一种启动子及重组载体和用途

文档序号：44726 发布日期：2021-09-28 浏览：33次 >En<

阅读说明：本技术 一种启动子及重组载体和用途 (Promoter, recombinant vector and application ) 是由牛国清王霞于 2021-05-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种启动子及重组载体和用途。具有启动子功能的基因,其特征在于,所述序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示。所述启动子具有启动子功能,同时该启动子所示DNA序列构建的重组载体导入链霉菌,添加纤维二糖后可提高链霉菌产生天然蓝色素。(The invention discloses a promoter, a recombinant vector and application. The gene with promoter function is characterized in that the sequence is shown as SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO. 8. The promoter has the function of a promoter, and simultaneously, the streptomyces can be improved to generate natural blue pigment by introducing a recombinant vector constructed by a DNA sequence shown by the promoter into the streptomyces and adding cellobiose.)

一种启动子及重组载体和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种启动子及重组载体和用途。

背景技术

基因表达调控是基因行使功能的主要环节，而启动子是控制基因表达水平的重要调控元件。链霉菌具有产生丰富次级代谢产物的能力,能够产生多种化学结构和多样生理活性的次级代谢产物。目前，已经开发了大量的链霉菌遗传操作工具，也有一些诱导表达调控系统可供选用。但是，这些诱导表达系统均存在一定的局限性，如高水平的渗漏表达，诱导剂不稳定、易降解或有毒等(Rodríguez-García et al.,2005；Wang et al.,2013；Li etal.,2015)。因此，目前缺少一种能在链霉菌中能精确调控基因表达的诱导型表达系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种启动子，从而能在链霉菌中能精确调控基因表达的诱导型表达系统。

为实现上述目的，本发明提供一种具有启动子功能的基因，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示。

本发明还保护所述基因或含有所述基因具有启动子功能的用途。

进一步，所述含有所述基因的序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示。

本发明还保护一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有所述基因。

进一步，所述重组载体含有所述基因为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所示序列，或者SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示序列。

本发明还保护一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有所述重组载体。

本发明还保护一种提高链霉菌产生天然蓝色素的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述重组载体转入链霉菌，添加纤维二糖即可。

进一步，所述链霉菌为小白链霉菌、变铅青链霉菌或天蓝色链霉菌。

进一步，所述链霉菌为小白链霉菌J1074、变铅青链霉菌TK24、天蓝色链霉菌M1146或天蓝色链霉菌M145。

本发明将CebR蛋白和cebO序列与P_kasO*组合，以卡那霉素抗性基因(neo)作为报告基因进行筛选，构建了一个无渗漏且精确控制目标基因表达的诱导表达调控系统。

本发明在链霉菌中提供了一种纤维二糖诱导型表达系统，该系统主要包含启动子P_kasO*、CebR阻遏蛋白和cebO结合序列。该系统通过三种生物元件的拼接组合成调控系统Cel-RS1或Cel-RS2，形成具有纤维二糖诱导功能的启动子DNA片段。在天蓝色链霉菌M1146、小白链霉菌J1074和变铅青链霉菌TK24中的neo抗性基因表达水平分析表明，该DNA片段具有很强的纤维二糖诱导表达活性，在无诱导剂的时候，不表达；添加适宜浓度的纤维二糖以后，高效表达。且在三种菌株中的neo抗性基因表达水平趋势一致，Cel-RS2略优于Cel-RS1，后续实验选择Cel-RS2作为最佳诱导表达系统进行应用。因此，将Cel-RS2整合到重组载体上并连接目的基因(indC，actII-ORF4和dCas9)，进一步将重组质粒转入链霉菌中，获得相应的重组菌株。该DNA片段整合到重组载体上并连接目的基因(indC，actII-ORF4和dCas9)转入链霉菌获得重组菌后，并不影响链霉菌生长，添加纤维二糖后，不仅可以产生大量目标代谢产物(天然蓝色素和放线菌红素)，还可以诱导CRISPRi系统的表达。

