提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及应用
阅读说明：本技术 提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及应用 (Additive for improving oocyte in-vitro maturation quality, culture method and application ) 是由 蔡更元 梁雅琳 李紫聪 吴珍芳 招华兴 李亚楠 张贤君 张宇星 郑恩琴 杨化强 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂,通过向体外卵母细胞培养液中添加PF4蛋白添加剂来提高卵母细胞体外培养的质量。通过提高卵母细胞体外培养的质量,进而应用在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆技术、孤雌胚胎领域上。一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟,并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎,有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究,进一步推进生产实践的发展。(The invention discloses an additive for improving the in vitro maturation quality of oocytes, which improves the in vitro culture quality of the oocytes by adding a PF4 protein additive into an in vitro oocyte culture solution. The method is further applied to the fields of oocyte in-vitro maturation, somatic cell cloning technology and parthenogenetic embryo by improving the quality of oocyte in-vitro culture. On one hand, the in vitro maturation of oocytes of various species can be promoted, in vitro fertilized embryos and cloned embryos with better quality can be prepared, and the in vitro maturation culture of oocytes for human assisted reproduction is facilitated; on the other hand, the prepared high-quality embryo and the animal produced by the high-quality embryo are used for research in the fields of medicine, life science, animal husbandry and the like, and the development of production practice is further promoted.)
技术领域
本发明涉及卵母细胞体外培养技术，尤其涉及一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及应用。
背景技术
卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)技术，是指从卵巢卵泡中取出未成熟的卵母细胞，将其放置于体外成熟培养液中培养，尽可能地模拟体内卵泡环境使其发育成熟并获得受精能力。该技术在生命科学、医学、人类辅助生殖和畜牧业等领域都有十分重要的应用价值，是一种可获得大量成熟卵母细胞的基础技术。而在畜牧业实际生产中，会将成熟的卵母细胞用作受体细胞，将具有优良性状动物的体细胞用作供体细胞，然后通过体细胞核移植技术获得大量的具有相同遗传信息的优良个体，可为动物育种提供大量优质种畜。另外，随着基因编辑技术的发展和胚胎移植技术的应用，体细胞核移植技术与它们的结合可以制备出能生产药物的生物反应器和用于研究的人类疾病动物模型。除此之外，体外受精胚胎、孤雌激活胚胎和克隆胚胎都是非常重要的研究材料，可以用于研究探索人类及各物种的生命发生、胚胎发育、器官分化等生命过程和机制机理。但是成熟的猪卵母细胞作为一种原材料，其获取成本较高、获取技术难度较大且获得的数量有限，这大大限制了体细胞核移植技术在生产应用和科学研究中的广泛应用。因此，采用低成本、难度小的方法就可获得大量成熟卵母细胞的IVM技术显得越来越重要。可事实上，体外成熟的卵母细胞质量远不如体内成熟卵母细胞，这同样是限制体细胞核移植技术广泛并高效应用的重要原因之一。而深一层的原因是卵母细胞在体内正常成熟的机制尚未清晰，卵泡内部分促进卵母细胞成熟的因子和物质至今尚未研究透彻，导致体外成熟培养液中缺乏这些物质，进而不足以支持卵母细胞更好的发育生长。
