具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。昆虫细胞培养基(Insect-XpressTM Media)：Lonza Wokingham Ltd.，货号为12-730F。pFastBac^TM dual vector：ThermoFisher公司，货号10712024。如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。

实施例1、制备MERS-CoV RBD monomer和MERS-CoV RBD dimer

一、重组质粒的构建

将序列表的序列6所示的双链DNA分子取代pFastBac^TM dual vector的BglⅡ和SalI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒甲。序列表的序列6中，第1-114位核苷酸编码gp67信号肽，第124-792位核苷酸编码RBD monomer，第793-810位核苷酸编码His₆标签。序列表的序列6所示的DNA分子编码序列表的序列5所示的蛋白质。在昆虫细胞表达并分泌的过程中gp67信号肽被切除，形成序列表的序列5中第39-270位氨基酸残基组成的成熟蛋白。

将序列表的序列8所示的双链DNA分子插入pFastBac^TM dual vector的BglⅡ和SalI酶切位点之间，得到重组质粒乙。序列表的序列8中，第1-114位核苷酸编码gp67信号肽，第124-843位核苷酸编码RBD dimer，第844-861位核苷酸编码His₆标签。序列表的序列8所示的DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质。在昆虫细胞表达并分泌的过程中gp67信号肽被切除，形成序列表的序列7中第39-287位氨基酸残基组成的成熟蛋白。

二、MERS-CoV RBD monomer和MERS-CoV RBD dimer的制备和纯化

1、重组Bacmid的制备

(1)将重组质粒加入刚刚融化的大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞中，冰上放置30min；然后42℃热激75s，放回冰上2min；然后加入500μl LB液体培养基，于37℃复苏5h；然后吸取10μl涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、40μg/ml IPTG和100μg/ml X-gal的LB固体培养基平板，避光培养三天至长出清晰的蓝白斑。

(2)挑取白色单菌落，接种于5mL含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养12小时。

(3)取步骤(2)得到的培养体系，采用的质粒小提试剂盒(QIAprep Spin MiniprepKit，Qiagen公司，货号为27106,其中含有P1试剂、P2试剂和P3试剂)提取质粒，具体步骤依次如下：

①将培养体系13000rpm离心2min，收集菌体沉淀，用P1试剂重悬菌体；

②加入P2试剂，缓慢颠倒混匀6-8次；

③加入P3试剂，缓慢颠倒混匀6-8次(可见白色沉淀)，13000rpm离心10min，取上清液；

④取600μl上清液，加入800μl预冷的异丙醇，-20℃放置10min，然后13000rpm离心15min，收集沉淀；

⑤用500μl预冷的70％乙醇水溶液重悬沉淀，13000rpm离心5min，收集沉淀，将酒精完全吹干后，用65℃预热的ddH₂O溶解沉淀，13000rpm离心5min，吸取上清，即为重组Bacmid的溶液，简称Bacmid溶液。

2、重组病毒的制备与扩增

(1)取生长良好的Sf9细胞，加入10cm培养皿中，静置10min，细胞贴壁，显微镜下观察，保证培养皿底部约有70％-80％被细胞覆盖。

(2)取Cellfectin II Reagent 15μl，用100μl昆虫细胞培养基稀释。

(3)取15-20μl Bacmid溶液，用100μl昆虫细胞培养基稀释。

(4)将步骤(2)得到的液相缓慢加入步骤(3)得到的液相中，缓慢吹打均匀，室温静置30min，用昆虫细胞培养基稀释至2ml。

(5)取完成步骤(1)的培养皿，弃去上清，缓慢均匀的将步骤(4)得到的液相滴加至培养皿中，27℃静置培养5h后吸弃上清，加入7ml新鲜的昆虫细胞培养基，用封口膜密封后27℃静置培养8天，收集培养液，600g离心6min，取上清液，加入胎牛血清并使其体积浓度为2-5％，长期保存，即为P0代重组病毒的病毒液。

(6)取P0代重组病毒的病毒液，按照1:1000的体积比加入摇瓶培养的细胞浓度为2×10⁶个细胞/mL的Sf9细胞液中，27℃、110rpm培养5天，收集培养液，600g离心6min，取上清液，即为P1代重组病毒的病毒液，简称P1代病毒液。

3、蛋白的表达和纯化

(1)取P1代病毒液，按照1:100的体积比加入1L细胞浓度为2×10⁶个细胞/mL的Sf9细胞液中，27℃、125rpm培养72小时，4000rpm离心15min，收集上清液。

