一种胶质芽孢杆菌的培养方法
阅读说明：本技术 一种胶质芽孢杆菌的培养方法 (Culture method of bacillus mucilaginosus ) 是由 姜红军 李建全 王姗姗 陈相辉 邱彦国 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公布了一种胶质芽孢杆菌的培养方法,包括以下步骤：菌种活化——种子液培养——转接发酵培养基——发酵罐发酵——活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定——后处理喷雾干燥方法处理发酵液。碳和氮是构成细胞骨架的重要元素,也是细菌代谢产物的重要骨架的构成元素,同时还是微生物生长的能量来源。因此,不同的碳源种类和浓度对菌体的生长和芽孢的形成往往会有不同的影响,本发明碳源选用糖蜜相比于其他碳源更有利于生成芽孢。本发明选用0.05%MgSO4·7H2O更有利于菌体培养。在发酵培养基中添加低浓度的表面活性剂TX10对胶质摇瓶发酵有微弱促进作用。经本发明处理的菌种发酵液菌量可达到700×10～(8)CFU/mL,显著提高了产品的菌量,对于降低生产成本具有显著经济效益。(The invention discloses a method for culturing bacillus mucilaginosus, which comprises the following steps: the fermentation broth is treated by a strain activation-seed liquid culture-transfer fermentation medium-fermentation tank fermentation-viable count determination according to a conventional plate counting method or an absorbance method-post treatment spray drying method. Carbon and nitrogen are important elements that make up the cytoskeleton and are also important building blocks for bacterial metabolites, and are also energy sources for microbial growth. Therefore, different types and concentrations of the carbon source have different influences on the growth of the thalli and the formation of spores, and the carbon source selected from molasses is more favorable for generating the spores than other carbon sources. The invention selects 0.05 percent MgSO4 & 7H2O to be more beneficial to thallus culture. In thatThe addition of the surfactant TX10 with low concentration in the fermentation medium has weak promotion effect on colloid shake flask fermentation. The bacterial quantity of the strain fermentation liquor treated by the method can reach 700 multiplied by 10 8 CFU/mL, obviously improved the bacterial load of product, have apparent economic benefits to reducing production cost.)
技术领域
本发明涉及微生物制备
技术领域
，特别涉及一种胶质芽孢杆菌的培养方法。背景技术
胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus) 作为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的重要菌种之一，可以分解含钾矿物中的硅酸盐等物质并释放出钾离子，因而俗称钾细菌。因其功能上的多样性，在很多领域得到了广泛的应用。在农业领域中，胶质芽孢杆菌能够将环境中的分子氮转化为可供植物利用的化合氮，以及分泌生长素等物质来缩短农作物的生长周期，因而常被添加进农作物肥料中； 在工业生产方面，胶质芽孢杆菌能够通过细胞外形成的有机酸分解铝硅酸盐矿物，普遍用于生物浸矿和冶金等领域；在环境保护方面，胶质芽孢杆菌因具备良好的絮凝活性，因此在污水处理等领域有出色的应用价值。
目前国内大多胶质芽孢杆菌肥料生产还在延续之前的老发酵工艺，一是发酵菌量偏低，一般仅5亿/ml左右，二是发酵后发酵液直接吸附或液体灌装的生产模式，无快速有效的后处理工艺，导致该菌产品菌量偏低，质量也不稳定，严重制约了该产品的销售和应用。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种胶质芽孢杆菌的培养方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种胶质芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定步骤（3）或（4）得到的发酵液；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min；
（6）后处理喷雾干燥方法处理发酵液；
进一步的，步骤（1）中斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4；0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
进一步的，步骤（2）中种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5% CaCO3；pH 7.5。