附图说明

图1是重组质粒pSET152-Cel-RS1-neo的构建示意图。

图2是重组质粒pSET152-Cel-RS2-neo的构建示意图。

图3是重组质粒pSET152-Cel-RS2-indC的构建示意图。

图4是纤维二糖诱导启动子的序列示意图及各链霉菌CebR蛋白同源序列比对结果图。

图5是小白链霉菌J1074中纤维二糖诱导模块的评估结果图。

图6是天蓝色链霉菌M1146和变铅青链霉菌TK24合成纤维二糖诱导模块的评估结果图。

图7是纤维二糖诱导调控系统Cel-RS2诱导天然蓝色素合成的诱导强度测定结果图。

图8是纤维二糖诱导的CRISPRi介导的基因表达调控结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例的PCR反应体系(50μL)：ddH₂O：17μL；2X Phanta Max Buffer(含有2mMMg²⁺)：25μL；dNTP Mix(10mM each)：1μL；上游引物(10μM)：2μL；下游引物(10μM)：2μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase：1μL；模板DNA：2μL(20-400ng)。

PCR反应程序：95℃预变性3min；(95℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸(1min延伸1kb)；重复30个循环)；72℃彻底延伸5min。

酶切体系：10X buffer：2μL；DNA片段或者载体：1～17μL(小于1μg)；限制性内切酶：1μL；ddH2O：补足20μL；37℃反应1小时。

连接体系：10X T4 DNA ligase buffer：2μL；50％PEG4000 solution：2μL；Linearvector DNA：20-100ng；Insert DNA：1-5倍的载体DNA量；ddH2O：补足20μL；T4 DNA ligase：0.2μL；16℃连接过夜。

同源重组体系：线性化载体：0.03pM；每个插入片段：0.03pM；5X CE MultiSBuffer：4μL；Exnase MultiS：2μL；ddH2O：补足20μL；37℃连接30分钟。

R5MS培养基：10.12g的甘露醇；5g的酵母提取物；0.1g的酪蛋白水解物；0.25g的K₂SO₄；10.12g的MgCl₂.6H₂O；21g的MOPS；2g的氢氧化钠；100g的蔗糖；1L的H₂O；灭菌完成后加入2mL的Trace element solution。额外添加1.5％琼脂配置固体培养基。

Trace element solution：40mg的ZnCl₂；200mg的FeCl₃·6H₂O；10mg的CuCl₂·2H₂O；10mg的MnCl₂·4H₂O；10mg的Na₂B₄O₇·10H₂O；10mg的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O。

R5A培养基：10.12g的甘露醇；5g酵母提取物；0.1g酪蛋白水解物；0.25g的K₂SO₄；10.12g的MgCl₂.6H₂O；5.73g的TES Buffer；1L的H₂O；灭菌完成后加入2mL的2mL的Traceelement solution(与R5MS相同)；pH＝7.2。液体培养基不用额外加琼脂，固体培养基加1.5％琼脂即可。

基本培养基(MM)(Kieser et al.,2000)：0.2g的MgSO₄·7H₂O；0.5g的L－天冬酰氨；0.5g的K₂HPO₄；0.01g的FeSO₄·7H₂O；1L的H₂O；10g的琼脂。使用前加入灭菌的50mL 10％甘露醇。

实施例1纤维二糖诱导型启动子重组载体pSET152-Cel-RS1-neo和pSET152-Cel-RS2-neo的构建

构建流程见图1和2。

人工合成t0序列(Genebank Accession Number：CP055251.1Range：1418196to1418384)，P_hrdB序列(Genebank Accession Number：AL939125.1Range:78237to 78664)和cebR序列(Genebank Accession Number：FN554889.1Range：6431608to 6432666)；以这三种人工合成的序列等分子数混合物为模板，以引物对t0-R(T-152)/P_hrdB-F(T-tfd)(如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示)进行PCR连接，从而将t0、P_hrdB和cebR片段连接在一起，回收获得目的片段t0-P_hrdB-cebR；

SEQ ID NO:1：TTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGACTCAGCAGGTGGAAGAGGGAC。

SEQ ID NO:2：GACGACAAAACTTTAGATCTCCGCCTTCCGCCGGAACG。

人工合成tfd序列(Genebank Accession Number：AJ414669.1Range 1:4389to4763)，P_kasO*OS1序列(如SEQ ID NO:3所示)和neo序列(如SEQ ID NO:4所示)；以这三种人工合成的序列等分子数混合物为模板，以引物对tfd-R(T-P_hrdB)/neo-R(T-152)(如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示)进行PCR连接，从而将tfd、P_kasO*OS1和neo片段分别连接起来，回收获得目的片段tfd-P_kasO*OS1-neo；

neo序列如下SEQ ID NO:4所示：

ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCACATACCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA。

SEQ ID NO:5：AGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCCAGACG。

SEQ ID NO:6：CAGCTATGACATGATTACGAATTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC。