(2)将步骤(1)得到的上清液用双层0.45μm的玻璃纤维膜抽滤，收集滤液。

(3)用切向流超滤系统(Masterflex PharMed BPT Tubing系统，Cole-Parmer公司，货号为06508-24)对步骤(2)得到的滤液进行浓缩，同时加入PBS缓冲液不断稀释，使蛋白置换到PBS缓冲液中，然后13000rpm离心30min，收集上清液。

(4)亲和层析

①在步骤(3)得到的上清液中加入Ni-NTA纯化介质，4℃孵育3小时，400rpm离心5min，取沉淀。

②用100mL含20mM咪唑的PBS缓冲液洗涤步骤①得到的沉淀，以去除杂蛋白。

③用20mL含300mM咪唑的PBS缓冲液洗涤步骤②得到的沉淀，收集溶液。

(5)使用10kD浓缩管对步骤(4)得到的溶液进行浓缩，得到1.2ml蛋白浓缩液。

(6)取步骤(5)得到的蛋白浓缩液，采用Hiload superdex200柱进行分子筛层析，采用PBS缓冲液作为洗脱液。

采用重组质粒甲进行步骤二时，分子筛层析收集保留体积为18.31-23.19ml的过柱后溶液，即为MERS-CoV RBD monomer溶液。

采用重组质粒乙进行步骤二时，分子筛层析收集保留体积为16.21.47-21.70ml的过柱后溶液，即为MERS-CoV RBD dimer溶液。

采用重组质粒甲进行步骤二时的分子筛层析色谱图(B)和采用重组质粒乙进行步骤二时的分子筛层析色谱图(A)的叠加图见图1。

MERS-CoV RBD monomer溶液(B)和MERS-CoV RBD dimer溶液(A)的非还原凝胶电泳图见图2。MERS-CoV RBD dimer(二聚体)的预期分子量为52.54KD。MERS-CoV RBDmonomer(单体)的预期分子量为24.42KD。

MERS-CoV RBD dimer的出峰位置比MERS-CoV RBD monomer的出峰位置靠前，MERS-CoV RBD dimer的分子量是MERS-CoV RBD monomer的2倍。结果表明，MERS-CoV RBDdimer以二聚体的形式存在。MERS-CoV RBD monomer以单体的形式存在。

实施例2、抗原性分析(ELISA试验)

供试抗体：MERS-4或MERS-27或10E8。MERS-4即单克隆抗体MERS-4，制备方法见专利“单克隆抗体MERS-4及其编码基因和应用”(申请号201310566227.8；授权公告号CN104628849B)。MERS-27即单克隆抗体MERS-27，制备方法见专利“单克隆抗体MERS-27及其编码基因和应用”(申请号201310565893.X；授权公告号CN104628848B)。MERS-4和MERS-27均为针对MERS-CoV RBD的中和抗体。10E8为针对HIV-1膜蛋白的单克隆抗体(用作阴参)。

抗原溶液：实施例1制备的MERS-CoV RBD monomer溶液或MERS-CoV RBD dimer溶液。封闭液：含1％(体积比)胎牛血清的PBS缓冲液。供试抗体溶液：取供试抗体，用封闭液稀释至蛋白浓度为1mg/ml。PBST溶液：吐温的含量为0.5％(体积比)。二抗：HRP标记抗鼠IgG抗体，Promega，货号为W4021。

1、取抗原溶液，用PBS缓冲液稀释至蛋白浓度为1μg/ml，得到包被液；取酶标板，加入包被液(抗原加入量分别设置为：200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔、25ng/孔、或12.5ng/孔；每个包被量设置3个复孔)，4℃包被过夜。

2、完成步骤1后，弃上清，加入封闭液，37℃孵育2h。

3、完成步骤2后，弃上清，用PBST溶液洗涤三次。

4、完成步骤3后，加入供试抗体溶液(2000ng抗体/孔)，37℃孵育1h。

5、完成步骤4后，弃上清，用PBST溶液洗涤3次。

6、完成步骤5后，弃上清，加入二抗工作液(100μl/孔)，37℃孵育45min。

7、完成步骤6后，弃上清，用PBST溶液洗涤3次。

8、完成步骤7后，加入TMB显色液，反应2-5分钟后，使用酶标仪检测450nm波长下的吸光度。

结果见图3。图3中，每组柱形自左至右依次对应由高至低的抗原加入量。RBDdimer对两种中和抗体的结合能力要优于RBD monomer。

实施例3、结构解析

分别取实施例1制备的MERS-CoV RBD monomer溶液和MERS-CoV RBD dimer溶液，用10kD超滤管浓缩至10mg/ml，坐滴法筛选晶体。

