具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本文中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”、等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。

本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

第一方面，本发明提供一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185，该菌株已于2021年5月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61671。

米曲霉3.042作为国内酱油行业通用菌种，对国内酱油行业的机械化、规模化发展起到的重要的推动作用，但该菌株开发时间久远，行业的持续发展需要更多优良菌株的筛选及推广。本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185 是由常压室温等离子体诱变获得的，该菌株与出发菌株沪酿3.042相比，其具有明显糖化力高的特点。本发明提供的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185容易培养，在小麦、大米、麸皮、黄豆等原料制曲时与出发菌株3.042相比不需要特殊处理，具有较好的菌株替代性。

本发明利用常压室温等离子体诱变技术对出发菌株米曲霉沪酿3.042进行诱变，从而获得一株高糖化活力诱变菌株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)ZA185，该菌株具有糖化力高的特点，并且遗传稳定性好。将该诱变菌株制备的熟麦曲用于黄酒发酵，特别是与传统自然接种麦曲(生麦曲)搭配用于黄酒发酵，可较明显加快黄酒发酵速率，提升还原糖含量，并且氨基酸含量也得到提升。将该诱变菌株制备的豆曲应用于酱油发酵，可提升酱油中的还原糖含量，并且其他内容物(例如总酸、氨基氮、全氮)也有所提升，同时酱油发酵原油的咸涩味有改善，口感协调性较好，对原油品质提升有一定效果。

第二方面，本发明提供一种熟麦曲的制备方法，所述制备方法包括以如上所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185为发酵菌进行制曲的步骤。

可以理解的是，本发明对制曲的条件、制曲曲料配方、制曲中发酵菌的接种浓度不做特别限定，适宜于米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185即可。在制曲的过程中：制曲温度可以控制在28℃～32℃，例如可以为28℃、29℃、30℃、 31℃、32℃；制曲时长可以控制在36小时～40小时，例如可以为36小时、37 小时、38小时、39小时、40小时；制曲曲料的制备原料包含小麦和水，小麦和水的质量比可以为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，例如可以为0.8:1.2、1.2:0.8、1:1；所述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185可以以种曲的形式加入到上述制曲曲料中，接种浓度可以控制在0.2％～0.5％，例如可以为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％。

第三方面，本发明提供如上所述的制备方法制备的熟麦曲。

第四方面，本发明提供一种黄酒的制备方法，所述制备方法包括以麦曲为糖化发酵剂进行发酵的步骤，所述麦曲包含如上所述的熟麦曲。

本发明提供的黄酒的制备方法，可以加快酒发酵速度，提升原料利用率及提升黄酒品质。

可以理解的是，本发明对黄酒的发酵工艺不做特别限定，可以采用任意适宜于米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185的发酵工艺。发酵的过程中：发酵的温度可以控制在15℃～25℃，例如可以为15℃、20℃、25℃；发酵的时长可以控制在22天～27天，例如可以为22天、23天、24天、25天、26天、27天；发酵所采用的培养基成分主要包含谷物和水，所述谷物和所述水的质量比可以1：(1.5～2.5)，例如可以为1:1.5、1:2.0、1:2.5。本发明对所述谷物的具体种类不做特别限定，可以为稻米、黍米、玉米、小米、小麦或者不同种类的组合。

在其中一个示例中，所述麦曲还包含生麦曲。全部使用纯种熟麦曲酿造的黄酒在风味上与传统黄酒存在差异。为减小这种差异，在生产中主要采用在传统自然接种生麦曲的基础上，添加部分机械化制备的熟麦曲，提升发酵体系中的糖化酶、蛋白酶活力，以实现既保证酶活又尽量保留传统黄酒风味。

本发明对所述熟麦曲和所述生麦曲的质量比不做特别限定，适宜于黄酒发酵即可。优选地，所述熟麦曲和所述生麦曲的质量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，例如0.8:1.2、1.2:0.8、1:1。

第五方面，本发明提供如上所述的制备方法制备的黄酒。

第六方面，本发明提供一种豆曲的制备方法，所述制备方法包括以如上所述的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185为发酵菌进行制曲的步骤。

