基于木霉-芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液的生物种衣剂及其制备方法
阅读说明：本技术 基于木霉-芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液的生物种衣剂及其制备方法 (Biological seed coating agent based on trichoderma-bacillus sequential inoculation symbiotic culture fermentation broth and preparation method thereof ) 是由 陈捷 刘鹏 王新华 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于木霉-芽孢杆菌顺序接种共生培养发酵液的生物种衣剂及其制备方法。根据合成生物学原理,将诱导抗病和抗逆性等特点的木霉菌与拮抗病原菌和促进作物生长等特点的芽孢杆菌通过分阶段接种共发酵技术制备共生菌液,该共生菌液不仅满足两类孢子含量的平衡,同时具有还含有两种微生物相互作作特异诱导的成分。共生菌液与硅藻土和芸苔素内酯按比例混合制备粉剂型生物种衣剂,该生物种衣剂含较高含量孢子、拮抗性和促进生长等物质,明显提高玉米、小麦、水稻等作物生长和抗病和抗逆能力,是粮食作物种子益菌化处理的新技术。(The invention discloses a biological seed coating agent for inoculating symbiotic culture fermentation broth based on a trichoderma-bacillus sequence and a preparation method thereof. According to the synthetic biology principle, trichoderma which induces the characteristics of disease resistance, stress resistance and the like, and bacillus which antagonizes pathogenic bacteria and promotes the growth of crops and the like are inoculated in stages to prepare symbiotic bacteria liquid by a co-fermentation technology, and the symbiotic bacteria liquid not only meets the balance of the contents of two types of spores, but also contains components which are specifically induced by the interaction of two types of microorganisms. The symbiotic bacteria liquid, diatomite and brassinolide are mixed in proportion to prepare the powder type biological seed coating agent, the biological seed coating agent contains substances with high spore content, antagonism, growth promotion and the like, the growth, disease resistance and stress resistance of crops such as corn, wheat, rice and the like are obviously improved, and the method is a new technology for the beneficial bacteria treatment of grain crop seeds.)
技术领域
本发明涉及一种基于木霉菌-芽孢杆菌共生培养(共发酵)的生物种衣剂制备技术及应用，主要通过共发酵技术制备共生菌液，以硅藻土吸附菌液、以芸苔素内酯为助剂制备干粉剂型生物种衣剂。该生物种衣剂具有较高含量木霉菌及芽孢杆菌活孢子数、抗菌肽、吲哚乙酸等，因此具有较强的诱导作物抗病性和促进作物生长功能等特点。
背景技术
