具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明提供了以下优选的实施例。

如图1所示，本发明实施例提供一种吡氟草胺分子印迹聚合物的制备方法，包括：

步骤一，称取0.394g吡氟草胺于250mL三角瓶中。

具体地，吡氟草胺作为模板分子，本发明采用赛多利斯科学仪器有限公司电子天平BS244S实现精确称取。吡氟草胺采用沈阳化工研究院95％吡氟草胺。

步骤二，向所述三角瓶中加入100mL乙腈至所述三角瓶中的吡氟草胺完全溶解后，加入TFMAA(2-(三氟甲基)丙烯酸)，室温预聚12h。

具体地，乙腈作为致孔剂，采用色谱纯,美国Fisher公司。TFMAA作为功能单体，采用阿拉丁98％TFMAA。模板分子吡氟草胺与功能单体(TFMAA)形成氢键，聚合洗脱后在聚合物中产生较多的活性位点。可加入3mmol TFMAA。

优选地，吡氟草胺与TFMAA的物质的量比例为1：3。发明人在保持上述聚合反应条件不变的情况下,改变模板分子的加入量,制得图2所示的D-MIP的SEM图，图2中(a)NIP；(b)D-MIP(1∶1)；(c)D-MIP(1∶2)；(d)D-MIP(1∶3)；(e)D-MIP(1∶4)；(f)D-MIP(1∶5)。由图2可知,当吡氟草胺与TFMAA的物质的量比例为1∶5时,制得的吡氟草胺分子印迹聚合物团聚在一起,没有形成空间分散均匀的网状结构,不利于吡氟草胺的洗脱,影响吡氟草胺分子印迹聚合物的吸附能力。随着吡氟草胺量的增加,吡氟草胺分子印迹聚合物的粒径逐渐减小,呈现出空间的网状结构,当吡氟草胺与TFMAA的物质的量比例达到1∶3时,吡氟草胺分子印迹聚合物呈稀松的空间网状结构,颗粒表面粗糙,颗粒之间形成大量的孔隙,推测适当比例的吡氟草胺通过静电吸附、氢键作用等在吡氟草胺分子印迹聚合物颗粒之间撑开较大的孔隙,形成大量的空间结合位点,吡氟草胺被洗脱出去后在孔隙间留下具特异吸附性的结合位点。但是随着吡氟草胺的量继续增加,吡氟草胺分子印迹聚合物颗粒表面变得光滑,粒径增大,孔隙明显减少,推测可能是吡氟草胺相互作用降低了吡氟草胺分子印迹聚合物中形成孔穴的概率。因此,吡氟草胺与TFMAA的物质的量比例选择1：3，能够使得吡氟草胺分子印迹聚合物得到最佳的吸附性能。

步骤三，依次加入25mmol EGDMA(乙二醇二甲基丙烯酸酯)、0.5mmol AIBN(偶氮二异丁腈)，超声5min,持续充入氮气10min,封口在60℃磁力搅拌24h,取出制备的白色聚合物于索氏提取器中。

具体地，EGDMA作为交联剂，采用阿拉丁98％EGDMA。AIBN作为引发剂，采用麦克林98％AIBN。物料在上述比例、用量及反应条件下,制得的聚合物产率最高,聚合物呈白色颗粒状粉末,在图2(a)中清晰可见聚合物呈空间立体网状结构。本发明采用巩义市英峪予华仪器制造厂集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S进行磁力搅拌。

步骤四，用60mL体积比为8∶2的无水乙醇-乙酸提取6h,反复多次用体积比为1∶1的甲醇-水超声洗脱至洗脱液为中性。

具体地，本发明采用昆山市超声仪器有限公司数控超声波清洗器KQ5200DE进行超声洗脱。无水乙醇采用分析纯,天津市大茂化学试剂厂。冰乙酸采用分析纯,天津市大茂化学试剂厂。甲醇-水用于洗脱残留的模板分子和乙酸残留。