在25％的PEG1500条件下长出梭形单晶。

使用同步辐射X-射线光源进行衍射数据收集。

使用HKL-2000、DPP4、Coot、phoenix等软件处理数据，使用分子置换法求解相位，最终解析结构。

结果见图4。图4的A为MERS-CoV RBD monomer的结构，图4的B为MERS-CoV RBDdimer的结构。MERS-CoV RBD monomer含有8个半胱氨酸(Cys)，会形成4对分子内二硫键。MERS-CoV RBD dimer的一个单体上含有9个Cys，其中8个Cys会形成4对分子内二硫键，每个单体上多出来的1个Cys会形成1对分子内二硫键，将两个单体形成一个二聚体。

实施例3、免疫后血清的中和活性

一、分组免疫

BalB/C小鼠(维通利华公司)分成6组，每组5只，分别免疫如下：

第一组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为肌肉注射；初次免疫，单只小鼠的免疫体积为40μl，免疫物为“20μl 1mg/ml RBD monomer溶液与20μl弗氏完全佐剂混合形成的白色乳浊液”；加强免疫，单只小鼠的单次免疫体积为40μl，免疫物为“20μl1mg/ml RBD monomer溶液与20μl弗氏不完全佐剂混合形成的白色乳浊液”；

第二组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为鼻粘膜免疫，单只小鼠的单次免疫体积为20μl，免疫物为“10μl 2mg/ml RBD monomer溶液与10μl CpGODN1826溶液的混匀物”；

第三组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为鼻粘膜免疫，单只小鼠的单次免疫体积为20μl，免疫物为“10μl 2mg/ml RBD monomer溶液与10μl C48/80溶液的混匀物”；

第四组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为肌肉注射；初次免疫，单只小鼠的免疫体积为40μl，免疫物为“20μl 1mg/ml RBD dimer溶液与20μl弗氏完全佐剂混合形成的白色乳浊液”；加强免疫，单只小鼠的单次免疫体积为40μl，免疫物为“20μl 1mg/ml RBD dimer溶液与20μl弗氏不完全佐剂混合形成的白色乳浊液”；

第五组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为鼻粘膜免疫，单只小鼠的单次免疫体积为20μl，免疫物为“10μl 2mg/ml RBD dimer溶液与10μl CpGODN1826溶液的混匀物”；

第六组：第1天进行初次免疫，第15天进行第2次免疫，第29天进行第3次免疫，第43天进行第4次免疫；免疫方式为鼻粘膜免疫，单只小鼠的单次免疫体积为20μl，免疫物为“10μl 2mg/ml RBD dimer溶液与10μl C48/80溶液的混匀物”；

取实施例1制备的MERS-CoV RBD dimer溶液，用PBS缓冲液调整浓度，使蛋白浓度为1mg/ml，即为1mg/ml RBD dimer溶液。取实施例1制备的MERS-CoV RBD dimer溶液，用PBS缓冲液调整浓度，使蛋白浓度为2mg/ml，即为2mg/ml RBD dimer溶液。取实施例1制备的MERS-CoV RBD monomer溶液，用PBS缓冲液调整浓度，使蛋白浓度为1mg/ml，即为1mg/mlRBD monomer溶液。取实施例1制备的MERS-CoV RBD monomer溶液，用PBS缓冲液调整浓度，使蛋白浓度为2mg/ml，即为2mg/ml RBD monomer溶液。C48/80(Compound48/80)：Sigma公司,批号C2313。取C48/80，用PBS缓冲液溶解，使其浓度为2mg/ml，即为C48/80溶液。CpGODN1826(单链DNA分子，全链硫代修饰，序列为：TCCATGACGTTCCTGACGTT)，用PBS缓冲液溶解，使其浓度为5mg/ml，即为CpGODN1826溶液。