血小板第4因子(platlet factor 4,PF4)是一种储存在血小板中、能与肝素结合并促进凝血和血栓形成的蛋白质，它还具有抑制造血、促炎症、促进动脉硬化和促血管生成等作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及其在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆、孤雌胚胎等领域的应用。
本发明的一个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂，该添加剂为PF4蛋白。
在某些实施方式中，PF4蛋白浓度为5-250ng/mL。
在某些实施方式中，PF4蛋白浓度为125ng/mL。
本发明的另一个方面，提供了一种通过在卵母细胞培养液中添加PF4蛋白添加剂来提高卵母细胞体外成熟质量的方法或提供了一种通过在卵母细胞培养液中添加浓度为5-250ng/mL的PF4蛋白添加剂来提高卵母细胞体外成熟质量的方法或提供了一种通过在卵母细胞培养液中添加浓度为125ng/mL的PF4蛋白添加剂来提高卵母细胞体外成熟质量的方法。
在某些实施方式中，提高卵母细胞体外成熟质量的方法采用的培养液组分如下：在TCM-199培养基中添加0.1IU/ml人绒毛膜、促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、0.6mM半胱氨酸、10％猪卵泡液、10％胎牛血清及PF4蛋白。
在某些实施方式中，提高卵母细胞体外成熟质量的方法采用的培养液组分如下：在TCM-199培养基中添加0.1IU/ml人绒毛膜、促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、0.6mM半胱氨酸、10％猪卵泡液、10％胎牛血清及5-250ng/mL PF4蛋白。
在某些实施方式中，提高卵母细胞体外成熟质量的方法采用的培养液组分如下：在TCM-199培养基中添加0.1IU/ml人绒毛膜、促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、0.6mM半胱氨酸、10％猪卵泡液、10％胎牛血清及125ng/mL PF4蛋白。
本发明的第三个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂在卵母细胞体外成熟培养中的应用，该添加剂为PF4蛋白；优选地，该添加剂为5-250ng/mL PF4蛋白；更优选地，该添加剂为125ng/mL PF4蛋白。
本发明的第四个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂在体细胞克隆技术领域的应用，该添加剂为PF4蛋白；优选地，该添加剂为5-250ng/mL PF4蛋白；更优选地，该添加剂为125ng/mL PF4蛋白。
本发明的第五个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂在孤雌胚胎技术领域的应用，该添加剂为PF4蛋白；优选地，该添加剂为5-250ng/mL PF4蛋白；更优选地，该添加剂为125ng/mL PF4蛋白。
本发明的第六个方面，提供了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂在猪、小鼠、牛、羊、人或其他哺乳动物卵母细胞体外成熟培养中的应用，该添加剂为PF4蛋白；优选地，该添加剂为5-250ng/mL PF4蛋白；更优选地，该添加剂为125ng/mL PF4蛋白。
本发明的有益效果：通过向体外卵母细胞培养液中添加PF4蛋白来提高卵母细胞体外培养的质量。通过提高卵母细胞体外培养的质量，进而应用在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆技术、孤雌胚胎领域上。一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟，并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎，有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，进一步推进生产实践的发展。
附图说明
图1为体内成熟(VMF)时期、体内未成熟(VIF)时期卵泡液中PF4蛋白水平的相对含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
1、卵泡液的定量蛋白质组学检测
使用定量蛋白质组学质谱检测体内成熟前后卵泡液，以期找到有哪些因子在卵泡成熟过程中发生显著变化。通过手术方式收集发情母猪卵巢中的体内成熟卵泡液，和未发情母猪卵巢中的体内未成熟卵泡液，未成熟卵泡挑选的是直径3-8mm的卵泡。之后用去高丰度蛋白试剂盒去除两种卵泡液中的高丰度蛋白，制备成上机样品后进行定量蛋白质组学质谱检测，结果显示：血小板因子4(PF4)的表达量极显著上调，在体内成熟卵泡液中PF4蛋白的相对表达量是体内未成熟卵泡液的4倍多(结果如图1所示)。并且，成熟卵泡的直径是未成熟卵泡的3-5倍，也就是说PF4在两者中的绝对含量要相差至少100倍，因此可以合理推测PF4蛋白是一种在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用的物质。
2、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制