步骤五，用甲醇洗脱至LC-MS/MS检测不到吡氟草胺分子为止。

具体地，本发明采用美国应用生物系统公司串联质谱仪API 4000,日本岛津公司液相色谱仪LC 20A。甲醇采用色谱纯,美国Fisher公司。

步骤六，将聚合物置于60℃烘箱中烘干,得到吡氟草胺分子印迹聚合物,置于干燥器中备用。

具体地，本发明采用余姚市远东数控仪器厂电热鼓风干燥箱101-2作为烘箱。

本发明还提供一种采用以上所述的吡氟草胺分子印迹聚合物的制备方法所制备的吡氟草胺分子印迹聚合物的性能表征方法，该性能表征方法，经吸附动力学试验、静态平衡吸附试验和选择性吸附试验，证明了本发明制备的吡氟草胺分子印迹聚合物具有较好的吸附性和较强的选择性。

其中，LC-MS/MS检测的条件如下：

Symmetry C18色谱柱(150mm×2.1mm,3.5μm)；流动相A为水,流动相B为甲醇,分别添加0.1％的甲酸；线性梯度洗脱程序：0-1.5min为20％B,1.5-3min由20％B变为95％B,3-4.5min为95％B,4.5-5min由95％B变为20％B,5-7min保持20％B。流速0.35mL/min,柱温35℃,进样体积10μL。

电喷雾离子源(Electron spray ionization,ESI),正离子扫描；多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)；电喷雾电压Ionspray voltage,IS)5500V；雾化气压力65psi(1psi＝6 894.76Pa)；气帘气压力15psi；辅助气压力65psi；离子源温度550℃；定性离子对、定量离子对、碰撞气能量(Collision energy,CE)及去簇电压(DeclusteringPotential,DP)见表1。

表1吡氟草胺、福美双的质谱参数

吸附动力学试验包括：分别利用吡氟草胺和福美双按照相同方法制备D-MIP(吡氟草胺分子印迹聚合物)和D-NIP(非分子印迹聚合物)。称取20mg的D-MIP和20mg的D-NIP各7份,分别置于10mL塑料离心管中。向塑料离心管中加入10mg/L的吡氟草胺溶液5mL，在30℃下恒温水浴振荡。在10,20,30,40,50,60和80min时，分别同时取出1份D-MIP和D-NIP,离心后取100μL上清液置于100mL容量瓶中。用蒸馏水定容至刻度,取1mL溶液过0.22μm滤膜,供LC-MS/MS测定。以10,20,30,40,50,60和80min时的吸附量Q与吸附时间t作图,绘制吸附动力学曲线，吸附量按下式计算：

式中：Q表示吸附量,单位为μg/g；V表示吡氟草胺溶液的体积,单位为mL；C0表示吡氟草胺的初始浓度,单位为ng/mL；C1表示吸附后吡氟草胺的浓度,单位为ng/mL；W表示D-MIP或D-NIP的质量,单位为mg。

具体地，除了福美双，也可以选择其他的农药化合物作为对比，但是这个化合物必须能够与吡氟草胺化合物的色谱行为相近，用于色谱定量。本发明采用国华企业恒温水浴振荡器SHA-B进行恒温水浴振荡。本发明采用金坛区西城区新瑞仪器厂台式离心机800-1进行离心。

聚合物随着吸附时间的增加,吸附在聚合物表面和孔隙间的吡氟草胺分子数量增多。如图3所示，吸附时间在10-20min之间,吸附速率最快；在20-50min之间,吸附量以比较缓慢的速率持续增大；吸附时间增加到50min时,吸附量达到饱和状态；继续延长吸附时间,吸附量还会出现略微的降低趋势。在吸附前期,吡氟草胺分子迅速附着在聚合物颗粒表面,占据表面的结合位点,随着时间的增加伴随着振荡作用,吡氟草胺分子缓慢地进入颗粒间的孔隙,通过具有“记忆功能”的结合位点,找到适合的位置。随着时间继续延长,到50min时,聚合物表面和颗粒间的位点全部占据,聚合物达到最大吸附量,D-MIP最大吸附量为1350mg/kg,D-NIP最大吸附量为320mg/kg。因为在D-NIP表面和颗粒间缺少了这种“记忆功能”的结合位点,导致其吸附量明显低于D-MIP。