第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫统称为加强免疫。

采血免疫前7天，通过眼眶后静脉丛采血。初次免疫后，第36天、第50天分别取血，均通过眼眶后静脉丛采血。

二、MERS-CoV-2假病毒的制备

表达MERS-CoV全长膜蛋白的质粒(命名为MERS-CoV质粒)和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，孵育后能够得到具有感染性但没有复制能力的MERS-CoV假型病毒，其感染性同活病毒相似。骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase，即含有Luciferase的骨架质粒pNL4-3R-E(即文献中的vector with the luciferase gene containing backbonepNL4-3R-E)：Wang Q,Liu L,Ren W,Gettie A,Wang H,Liang Q,Shi X,Montefiori DC,Zhou T,Zhang L.Cell Rep.2019。

将序列表的序列10所示的双链DNA分子(编码序列表的序列9所示的蛋白质)插入pcDNA3.1(+)载体的BamHII和EcoRI酶切位点之间，得到MERS-CoV质粒。

将MERS-CoV质粒和骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，37℃静置孵育(采用含10％胎牛血清的DMEM培养基)，转染48小时后收集细胞培养上清，即为含有MERS-CoV假病毒的病毒液(简称MERS-CoV病毒液)。

三、免疫血清中和活性检测

待测血清：取步骤一得到血样，分离获得血清。

1、采用含10％FBS的DMEM培养基将待测血清进行倍比稀释，依次得到血清浓度不同的稀释液。

2、将100微升步骤1得到的稀释液与50微升步骤二制备的MERS-CoV病毒液病毒液(病毒含量为100TCID50)混合，37℃静置孵育1小时。设置用100微升含10％FBS的DMEM培养基代替100微升稀释液的空白对照。

3、完成步骤2后，加入50微升Huh7细胞的细胞液(约含2×10⁴个Huh7细胞)，37℃静置孵育48小时(实际应用中，48-72小时均可)。

4、完成步骤3后，加入100μl PBS缓冲液和50μl细胞裂解液(Bright-GloTMLuciferase Assay System，Promega，E2650)，静置2min，然后用化学发光仪检测荧光素酶活性。

每种处理设置3个复孔，结果取平均值。

中和活性＝(空白对照组的荧光强度-加入稀释液的实验组的荧光强度)/空白对照组的荧光强度×100％。

中和活性为50％时对应的血清稀释倍数即位ID50。

ID50值见表2。通过鼻粘膜进行免疫，MERS-CoV RBD dimer诱导小鼠产生的中和抗体反应要强于MERS-CoV RBD monomer所诱导产生的中和抗体反应，可以更强的抑制MERS-CoV侵染细胞。

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> MERS-CoV膜蛋白受体结合域二聚体及其编码基因和应用

<130> CGGNQAYX206035

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu

1 5 10 15

Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro

50 55 60

Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly

85 90 95

Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys

100 105 110

Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro

115 120 125

Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp

130 135 140

Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys

145 150 155 160

Val Ser Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg

165 170 175

Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly

180 185 190

Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr

195 200 205

Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu

210 215 220

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaggctaagc catctggctc tgtggtggaa caggctgagg gagtggagtg tgacttcagc 60

ccactgctgt ctggcacacc tccacaggtc tacaacttca agagactggt gttcaccaac 120

tgtaactaca acctgaccaa actgctgtcc ctgttctctg tgaatgactt cacttgtagc 180

cagattagcc ctgctgccat tgccagcaac tgttactcct ccctgattct ggactacttc 240

tcctacccac tgagtatgaa gtctgacctg tctgtgtcct ctgctggacc aatcagccag 300

ttcaactaca agcagtcctt cagcaaccca acttgtctga ttctggctac agtgccacac 360

aacctgacca ccatcaccaa gccactgaaa tactcctaca tcaacaagtg tagcagactg 420

ctgtctgatg acaggacaga ggtgccacaa ctagtgaatg ccaaccaata cagcccatgt 480

gtgagcattg tgccaagcac agtgtgggag gatggagact actacaggaa gcaacttagc 540

ccattggagg gaggaggctg gctggtggca tctggcagca cagtggctat gacagaacaa 600

ctccaaatgg gctttggcat cacagtccaa tatggcacag acaccaactc tgtgtgtcca 660

aaattggag 669

<210> 3

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu

1 5 10 15

Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro

50 55 60

Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly

85 90 95

Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys

100 105 110

Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro

115 120 125

Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp

130 135 140

Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys

145 150 155 160

Val Ser Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg

165 170 175

Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly

180 185 190

Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr

195 200 205

Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe

210 215 220

Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr

225 230 235 240

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaggctaagc catctggctc tgtggtggaa caggctgagg gagtggagtg tgacttcagc 60