将pSET152链霉菌整合型载体(可购买自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)用XbaI/EcoRI双酶切后，与上述获得的t0-P_hrdB-cebR片段和tfd-P_kasO*OS1-neo片段进行同源重组，得到重组质粒

pSET152-Cel-RS1-neo，其中的Cel-RS1如SEQ ID NO:7所示。

SEQ ID NO:7如下所示：其中单下划线“”为t0序列，点下划线为BamHI酶切位点，双直下划线为cebR序列，简单虚线为P_hrdB序列，单波浪下划线为BglⅡ酶切位点，双波浪下划线为tfd序列，加粗虚线下划线为AflⅡ序列，无下划线为P_kasO*OS1序列即SEQ ID NO:3。

将P_kasO*OS1序列(如SEQ ID NO:3所示)换成P_kasO*OS2序列(如SEQ ID NO:8所示)，其他均同上述步骤，得到重组质粒pSET152-Cel-RS2-neo，其中的Cel-RS2如SEQ ID NO:9所示。

SEQ ID NO:9如下所示：其中单下划线“”为t0序列，点下划线为BamHI酶切位点，双直下划线为cebR序列，简单虚线为P_hrdB序列，单波浪下划线为BglⅡ酶切位点，双波浪下划线为tfd序列，加粗虚线下划线为AflⅡ序列，无下划线为P_kasO*OS2序列即SEQ ID NO:8。

实施例2重组质粒pSET152-Cel-RS2-indC的构建

构建流程见图3。

将上述制备得到的重组质粒pSET152-Cel-RS2-neo用NdeI和EcoRI进行双酶切；

人工合成indC(Genebank Accession Number：CP004370.1，Range:6357231to6359275)序列，用NdeI和EcoRI进行双酶切；

将双酶切后的载体pSET152-Cel-RS2-neo与indC序列进行T4连接，得到重组质粒pSET152-Cel-RS2-indC。

实施例3：Cel-RS1和Cel-RS2启动子纤维二糖诱导活性分析

天然蓝色素合成的异源表达宿主为小白链霉菌J1074(比如可购自CGMCC4.7233)，放线紫红素合成的异源表达宿主为天蓝色链霉菌M1146，CRISPRi系统应用中的异源表达宿主为天蓝色链霉菌M145(比如可购自ATCC BAA-471)。

生物信息学分析发现，在小白链霉菌J1074、天蓝色链霉菌M1146和变铅青链霉菌TK24等常用链霉菌表达宿主中均存在CebR蛋白的同源基因。使用DNAMAN 9.0对CebR蛋白的氨基酸序列进行多重比对，结果显示疮痂链霉菌ATCC 49173与小白链霉菌J1074中的CebR蛋白相似性为79％，与天蓝色链霉菌M1146中的相似性为87％，与变铅青链霉菌TK24中的相似性为87％(图4的B)。基于此，本发明首先选择将cebO序列(如SEQ ID NO:10所示)插入P_kasO*中(图4的A)，以卡那霉素抗性基因(neo)为报告基因，构建纤维二糖诱导启动子表达系统。

SEQ ID NO:10：TGGGAGCGCTCCCA。

1)小白链霉菌J1074中的诱导活性分析

将实施例1所得重组质粒pSET152-Cel-RS1-neo和pSET152-Cel-RS2-neo通过接合转移的方式分别导入小白链霉菌J1074中，分别获得重组菌株J1074::pSET152-Cel-RS1-neo和J1074::pSET152-Cel-RS2-neo。此外，以组成型P_kasO*为对照，构建了重组质粒pSET152-P_kasO*-neo。

人工合成tfd序列(同上)，P_kasO*(如SEQ ID NO:11所示)；以这两种人工合成的序列等分子数混合物为模板，以引物对tfd-F(XbaI)/P_kasO*-R(P)(如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示)进行PCR连接(P_kasO*-R(P)引物需要进行磷酸化)，从而将tfd和P_kasO*片段连接在一起，回收获得目的片段tfd-P_kasO*；人工合成neo序列(同上)，将pSET152链霉菌整合性载体用XbaI/EcoRI酶切后，与上述获得的tfd-P_kasO*片段和neo片段进行T4连接，得到重组质粒pSET152-P_kasO*-neo。