如图4所示,图中(a)和(d)表示20μm；(b)和(e)表示5μm；(c)和(f)表示2μm。D-NIP和D-MIP在放大倍数逐渐增大的情况下,能更清晰发现D-NIP颗粒粒径明显大于D-MIP颗粒粒径,图4(f)中可以看到D-MIP颗粒表面凸凹不平,颗粒间均匀分布大量的孔隙,正因为D-MIP颗粒表面的凸凹结构和孔隙,赋予了它良好的吸附性能和特异选择性。聚合物颗粒的结构分布情况进一步证明D-MIP吸附量明显大于D-NIP。

静态平衡吸附试验包括：称取20mg的D-MIP和20mg的D-NIP各6份,置于10mL塑料离心管中。分别向塑料离心管中加入5mL，浓度分别为2,4,6,8,10和12μg/mL的吡氟草胺标准溶液,在30℃下恒温振荡50min。离心,取100μL上清液置于100mL容量瓶中。用蒸馏水定容至刻度,取1mL溶液过0.22μm滤膜,供LC-MS/MS测定。以吸附量Q与吡氟草胺浓度C作图,绘制等温吸附曲线。

保持50min的吸附时间,验证聚合物在不同浓度吡氟草胺标准溶液中吸附量变化。如图5所示,D-MIP和D-NIP均表现出随着吸附吡氟草胺浓度的升高,吸附量变大的趋势。D-NIP的吸附曲线比较平稳,没有出现吸附量突越的现象,D-MIP结构中印迹孔隙和具有特异吸附性的识别位点与吡氟草胺浓度相匹配,吡氟草胺分子在D-MIP颗粒表面和空隙中迅速占位,当其质量浓度达到8μg/mL时吸附行为达到终点,最大吸附量为1350mg/kg。X-NIP依靠自身的缝隙和疏松的结构也存在一定的吸附行为,饱和吸附量为320mg/kg。

选择性吸附试验包括：取2份20mg的D-MIP置于10mL塑料离心管中。分别加入5mL，浓度10μg/mL的吡氟草胺、福美双水溶液，恒温振荡50min,供LC-MS/MS测定。比较D-MIP对吡氟草胺和福美双的吸附性能率。

在相同的试验条件下,比较D-MIP对吡氟草胺和福美双分子的吸附能力。结果显示：D-MIP对吡氟草胺的吸附量明显高于福美双,为1350mg/kg；其对福美双的吸附量为350mg/kg。再次证明D-MIP结构中形成的“记忆”孔隙和识别位点只与吡氟草胺分子相匹配,与福美双的分子结构不具有识别功能。

综上所述，本发明采用本体聚合法,乙腈为致孔剂,TFMAA为功能单体,EGDMA为交联剂,AIBN为引发剂,制备吡氟草胺的分子印迹聚合物,D-MIP的最大吸附量为1350mg/kg,明显高于D-NIP,具有较好的吸附性和较强的选择性。扫描电镜照片表征了聚合物呈稀松的空间网状结构,颗粒表面粗糙,颗粒之间形成大量的孔隙,佐证了制备的D-MIP具备良好吸附性的原因。本发明还提供一种以上所述的吡氟草胺分子印迹聚合物的制备方法所制备的吡氟草胺分子印迹聚合物，在吡氟草胺的净化提纯，以及食品和环境复杂基质中痕量吡氟草胺残留的研究方面的应用，可以利用D-MIP良好的吸附性能和选择性进一步研究食品和环境等复杂基质中吡氟草胺的提取、纯化、残留量等工作。

以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。