化学种衣剂是我国目前粮食作物生产中应用最为普遍的防治土传病害与地下害虫、促进作物长、提高抗逆性的农化制剂。随着我国对农业生产中的农药和化肥“双减”计划的实施，种衣剂需要向绿色化和生态化方向发展。实践证明微生物种衣剂是实现种子益菌化的重要途径。微生物种衣剂一方面可以减少传统农药对土壤的危害，还可改良作物土壤菌群结构，促进作物增长。但至今微生物种衣剂主要有效菌种单一，菌种孢子抗逆性和活性差，菌种代谢物利用不充分，防效和促生作用不稳定等问题，因此开发利用多菌组合种衣剂对提高生物种衣剂质量和功效具有重要意义。
木霉作为国际上公认的生防菌之一，对土壤土传病害、土壤农业化污染具有良好的防治及修复效果。木霉菌可以产生疏水蛋白、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗性次生代谢物等生物防治病害的相关物质(陈捷木霉菌诱导植物抗病性研究新进展[J],中国生物防治,2014,31(5)733-741)，国际已开发有单一木霉菌类生物种衣剂(Nayaka S.C，etal.Seed biopriming with novel strain of Trichoderma harzianum for thecontrol of toxigenic Fusarium verticillioides and fumonisins in maize Archivfür Pflanzenschutz.2010,264-282)，主要用于玉米生产。芽孢杆菌作为国际公认的生防菌之一，主要用于叶部病害生物防治和促生作用，分泌蛋白类、脂肽类及其次级代谢产物等拮抗物质及IAA和IBA等促生物质。单一木霉菌与芽孢杆菌制剂目前在防治作物病害、促进作物生长中较为常见，但使用过程中单一菌株应用的缺点逐渐显露，如木霉菌对土传病害防效明显，但菌剂抗逆性差；芽孢杆菌对叶部病害防效明显，抗逆性强，但诱导作物抗病和抗逆性不如木霉菌，为此国内外很多厂家仅是将木霉菌和芽孢杆菌分别发酵，然后混配制备成复合制剂，但仍不能解决目前国内外产品木霉菌和芽孢杆菌产品趋同性的难题。随着合成生物的学的发展，木霉菌和芽孢杆共发酵技术成为研究热点，真菌和细菌通过共发酵过程中的相互作用，诱导产生了一系列新的初生和次生代物质，为制备新型生物种衣剂提供了物质基础，因此本研究基于木霉菌和芽孢杆菌的共发酵技术的新型生物种衣剂创制技术对于提高我国生物种衣剂创新水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉-芽孢杆菌共生型生物种衣剂制备技术及应用方法。本发明技术重点是利用已筛选获得的木霉菌-芽孢杆菌亲和组合通过建立的顺序接种法进行共发酵获得高含量木霉和芽孢杆菌孢子、抗菌肽(丙甲菌素等)和生长调节物质(吲哚乙酸等)的发酵液，并通过硅藻土的吸附制备成两菌共生型生物种衣剂，从而提生物种衣剂对作物生长和病害防治的效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1、木霉-芽孢杆菌共生培养的生物种衣剂制备技术，包括如下步骤：
S1.制备木霉-芽孢杆菌共生发酵液；
S2.制备木霉-芽孢杆菌共生发酵液与硅藻土、芸苔素内酯混合；
S3.检测粉剂型生物种衣剂质量
2、在步骤S1中，利用共发酵技术，提高木霉菌-芽孢杆菌互作代谢水平，同时保持相当水平的两类菌的孢子数量。
作为优选方案，步骤S1中，共发酵菌液的制备方法为：
将木霉菌株接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养5天后，利用5mm打孔器打孔，接种于PD培养基中，在PD培养基培养3天，较菌物转接种于发酵罐共生培养中28℃发酵48h，通气量0.8～1vvm，pH为5.0～5.6，转速为120rpm。
将芽孢杆菌接种在LBA培养基中，在在30℃条件下培养2天后，利用5mm打孔器打孔，接种于LB培养基中30℃培养2天。将芽孢菌液转接种于上述已发酵2天木霉发酵液(共生培养基)中，共发酵通气量1～1.3vvm，利用氨水调整发酵培养pH为4.5～5.5，转速为140rpm。发酵时按照共发酵时间范围45～50h，当芽孢杆菌孢子形成85％，木霉菌厚垣孢子形成90％，抗菌肽丙甲菌素达到范围0.1～0.5μg/L和吲哚乙酸达到2000～2500μg/L时发酵完成，下罐。
作为优选方案，步骤S2所述木霉菌-芽孢杆菌共发酵液与硅藻土、芸苔素内酯混合干燥方法为：
共发酵培养完成后，利用离心机固液分离，将富集的混合孢子按照质量比(孢子：硅藻土:0.1％芸苔素内酯＝25％:60％:15％)均匀混合，在孢子干燥机中(温度45-48℃)，烘干至水分为5％，过80目筛,制得木霉菌-芽孢杆菌-芸苔素内酯干粉生物种衣剂。
作为优先方案，步骤S3，采用稀释平板法检测共生菌粉,木霉孢子含量为0.8-1.5×108cfu/g，芽孢杆菌孢子含量为2.0-5.0×109cfu/g,抗菌肽(丙甲菌素)含量0.1039μg/L，吲哚乙酸含量2159.53μg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、木霉-芽孢杆菌共生发酵液与单独木霉发酵液相比具有较高含量的丙甲菌素、吲哚乙酸含量；需要指出的是，与现有技术所采用的共培养不同的是，本案为共生发酵，由此可以克服共培养导致的微生物间的拮抗或是竞争效应，而导致其中某一个微生物的生长。