SEQ ID NO:11：

TGTTCACATTCGAACGGTCTCTGCTTTGACAACATGCTGTGCGGTGTTGTAAAGTCGTGGCCAGGAGAATACGACAGCGTGCAGGACTGGGGGAGTT。

SEQ ID NO:12：TCTAGACCCGGGAACCCGGC。

SEQ ID NO:13：AACTCCCCCAGTCCTGCACG。

以卡那霉素抗性基因neo为报告基因，通过检测重组菌株对卡那霉素的抗性水平可以直接反映启动子的强度，并通过观察重组菌株的生长情况对两种启动子的效率进行评估，重组菌株构建结果见图5的A。在该实验中，分别收集重组菌株的孢子，对孢子进行梯度稀释(10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍)后，接种到含有不同浓度卡那霉素(2.5、5.0、10、25和50μg/mL)的固体基础培养基上(minimal medium，MM)，结果见图5。从图5的B和C可以看出，在不添加纤维二糖的情况下，在所有的卡那霉素浓度下，J1074::pSET152-Cel-RS1-neo和J1074::pSET152-Cel-RS2-neo均没有观察到链霉菌的生长，对照则有链霉菌的生长(见图5的B)；当添加0.3mM纤维二糖后，Cel-RS1和Cel-RS2被显著诱导，在以上5种卡那霉素筛选浓度梯度下，重组菌株均可以正常生长。相较而言，在纤维二糖的诱导下，Cel-RS2的活性略高于Cel-RS1(见图5的C)。

2)天蓝色链霉菌M1146和变铅青链霉菌TK24中的诱导活性分析

为了确定优化的诱导表达系统在其他链霉菌中的表征，通过接合转移的方法，将实施例1得到的质粒pSET152-Cel-RS1-neo和pSET152-Cel-RS2-neo分别转入模式链霉菌天蓝色链霉菌M1146和变铅青链霉菌TK24中，并分析了启动子的表达活性，结果见图6。其中A1为没有添加纤维二糖，链霉菌为M1146；A2为添加了纤维二糖，链霉菌为M1146；B1为没有添加纤维二糖，链霉菌为TK24；B2为添加了纤维二糖，链霉菌为TK24；从图6的A1,A2和B1,B2,可以看出，当不添加纤维二糖时，在两种链霉菌中Cel-RS1和Cel-RS2启动子不表达，无法启动卡那霉素抗性基因的表达，从而导致重组菌株无法在添加卡那霉素的培养基上生长，对照则有链霉菌的生长(见图6的A1,B1)；当在培养基中添加0.3mM纤维二糖后，两种诱导型启动子均被特异性地诱导表达，启动卡那霉素抗性基因的表达。值得注意的是，在纤维二糖诱导情况下，Cel-RS2启动子在两种宿主中的表达趋势均优于Cel-RS1，与小白链霉菌J1074中基本一致(图6的A2,B2)。

实施例4 Cel-RS2在天然蓝色素合成中的应用

小白链霉菌J1074基因组中存在1个基因簇负责天然蓝色素(indigoidine)的生物合成，该簇包含一个编码氧化结构域的非核糖体肽合成酶(NRPS)的编码基因indC。在正常的实验室培养条件下，小白链霉菌J1074不能产生indigoidine。本实施例拟用诱导启动子Cel-RS2启动indC的表达，从而激活indigoidine生物合成基因簇产生蓝色素。

首先，将实施例2构建的重组质粒pSET152-Cel-RS2-indC接合转移至小白链霉菌J1074中，获得J1074::pSET152-Cel-RS2-indC重组菌株(图7的A)，并在R5A固体培养基中观察indigoidine的产生。在R5A固体培养基上培养5天后，观察indigoidine的产生情况。

本实验以P_kasO*为阳性对照，构建重组质粒pSET152-P_kasO*-indC。以实施例3中得到的pSET152-P_kasO*-neo为模板，用NdeI/EcoRI进行双酶切；人工合成indC基因，并同时用NdeI/EcoRI进行双酶切，进一步将酶切后的pSET152-P_kasO*-neo(NdeI/EcoRI)和indC(NdeI/EcoRI)进行同源重组，获得重组质粒pSET152-P_kasO*-indC。将pSET152-P_kasO*-indC转移至J1074获得J1074::pSET152-P_kasO*-indC菌株。