进一步的，步骤（3）中碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.0005% FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5。
进一步的，步骤（3）中向发酵培养基中加入0~0.1%表面活性剂TX10。
与现有技术相比，本发明的有益之处为：
1、碳和氮是构成细胞骨架的重要元素，也是细菌代谢产物的重要骨架的构成元素，同时还是微生物生长的能量来源。因此，不同的碳源种类和浓度对菌体的生长和芽孢的形成往往会有不同的影响，本发明碳源选用糖蜜相比于其他碳源更有利于生成芽孢。添加Mn、B、Zn、Cu和 Mo等微量元素对胶质芽孢杆菌生长有一定影响，低浓度时有促进作用，而高浓度时有抑制作用，本发明选用0.05% MgSO4·7H2O更有利于菌体培养。在发酵培养基中添加低浓度的表面活性剂TX10对胶质摇瓶发酵有微弱促进作用。
2、经本发明处理的菌种发酵液菌量可达到700×108CFU/mL，显著提高了产品的菌量，对于降低生产成本具有显著经济效益。
具体实施方式
具体实施方式仅为本发明部分实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化 或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
实施例1
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5。
pH值可以影响细胞膜通透性和稳定性，并影响物质的溶解和电离，这些因素都会影响菌体对营养物质的吸收，进而影响其生长。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min；
（6）后处理喷雾干燥方法处理发酵液：
上述步骤产生的胶质芽孢杆菌应为产夹馍多糖，导致发酵液较粘稠，造成喷雾干燥粘塔等现象导致喷雾干燥失败，本方法先对发酵液进行处理，降低发酵液粘度，增加液体表面张力，以此来保证喷雾干燥正常。
喷雾干燥具体方法为：
根据发酵液量加入重量比0.5%的吐温80及5%的轻质碳酸钙，开启搅拌搅拌均匀，并将升温至40℃开始进行喷雾干燥。喷雾干燥进风温度为170~180℃，出风温度为75~80℃，发酵液可征程喷雾干燥，最终得到菌粉菌量约560亿/g。
步骤（5）检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为5.71。
实施例2
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5，0.01%表面活性剂TX10。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min。
检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为5.72。
实施例3
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5，0.05%表面活性剂TX10。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min。
检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为5.79。
实施例4
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5，0.1%表面活性剂TX10。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min。
检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为5.89。
实施例5
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5，0.2%表面活性剂TX10。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min。
检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为5.75。
实施例5
配置斜面培养基:0.12%硅酸铝钾；0.5%蔗糖；0.2%Na2H PO4； 0.0005% FeCl3；0.05% MgSO4•7H2O；2.0% 琼脂；pH 7.5。
配置种子培养基:1%糖蜜；0.05% K2HPO4；0.05% MgSO4•7H2O；0.02% NaCl；0.5%CaCO3；pH 7.5。
配置发酵培养基：碳源；氮源；0.1~0.3% K2HPO4；0.02% NaCl 0.1% MgSO4•7H2O；0.05‰ FeCl3；0.1~0.7% CaCO3；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糖蜜；氮源为豆梢、酵母膏、蛋白胨；pH 7.3~7.5，0.3%表面活性剂TX10。
接着进行菌种培养,培养步骤如下:
（1）菌种活化
将胶质芽孢杆菌接种于斜面培养基进行活化，温度控制在32℃，培养24-32小时，得到活化斜面种子；
（2）种子液培养
用接种环取步骤（1）得到的活化菌种, 接入装有种子培养基的 500 ml三角瓶中,31-33℃ 、200 r /m in摇瓶培养8-12小时，得种子液备用；
（3）转接发酵培养基
培养工艺参数为：种子液接种量为7～9％，250mL三角瓶装液量为30～60mL， 初始pH为7.0～7.5，发酵温度为37℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为40～48h；
（4）发酵罐发酵：或将步骤(3)获得的种子液接种到液体发酵培养基中，用机械搅拌式发酵罐进行发酵。具体的, 发酵罐预先空消1小时，装发酵培养基，再灭菌，灭菌条件为121～125℃，灭菌时间30～35分钟，待发酵培养基冷却至30～35℃，接种，接种量为1.7～1.9%；1吨发酵罐中发酵培养基的量为800～850L，发酵温度为37℃，搅拌速度为150～250转/分钟，通气量1～5立方/分钟，培养20～24小时，得到发酵液；
（5）活菌数按常规平板计数法或吸光度法测定；检测芽孢数前, 将菌液在80℃预处理20min。
检测结果表明，胶质芽孢杆菌的吸光度平均值（OD600）为1.4。
本发明属于微生物的培养，以上实施例所用的菌种为枯草杆菌属细菌( BacillusSubtilis)1株，从健康猪肠道按照常规稀释平板分离法选育获得，以上碳源均选用糖蜜。经本发明处理的菌种发酵液菌量可达到700×108CFU/mL，显著提高了产品的菌量。