2、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂相较于液体种衣剂，具有更为稳定的孢子含量；
3、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂具有比单一木霉菌或芽孢杆菌及两者分加发酵简单组合更高防治病害和促进作物生长的功能。
附图说明
：图1表示种衣剂对小麦出苗率的影响；
图2表示木霉菌-芽孢杆菌共生型种衣剂对小麦赤霉病防效的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
按照本发明方法，制备基于木霉菌-芽孢杆菌共发酵技术的生物种衣剂，具体步骤如下：
1、木霉菌和芽孢杆菌平板培养：将木霉接种在PDA培养基中，在28℃条件下培养3天。将芽孢杆菌接种在LBA培养基中，在30℃条件下培养2天。
PDA培养基：200g马铃薯去皮切块后蒸煮，取上层清液，加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌30min。
PD培养基：200g马铃薯去皮切块后蒸煮，取上层清液，加入20g葡萄糖，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶，121℃高压灭菌30min。
LBA培养基：取5g酵母提取物，10g氯化钠，10g胰化蛋白胨，20g琼脂粉，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。
LB培养基：取5g酵母提取物，10g氯化钠，10g胰化蛋白胨，去离子水定容至1L，分装至250mL三角瓶NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。
3、制备木霉-芽孢杆菌共发酵培养基：按照浓度20g/L玉米粉、20g/L酵母浸出粉、20g/L糖蜜，使用氢氧化钠将pH标定至6.0～6.5。
4.顺序接种与共发酵过程调控：在300L发酵罐中，对发酵罐培养基进行灭菌，灭菌标准为121℃，30min，灭菌完毕，接入木霉种子液共生培养基中(1％v/v)，按照通气量1vvm，转速180rpm，温度为28℃进行发酵，发酵40小时，利用氨水调整发酵培养pH为4.5～5.5，将芽孢杆菌种子液接入发酵液中(2.0％v/v)，共同发酵48小时，待芽孢杆菌形成孢子率达到85％，木霉菌厚垣孢子形成率达到90％，下罐。
5、检测共发酵质量:检测木霉-芽孢杆菌共发酵上清液与木霉发酵上清液分别进行吲哚乙酸、丙甲菌素含量检测。共发酵上清液丙甲菌素含量为0.1039μg/L，吲哚乙酸含量为2159.53μg/L，显著高于木霉菌单独发酵上清液及芽孢杆菌单独发酵上清液，共发酵液抗菌肽(丙甲菌素)及吲哚乙酸含量显著高于单独发酵液(如表1)。
6.木霉-芽孢杆菌共生干粉种衣剂制备
共发酵培养完成后，利用离心机固液分离，将富集的混合孢子按照质量比(孢子：硅藻土:0.1％芸苔素内酯＝3:6:1)均匀混合，在孢子干燥机中(温度45℃)，烘干至水分为5％，过80目筛,制得木霉菌-芽孢杆菌-芸苔素内酯干粉生物种衣剂。
表1、木霉菌-芽孢杆菌共发酵与木霉单独发酵上清液中丙甲菌素、吲哚乙酸含量分析
实施例2
按照本发明的方法，田间检测木霉菌-芽孢杆菌共生型生物种衣剂促生效果
试验地点：河南驻马店农科院
试验步骤：
1、田间试验材料准备
品种：济麦22小麦裸种、济麦22
生物种衣剂：木霉菌-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂
化学种衣剂：90％噻虫嗪、8.5％戊唑醇、1.5％成膜剂(对照)
2、在利用化学种衣剂((药种比＝1：200)、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂拌种(药种比＝1：100)
3、种植20天后调查各处理对小麦出苗的影响。
4、共生型生物种衣剂与空白相比，出苗率产生极显著差异，对小麦出苗率的影响与化学种衣剂相近或超过化学种衣剂的使用效果(如图1所示，需要说明的是，图1中的数据为5次重复的平均值及其标准误差。**：单因素方差分析差异极显著，0.01<P＜0.001。)。
实施例3
按照本发明方法，田间验证木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂防治玉米土传病害效果
试验地点：沈阳农业大学校农场
试验步骤：
1、田间试验材料：
2、品种：郑单958裸种、郑单958
3、生物种衣剂：木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂；药种比＝1:100
4、化学种衣剂：90％噻虫嗪、8.5％戊唑醇、1.5％成膜剂；药种比＝1:200