以J1074::pSET152-P_kasO*-indC菌株为阳性对照，J1074::pSET152(将pSET152链霉菌整合性载体转移至J1074获得)为阴性对照，纤维二糖诱导浓度为0.3mM。实验结果表明，对于J1074::pSET152-Cel-RS2-indC重组菌株而言，无纤维二糖诱导时，无天然蓝色素的产生(见图7的B1)；在添加0.3mM浓度的纤维二糖后，诱导重组菌株产生大量天然蓝色素(见图7的B2)。图7的B1为没有添加纤维二糖；B2为添加了纤维二糖。

进一步通过检测重组菌株发酵液中indigoidine的产量来评估Cel-RS2的诱导效果，通过吸光度OD₆₀₀对其发酵液的产量进行定量分析。在R5A液体培养基中添加0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28mM浓度梯度的纤维二糖进行发酵培养，并在诱导后的第48h和72h检测溶液在OD₆₀₀ nm的吸光度值。结果表明，当添加不同浓度诱导剂后，发酵48h时，发酵液颜色不明显，说明indigoidine积累还处于较低水平(图7的C1)；但诱导72h后，发酵液中的蓝紫色随纤维二糖浓度的增加逐渐加深，且在纤维二糖浓度为0.32mM时发酵液的OD₆₀₀为0.63，当诱导浓度达到0.64mM和1.28mM时的indigoidine产量提高不明显，说明其产量在0.32mM已接近峰值(图7的C2)。

实施例5 Cel-RS2在CRISPRi系统表达中的应用

将质粒pCRISPR-dCas9-orf1p-A5NT(Tong Y,Charusanti P,Zhang L,Weber T,Lee SY.CRISPR-Cas9 Based Engineering of Actinomycetal Genomes.ACS SynthBiol.2015Sep 18；4(9):1020-9.)用XbaI和NdeI双酶切；再将实施例1所得重组质粒pSET152-Cel-RS2-neo也用XbaI和NdeI双酶切，得到片段Cel-RS2(XbaI/NdeI)；将上述酶切后的片段进行T4连接，得到重组质粒pSET152-idCas9-actI(图8的B)。

本实施例主要通过Cel-RS2启动dCas9蛋白，质粒构建如图所示(图8的A)。在靶向目标基因的sgRNA引导作用下，以此来抑制ACT基因簇的表达，进而抑制放线紫红素的生物合成(图8的A)。

将上述重组质粒pSET152-idCas9-actI通过接合转移导入天蓝色链霉菌M145，获得重组菌株M145::pSET152-idCas9-actI。在R5MS固体培养基上选取验证正确的4个重组菌株M145::pSET152-idCas9-actI进行表征。

将组成型启动子P_ermE*启动的dCas9蛋白(pCRISPR-dCas9-orf1p-A5NT)导入天蓝色链霉菌M145中作为对照，得到M145::pCRISPR-dCas9-orf1p-A5NT。

从图8的C1和C2中可看出(其中C1为没有添加纤维二塘；C2为添加了纤维二塘)，在含有pSET152-idCas9-actI质粒的天蓝色链霉菌M145中，当没有添加纤维二糖时，产生了与野生型M145一致的蓝色物质，表明此时Cel-RS2没有诱导CRISPRi系统表达，ACT基因簇的表达没有被抑制，放线紫红素可以正常合成(见图8的C1)；在添加0.3mM的纤维二糖后，无蓝色物质的产生，与M145::pCRISPR-dCas9-orf1p-A5NT重组菌株出现一致表型，表明此时Cel-RS2成功激活了CRISPRi系统的表达，ACT基因簇受到抑制，从而导致放线紫红素无法正常合成(见图8的C2)。因此，用Cel-RS2启动dCas9蛋白成功干扰了天蓝色链霉菌M145中放线紫红素的产生。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种启动子及重组载体和用途

<130> XNDX-21001-CNI

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttgggctgca ggtcgactct agactcagca ggtggaagag ggac 44

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gacgacaaaa ctttagatct ccgccttccg ccggaacg 38

<210> 3

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60

ccatgggagc gctcccagga gaatacgaca gcgtgcagga ctgggggagt t 111

<210> 4

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180

caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgca catacccgac 540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780

gacgagttct tctga 795

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agatctaaag ttttgtcgtc tttccagacg 30

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagctatgac atgattacga attctcagaa gaactcgtca agaaggc 47

<210> 7

<211> 2181

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcagcaggtg gaagagggac tggattccaa agttctcaat gctgcttgct gttcttgaat 60

ggggggtcgt tgacgacgac atggctcgat tggcgcgaca agttgctgcg attctcacca 120

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<213> 人工合成

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