为进一步研究PF4蛋白在卵母细胞的体外成熟中的作用，配制如下培养液：
a.基础成熟培养液：在TCM-199培养基中添加0.1IU/ml人绒毛膜、促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、0.6mM半胱氨酸、10％(V/V)屠宰场来源的猪卵泡液和10％(V/V)胎牛血清。
b.PF4成熟培养液：在基础成熟液中分别补充5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL的PF4蛋白。
3、卵母细胞的体外成熟培养
挑选3-8mm的卵泡，用注射器和针头从中抽取卵母细胞，挑出卵母细胞后对其进行筛选，选择具有三层以上卵丘细胞并且卵母细胞胞质呈黑色圆形、均匀、胞质边界清晰的卵丘细胞-卵母细胞复合体，再分别将卵丘细胞-卵母细胞复合体等量地分别放入步骤2中配制的基础成熟培养液或含有不同浓度的PF4蛋白的PF4成熟培养液中，然后置于5％CO2、38.5℃的培养箱中培养44小时。在培养44小时后将卵丘细胞-卵母细胞复合体取出，并用透明质酸酶去掉附着的卵丘细胞，然后挑出排除了极体且胞质均匀的卵母细胞用于胚胎构建。
4、猪孤雌胚胎和克隆胚胎的构建及胚胎体外培养
a.猪孤雌胚胎的构建：把预热好的电激活液加入到融合槽中，将步骤3中得到的成熟卵母细胞放进电激活液里平衡2min，然后把卵母细胞放进融合槽中，用510V、60μs、2DC激活卵母细胞。用PZM胚胎培养液将电激活的卵母细胞洗3遍，之后转移到加有PZM胚胎培养液的四孔板中培养。PZM培养液成分如下：NaCl 108.00mM、KCl 10.00mM、KH2PO40.35 mM、MgSO4·7H2O 0.40mM、NaHCO325.07 mM、丙酮酸钠(Na-Pyruvate)0.20mM、乳酸钙2.00mM、牛磺酸(Hypotaurine)5.00mM、L-谷氨酰胺1.00mM、必需氨基酸20mL/L、非必需氨基酸10mL/L。
b.猪克隆胚胎的构建：提前准备1板6cm培养皿的供体细胞，当细胞长到80-90％时去掉培养液，用DPBS轻柔清洗2次，然后加入到预热的胰蛋白酶消化液中，在超净工作台中把1mL细胞培养液加到向孔里，用移液枪吹打培养皿底数几次，而后把细胞悬液移入15mL离心管中，用离心机800rpm离心5min。弃上清，加入1mL培养液，用移液枪吹打使细胞重悬备用。
去掉步骤3得到的卵母细胞的核，然后把形态较好的供体细胞注入到卵母细胞的卵周隙中，待所有去核卵母细胞都注射完毕后，用融合－激活液清洗电融合槽，并加入融合激活液500μL，将10个注核卵放置到电融合槽中，用玻璃细针转动使的卵受体－核供体轴线与电极垂直，用510V、50μs、2DC进行融合激活。
c.胚胎体外培养：胚胎构建好后，将胚胎放入含有PZM胚胎培养液的四孔板中，放置于5％CO2、38.5℃的培养箱中培养，分别在培养48h、168h后记录卵裂数和囊胚数等数据。
5、IVM过程中在成熟培养液里补充PF4蛋白对卵母细胞质量的影响结果
5.1用经PF4蛋白处理的卵母细胞制备出的孤雌胚胎的实验结果
IVM过程中在成熟培养液里补充PF4蛋白对卵母细胞质量的影响。相较于对照组，经PF4蛋白处理的卵母细胞制备出的孤雌胚胎，添加125ng/mL PF4蛋白处理组为最佳浓度组，其卵裂率提高了3.72％，囊胚率提高了40.15％；另外，补充其他浓度的PF4蛋白也不同程度地提高了胚胎的卵裂率和囊胚率。详细结果如下表1所示：
表1：不同浓度PF4蛋白处理组卵母细胞对孤雌胚胎的影响结果
由上表结果所得，125ng/mL PF4蛋白处理组为最佳浓度组，因此，本实施例验证了125ng/mL PF4蛋白处理卵母细胞对其孤雌胚胎的影响。
5.2用经PF4蛋白处理的卵母细胞制备出的克隆胚胎的实验结果
因为由孤雌胚胎结果得出125ng/ml PF4蛋白的处理效果最好，所以用125ng/mlPF4蛋白处理卵母细胞制备克隆胚胎。最终与对照组相比，125ng/mL PF4蛋白处理组克隆胚胎的卵裂率提高了8.48％，4细胞期率提高了3.91％，囊胚率提高了52.62％。详细结果如下表2所示：
表2：不同浓度PF4蛋白处理组卵母细胞对克隆胚胎的影响结果
5.3在体外成熟培养液中添加PF4蛋白制备出成熟卵母细胞的实验结果
卵母细胞成熟率是一个衡量卵母细胞质量的重要指标之一，尤其是在卵母细胞体外成熟方面。卵母细胞成熟率就是指卵母细胞核发育成熟并排出第一极体的比率。本发明同样得到了这部分的实验结果，在IVM过程中往成熟培养液里补充PF4蛋白，相比于对照组，最佳浓度(125ng/mL PF4蛋白处理组)处理组卵母细胞的成熟率提高了11.87％，其他浓度处理组也不同程度地提高了卵母细胞的成熟率。详细结果如下表3所示：
表3：不同浓度PF4蛋白处理组卵母细胞成熟率结果
综上，在卵母细胞体外成熟液中补充PF4蛋白可以有效地提高卵母细胞质量。通过改进和创新技术，一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟，并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎，有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究，进一步推进生产实践的发展。
以上所述的内容仅是本发明的一些实施。对本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。