5、种植方式：穴播，4000株/亩；
6、病原菌接种：播种时按5％接种量土壤接种茎腐病镰孢菌(Fusariumgraminearum)和纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，7月中下旬，采用下部叶鞘接种带菌麦粒法接种纹枯病菌；8月上旬牙签法在果穗上接种穗腐病镰孢菌(Fusariumverticilloides)。
防效调查与测产：
1、在乳熟期，每个处理对角线5点调查，每点随机取4垄，每垄随机调查50株，调查各处理的病株率(包括倒伏率)、统计茎腐病田间防效。
2、在乳熟期，每个处理对角线5点调查，每点随机取4垄，每垄随机调查50株，调查各处理的病株率和每株病级，统计玉米纹枯病病情指数和田间防效。
其中，玉米纹枯病病情指数如表2所示。
表2、玉米纹枯病分级标准
3、在乳熟期，每个处理随机取4垄，每垄随机取10穗，剥去苞叶，逐个调查记载果穗发病级别，统计病情指数和果穗防效，其中玉米果穗发病级别标准参见表3。
表3、玉米穗腐病分级标准
4、测产方法
在收获期，每个处理5点取样调查10平方米的植株，取每点10-20株拷种，分别测定玉米穗数、千粒重，收获时籽粒的含水量。记录每小区产量，计算每亩产量，计算和空白对照(所述空白对照是指未施加木霉-芽孢杆菌共生型干粉种以及化学种衣剂)相比的增产率。
5、田间试表明：木霉菌-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂的可有效降低茎腐病的发生、增产效果明显(结果参见表4)。
表4、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂对玉米茎腐病的防治效果及增产情况
木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂对玉米纹枯病具有较好的防治效果和增产效果(结果参见表5以及表6)
表5、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂对玉米纹枯病的防治效果及增产情况(地块1)
木霉-芽孢杆菌共生型种衣剂包衣可提高对穗腐病的防治效果和增产率(表6)。
表6、木霉-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂对玉米纹枯病的防治效果及增产情况(地块2)
实施例4、木霉菌-芽孢杆菌共生型种衣剂子对小麦赤霉病防效的影响
1、试验地点：上海交通大学(闵行校区)农场
2、供试材料：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-22，深绿木霉菌(Trichoderma atroviride)SG3403，禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。小麦品种宁麦13。
2、干粉和液体种衣剂的制备：将共生菌液、成膜剂、水以8:1:1的比例混合制成液体种衣剂，即将共生菌液与滑石粉按1:5(ml:g)的比例混合，放40℃烘箱烘5-6小时制成干粉种衣剂。
3、小麦赤霉病禾谷镰孢菌(F.graminearu)摇瓶培养的时间至7天左右(2x108cfu/L)。
4、按照有机育苗基质：蛭石＝3：l(V/V)的比例配置花盆土。向花盆(高×直径：27cm×23cm)内装配置好的基质。然后播种包衣过的小麦种子(宁麦13)，每盆播种10粒种子,覆土厚度1cm。
5、播种14-21天后，每盆随机抽取三株调查小麦的株高和鲜重。待到小麦扬花期，将小麦赤霉病菌孢子悬浮液接种物稀释50倍(1x107cfu/L)，喷施到小麦植株上。加湿器高度保湿，20天后观察赤霉病发病情况，调查病情指数及防效。图1显示了不同的种衣剂处理对小麦出苗率的影响
6、图2表示木霉菌-芽孢杆菌共生型种衣剂对小麦赤霉病防效的影响，由图2表明：单一芽孢杆菌，单一木霉菌以及木霉菌-芽孢杆菌共生型干粉种衣剂处理后的小麦对赤霉病的防治效果分别达到：28.4％，13.4％和66.2％(即图中的干粉种衣剂的d、cd以及b所标图柱)，由此可以看出，共培养处理后的小麦对赤霉病的防效要显著高于其他处理。
单一芽孢杆菌，单一木霉菌，木霉菌-芽孢杆菌共生型液体种衣剂处理后的小麦对赤霉病的防治效果分别为：10.9％，20.4％和45.2％(即图中的液体种衣剂的c、d以及a所标图柱)，共培养处理后的小麦对赤霉病的防效要显著高于其他处理。
需要说明的是，其中图2中的B表示单一培养芽孢杆菌；T：单一培养木霉菌；BT：木霉菌-芽孢杆菌共生型种衣剂，而且上述防治效果的数值显著性差异P＜0.05。
本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
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