可以理解的是，本发明对制曲的条件、制曲曲料配方、制曲中发酵菌的接种浓度不做特别限定，适宜于米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185即可。在制曲的过程中：制曲曲料的制备原料包含小麦和黄豆，小麦和黄豆的质量比可以为(2.0～4.0)：(6.0～8.0)，例如可以为4:6、2:8、3:7；制曲温度可以控制在 28℃～40℃，例如可以为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃；制曲时长可以控制在40小时～48小时，例如可以为40小时、42小时、44小时、46 小时、48小时；所述米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)ZA185可以以种曲的形式加入到上述制曲曲料中，接种浓度可以控制在0.1％～0.3％，例如可以为0.1％、 0.2％、0.3％。

第七方面，本发明提供如上所述的制备方法制备的豆曲。

第八方面，本发明提供一种酱油的制备方法，所述制备方法包括以豆曲为糖化发酵剂进行发酵的步骤，所述豆曲包含如上所述的豆曲。

本发明提供的酱油的制备方法，酱油中的还原糖含量高。

可以理解的是，本发明对发酵的方式不做特别限定，例如发酵的方式可以采用高盐稀态发酵。采用高盐稀态发酵的过程中，所述豆曲和食盐水的质量比可以控制在1：(1.5～2.5)，例如1:1.5、1:2.0、1:2.5。

第九方面，本发明提供如上所述的制备方法制备的酱油。

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

实施例一：米曲霉菌株诱变育种与筛选

1、材料准备

菌株：沪酿3.042，苏16，保藏于本公司菌种保藏中心。

筛选培养基：高氏1号培养基，包含可溶性淀粉10克、磷酸二氢钾0.3克、硫酸镁1克、氯化钠0.5克、琼脂20克和脱氧胆酸钠1克，蒸馏水1000克， pH7.2～7.4。

发酵培养基：250mL的三角瓶，装料量为麸皮30g、水30mL，自然pH， 121℃灭菌20min。

2、米曲霉菌株诱变与筛选

2.1孢子悬浮液的制备

取培养5天的沪酿3.042斜面，用生理盐水洗下孢子，将孢子打散后过滤得到孢子悬浮液，用血细胞计数板计数，调节孢子数约为10⁶个/mL，用无菌生理盐水稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍备用。

2.2常压室温等离子体诱变(ARTP)

将孢子悬浮液10μL，置于ARTP诱变装置中，诱变时间分别为10秒、20 秒、60秒、80秒、120秒、150秒、180秒、200秒，处理0秒作为对照，处理结束后用生理盐水进行洗脱，适当稀释后取100μL涂平板，30℃培养箱中倒置培养3天，计算致死率。

致死率＝(对照平板菌落数-诱变平板菌落数)/对照平板菌落数×100％

2.3菌株初筛及复筛

初筛：将稀释涂平板法分离到的纯菌种分别接种于筛选培养基平板。涂布碘液于平板上，如菌落的周围呈现透明圈时则表明菌种产生糖化酶。透明圈的大小表示酶活的强弱，用游标卡尺分别测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，计算两者比值(H/C)，比值大可初步判断糖化酶浓度高。

复筛：将初筛挑选菌株接种于发酵培养基上，充分摇匀，置于28℃恒温箱中培养，在10小时以前堆积培养，10小时后摊平，待表面长满菌丝，结成块状时“扣瓶”，继续培养，待长满菌丝即培养完成。成曲在40℃～45℃烘干24小时至水分低于10％，检测糖化力。

糖化力测定：参照国标《GB/T 8276-2006食品添加剂糖化酶制剂》。

蛋白酶活力测定：参照国标《GB/T 23527-2009蛋白酶制剂》。

将经复筛获得的高糖化力米曲霉菌株，制备沙土管保藏。

不同诱变菌株糖化力对比见下表：

表1、沪酿3.042、苏16与诱变菌株糖化酶活检测结果

由上表可知，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185的糖化力较出发菌株沪酿3.042提升18.5％，较苏16高33.3％，糖化力优势较明显。

该米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185菌株已于2021年5月18日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼 5楼，保藏编号为GDMCCNo:61671。该菌株于2021年5月18日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年5月19日检测为存活菌株。

实施例二：米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185的遗传稳定性检测

将米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185在豆汁斜面培养基上连续培养10代，分别取第1代、5代、10代斜面种，按照实施例1“复筛”项下，制备麸曲，检测其糖化力、酸性蛋白酶活力，评估其菌种遗传稳定性，具体检测结果见下表：