ccactgctgt ctggcacacc tccacaggtc tacaacttca agagactggt gttcaccaac 120

tgtaactaca acctgaccaa actgctgtcc ctgttctctg tgaatgactt cacttgtagc 180

cagattagcc ctgctgccat tgccagcaac tgttactcct ccctgattct ggactacttc 240

tcctacccac tgagtatgaa gtctgacctg tctgtgtcct ctgctggacc aatcagccag 300

ttcaactaca agcagtcctt cagcaaccca acttgtctga ttctggctac agtgccacac 360

aacctgacca ccatcaccaa gccactgaaa tactcctaca tcaacaagtg tagcagactg 420

ctgtctgatg acaggacaga ggtgccacaa ctagtgaatg ccaaccaata cagcccatgt 480

gtgagcattg tgccaagcac agtgtgggag gatggagact actacaggaa gcaacttagc 540

ccattggagg gaggaggctg gctggtggca tctggcagca cagtggctat gacagaacaa 600

ctccaaatgg gctttggcat cacagtccaa tatggcacag acaccaactc tgtgtgtcca 660

aaattggagt ttgccaatga caccaagatt gccagccaac ttggcaactg tgtggaatac 720

<210> 5

<211> 270

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser

35 40 45

Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr

65 70 75 80

Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn

85 90 95

Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys

100 105 110

Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys

115 120 125

Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr

130 135 140

Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro

145 150 155 160

His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn

165 170 175

Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu

180 185 190

Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile Val Pro Ser Thr

195 200 205

Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu

210 215 220

Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala Met Thr Glu

225 230 235 240

Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr

245 250 255

Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu His His His His His His

260 265 270

<210> 6

<211> 813

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta 60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcggcggat 120

cccgaggcta agccatctgg ctctgtggtg gaacaggctg agggagtgga gtgtgacttc 180

agcccactgc tgtctggcac acctccacag gtctacaact tcaagagact ggtgttcacc 240

aactgtaact acaacctgac caaactgctg tccctgttct ctgtgaatga cttcacttgt 300

agccagatta gccctgctgc cattgccagc aactgttact cctccctgat tctggactac 360

ttctcctacc cactgagtat gaagtctgac ctgtctgtgt cctctgctgg accaatcagc 420

cagttcaact acaagcagtc cttcagcaac ccaacttgtc tgattctggc tacagtgcca 480

cacaacctga ccaccatcac caagccactg aaatactcct acatcaacaa gtgtagcaga 540

ctgctgtctg atgacaggac agaggtgcca caactagtga atgccaacca atacagccca 600

tgtgtgagca ttgtgccaag cacagtgtgg gaggatggag actactacag gaagcaactt 660

agcccattgg agggaggagg ctggctggtg gcatctggca gcacagtggc tatgacagaa 720

caactccaaa tgggctttgg catcacagtc caatatggca cagacaccaa ctctgtgtgt 780

ccaaaattgg agcaccacca tcaccatcat tag 813

<210> 7

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Pro Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser

35 40 45

Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr

65 70 75 80

Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn

85 90 95

Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys

100 105 110

Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys

115 120 125

Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr

130 135 140

Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro

145 150 155 160

His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn

165 170 175

Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu

180 185 190

Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys Val Ser Ile Val Pro Ser Thr

195 200 205

Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu

210 215 220

Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala Met Thr Glu

225 230 235 240

Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr

245 250 255

Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala

260 265 270

Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr His His His His His His

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Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu

20 25 30

Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile

35 40 45

Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr

50 55 60

Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp

65 70 75 80

His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr

85 90 95

Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe

100 105 110

Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly

115 120 125

Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Ser Ala Thr Ile Arg Lys Ile Tyr

130 135 140

Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp Gly Lys

145 150 155 160

Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp Gly Cys

165 170 175

Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg Ser Gly

180 185 190

Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr Tyr His

195 200 205

Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn Ala Ser

210 215 220

Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr Phe Met

225 230 235 240

Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe Gly Ile

245 250 255

Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr Val Asp

260 265 270

Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val Tyr Asp

275 280 285

Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser Ile Gln

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Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu Gln Pro

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Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg Arg Ala

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Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser Tyr Glu

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Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe Glu Ala

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Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro Leu Lys

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Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg Lys Gln

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Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly Ser Thr

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Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr Val Gln

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gaagaatacg acctggagcc tcataaagtg catgtccatt ga 4062