXO细胞半抑制浓度IC50得出耐药倍数表；
图3为本发明实验数据采用浓度为横轴，抑制率为纵轴绘制曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面给出具体实施例。
参照图1，二苄基二硫代氨基甲酸铜药物治疗三阴性乳腺癌的应用，二苄基二硫代氨基甲酸铜药物的具体制备方法如下：
步骤一：二苄基二硫代氨基甲酸钠的制备
将0.06moL的质量为11.8g的二苄胺和150ml的乙腈在冰水浴中搅拌，加入0.09mol的质量为6.96g二硫化碳6.96g和0.09mol的质量分数为50％的氢氧化钠，搅拌反应16小时后出抽滤，将滤液旋蒸后得到产品，将产品用乙醚洗涤后干燥得产物13.04g，粗产品用乙腈重结晶得到二苄基二硫代氨基甲酸钠的质量为11.1g；
步骤二：二苄基二硫代氨基甲酸铜的制备
在烧杯中加入8ml的N，N-二甲基甲酰胺、1mmol的质量为0.295g 的二苄基二硫代氨基甲酸钠、1mmol的质量为0.171g的CuCl2·2H2O 和2ml的H2O搅拌使其全部溶解，将溶液转入25ml的聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在80℃反应72小时，反应结束后以10℃ /min的速度冷确至室温，反应釜内壁析出墨绿色的晶体即为二苄基二硫代氨基甲酸铜，其中二苄基二硫代氨基甲酸铜结构式如下；
作为本发明的一种实施方式，冰水浴中的温度为0－4℃。
作为本发明的一种实施方式，该应用的具体操作步骤如下：
S1、首先建立紫杉醇耐药细胞，MDA-MB-231细胞株属于三阴性乳腺癌，诱导其对紫杉醇耐药，建立耐药细胞系，JL-1912与蒽环类药物对照，比较IC50；
第一步，建立MDA-MB-231紫杉醇耐药细胞系，筛选紫杉醇作用浓度；
第二步，耐药细胞株筛选；
第三步，耐药细胞株耐药倍数计算；
S2、将紫杉醇耐药细胞分别加入表柔比星、二苄基二硫代氨基甲酸铜以及完全培养液，进行对照培养后比色。
作为本发明的一种实施方式，第一步的具体操作步骤如下：
预先将细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105个/ml，体积100 μL/孔，细胞贴壁后无血清同步化培养24h，分别加入含不同浓度紫杉醇的培养基，100μL/孔，细胞培养72h后，吸取每孔培养液，加入100μL新鲜无血清1640培养基和10μLMTT检测试剂，37℃放置4h，吸弃细胞上清，加入10％SDS的MTT试剂裂解液，充分溶解沉淀，490nm下读取吸光值，选择细胞存活率在高于90％的浓度作为后续作用浓度，同时计算紫杉醇对MDA231细胞IC50浓度；
第二步的具体操作步骤如下：
预先将细胞铺于6孔板内，铺板密度为1x105个/ml，体积1500 μL/孔，细胞贴壁后更换含紫杉醇的培养基，持续作用细胞，每个3-5 天更换一次培养基，待细胞未出现明显死亡时，增加紫杉醇的作用浓度一倍，如此反复增加紫杉醇作用浓度处理MDA231细胞4-5个月的时间，确认MDA231紫杉醇耐药细胞株MDA231-TAXO；
第三步的具体操作步骤如下：
预先将MDA231和MDA231-TAXO细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105个/mL，体积100μL/孔，细胞贴壁后无血清同步化培养24h，分别加入含不同浓度紫杉醇的培养基，100μL/孔，细胞培养 72h后，吸取每孔培养液，加入100μL新鲜无血清1640培养基和10 μlMTT检测试剂，37℃放置4h，吸弃细胞上清，加入10％SDS的 MTT试剂裂解液，充分溶解沉淀，490nm下读取吸光值，计算MDA231 和MDA231-TAXO细胞半抑制浓度IC50得出耐药倍数，其中耐药倍数＝MDA231-TAXO细胞IC50/MDA231细胞IC50，5.4RI＝8.13，细胞可用。
MDA231-TAXO对TAXO的耐药性
作为本发明的一种实施方式，S2的具体操作步骤如下：
预先将MDA231-TAXO细胞铺于96孔板内，铺板密度为1x105 个/ml，体积100μL/孔，常规培养24h，浓度设置为EPI组、JL-1912 组，对照组仅加入完全培养液，空白孔内为不含细胞和待测物质的培养基用于去除实验背景干扰，加药后培养20h，每孔加入5mg/mL的 MTT溶液20ul，37℃，继续孵育4h；小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，比色：选择 490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。
作为本发明的一种实施方式，EPI组浓度分别为0.5μM、1μM、 2μM和5μM，JL-1912组浓度为0.5μM、1μM、2μM和5μM。
浓度为横轴，抑制率为纵轴绘制曲线，其中上方曲线为JL-1912， JL-1912为二苄基二硫代氨基甲酸铜，下方曲线为EPI，EPI为表柔比星。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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