表2、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185不同代遗传稳定性检测结果

由上表可知，各代种曲糖化力、酸性蛋白酶活力指标稳定，表明米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185遗传稳定性良好，适合进行工业化生产使用。

实施例三、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185熟麦曲制备

采用小麦为原料，加入等倍质量的自来水润粮，0.1MPa压力下蒸煮30分钟，制备曲料。待曲料冷却后接入0.3％种曲，以上述获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185为试验菌株，以黄曲霉苏16、米曲霉沪酿3.042为对照菌株，按照常规通风制曲工艺制备熟麦曲。制曲温度为28℃～32℃，制曲时间为36小时～40 小时，制曲结束取成熟曲料检测糖化酶活力和酸性蛋白酶。

表3、不同菌株制备麦曲糖化酶活力和酸性蛋白酶检测结果

从制曲过程观察：米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185对培养温度、生产工艺要求与出发菌株沪酿3.042基本一致，不需要对生产工艺做明显改动。同时，该菌株在小麦为原料时生长依然良好，对麸皮、小麦等原料的适应性良好，而小麦制曲的酶活稍微低于麸皮制曲。

实施例四、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185所制麦曲用于黄酒发酵

按照黄酒生产工艺，以传统自然接种制备的生麦曲(即砖曲)为对照，以砖曲+机械化制备熟麦曲(实施例三制备)混合使用(质量比1:1)为试验组，比较米曲霉(Aspergillusoryzae)ZA185、苏16和沪酿3.042在黄酒生产使用中的实际效果。

黄酒发酵大米：水的料水比(质量比)为1:2.0，周期固定为25天，发酵结束压榨酒醪检测酒精度、还原糖、总酸、氨基氮等指标，具体方案及检测结果见下表：

表4、不同酒曲方案酒液检测结果(g/L)

通过观察黄酒发酵过程，添加传统熟麦曲方案起酵速度加快，最终酒精度较使用传统砖曲方案有一定提升，酒液中的残糖稍高，大米原料利用更加彻底，提升经济价值。同时，由于发酵速度加快，环境中杂菌繁殖减少，黄酒发酸风险降低。而因为熟麦曲的蛋白活力更强，发酵黄酒的氨基氮水平有明显提升，对提升黄酒的内容物和加速陈化均有一定帮助。

实施例五、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185用于制备酱油用豆曲

以黄豆、小麦为原料，按照一定比例混合后接种米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185种曲，按照正常制曲工艺在圆盘中进行通风制曲，制曲结束检测其孢子数、糖化力、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等指标，具体见下表：

表5、不同菌株制备豆曲指标

由上表看出，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185制曲的糖化力具有提升23％，效果明显。

实施例六、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185豆曲用于酱油发酵

将实施例五制备的豆曲，按照1:2比例(质量比)添加高浓度盐水进行高盐稀态发酵，发酵过程操作、温度控制按照常规生产工艺执行。

原油发酵结束后，酱醪进行压榨获得原油，原油指标检测结果见下表：

表6、发酵原油检测指标

由上表可知，使用米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185豆曲用于酱油发酵，可明显提升发酵原油中的还原糖含量，其他内容物有一定提升。

经感官鉴评，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA185菌株发酵原油咸涩味有改善，口感协调性较好，对原油品质提升有一定效果。

综上，本发明利用常压室温等离子体诱变技术对出发菌株米曲霉沪酿3.042 进行诱变，从而获得一株高糖化活力诱变菌株米曲霉菌(Aspergillus oryzae) ZA185，该菌株具有糖化力高的特点，并且遗传稳定性好。将该诱变菌株制备的熟麦曲用于黄酒发酵，特别是与传统自然接种麦曲(生麦曲)搭配用于黄酒发酵，可较明显加快黄酒发酵速率，提升还原糖含量，并且氨基酸含量也得到提升。将该诱变菌株制备的豆曲应用于酱油发酵，可提升酱油中的还原糖含量，并且其他内容物(例如总酸、氨基氮、全氮)也有所提升，同时酱油发酵原油的咸涩味有改善，口感协调性较好，对原油品质提升有一定效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。