一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用
阅读说明：本技术 一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用 (Recombinant vector capable of improving soybean aphid resistance gene and application thereof ) 是由 姚陆铭 王彪 马晓红 武天龙 于 2021-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用,涉及植物细胞技术领域,该重组载体为pGm109-35S-GmPti5重组载体,包括植物双元表达载体pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。公开了该重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中的应用。还公开了一种可提高大豆蚜虫抗性基因在构建抗蚜虫大豆株系中的应用,该基因为GmPti5基因,编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了调控大豆对蚜虫抗性的基因GmPti5,构建重组载体,该基因过量表达能够提高大豆对于蚜虫的抗性,能减少农药及人力的投入,保证大豆产量的稳定性,应用前景广阔。(The invention discloses a recombinant vector capable of improving soybean aphid resistance genes and application thereof, and relates to the technical field of plant cells, wherein the recombinant vector is pGm109-35S-GmPti5 recombinant vector and comprises plant binary expression vector pGM109 and GmPti5 genes; the nucleotide sequence of the GmPti5 gene is shown in SEQ ID NO. 1. Discloses the application of the recombinant vector in constructing aphid-resistant soybean strains. Also discloses an application of the gene capable of improving the resistance of soybean aphids in constructing an aphid-resistant soybean strain, wherein the gene is a GmPti5 gene, and the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO. 2. The invention discloses a gene GmPti5 for regulating and controlling resistance of soybean to aphids, a recombinant vector is constructed, the resistance of soybean to aphids can be improved by overexpression of the gene, the investment of pesticide and manpower can be reduced, the stability of soybean yield is ensured, and the application prospect is wide.)
技术领域
本发明涉及植物细胞
技术领域
，尤其涉及一种可提高大豆蚜虫抗性的基因的重组载体及其应用。背景技术
蚜虫是大豆生产中所遇到的主要虫害之一，也是影响大豆产量的重要原因。提高大豆对蚜虫的天然抗性不仅能保证大豆的正常生长，还能减少农药及人力的投入，保证大豆产量的稳定性。目前生产上尚未出现抗蚜虫的大豆品种，对大豆蚜虫的防治仍主要通过化学防治进行。因此提高大豆自身对蚜虫的抗性是大豆生产中亟待解决的重要问题。
不同大豆品种对蚜虫抗性存在很大差异，抗虫品种具有更高的蚜虫抵抗能力。发掘和利用大豆中抗蚜虫的关键基因，对于培育抗蚜虫大豆品种具有重要意义。
因此，本领域的技术人员致力于发现及克隆可提高大豆蚜虫抗性基因，并开发一种过量表达乙烯响应因子及其编码产物提高大豆对蚜虫抗性的方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种过量表达乙烯响应因子及其编码产物提高大豆对蚜虫抗性的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其在构建抗蚜虫大豆株系中的应用方法；提供了一种可提高大豆蚜虫抗性基因及其在构建抗蚜虫大豆株系中的应用方法。
本发明提供一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体，为pGm109-35S-GmPti5重组载体，pGm109-35S-GmPti5重组载体包括植物双元表达载体pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，植物双元表达载体pGM109中包括花椰菜花叶病毒35S启动子、Nde I和Sal I位点；Nde I和Sal I位点位于花椰菜花叶病毒35S启动子之后；GmPti5基因正向插入在Nde I和Sal I位点之间。
本发明还提供一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中的应用。
该重组载体在构建抗蚜虫大豆株系中应用的方法包括以下步骤：
步骤1、合成大豆第一链cDNA：提取抗蚜虫大豆品种总RNA后反转录，获得第一链cDNA，以第一链cDNA为模版，进行第一PCR扩增，得到扩增产物GmPti5基因全长cDNA；
步骤2、构建过表达重组载体pGm109-35S-GmPti5，以步骤1获得的GmPti5基因全长cDNA为模版，用含有Nde I和Sal I接头的特异性引物进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物，第二扩增产物经过Nde I及Sal I双酶切，回收后得到双酶切产物，将双酶切产物正向插入植物双元表达载体pGM109的花椰菜花叶病毒35S启动子之后的Nde I和Sal I位点之间，得到重组载体pGm109-35S-GmPti5；
步骤3、将步骤2得到的重组载体pGm109-35S-GmPti5通过农杆菌介导的子叶节法转化到大豆易感蚜虫材料中，得到转化后的大豆易感蚜虫材料；转化后的大豆易感蚜虫材料经过共培养、芽诱导、生根培养、种植，得到转基因大豆；对转基因大豆转化筛选，并分析表达量，得到阳性株系；对阳性株系连续筛选，获得稳定遗传的抗蚜虫大豆材料。
进一步地，第一PCR扩增引物序列为：
上游引物：5’-ATGGGAAGCAAGAAAACCTAC-3’
下游引物：5’-TTAACCTGTGCCACTTGTGA-3’。
进一步地，含有Nde I和Sal I接头的特异性引物为：
上游引物：5’-CGCCATATGATGGGAAGCAAGAAAACCTAC-3’
下游引物：5’-CGCGTCGACTTAACCTGTGCCACTTGTGA-3’。
进一步地，步骤3中对阳性株系进行连续筛选3代，获得稳定遗传的抗蚜虫大豆材料。
进一步地，步骤3还包括对稳定遗传的抗蚜虫大豆材料进行蚜虫抗性情况的检测。
进一步地，步骤3中共培养时间为5天，芽诱导培养时间为3周。
本发明还提供一种可提高大豆蚜虫抗性基因在构建抗蚜虫大豆株系中的应用，一种可提高大豆蚜虫抗性基因为GmPti5基因，GmPti5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，GmPti5基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的较佳实施方式中，详细说明过量表达可提高大豆对蚜虫抗性的GmPti5基因的发现及克隆方法；
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明利用GmPti5基因构建抗蚜虫大豆株系的方法。
本发明技术效果表现在公开了调控大豆对蚜虫抗性的基因GmPti5，构建一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体，该基因过量表达能够提高大豆对于蚜虫的抗性。提高大豆对蚜虫的天然抗性，不仅能保证大豆的正常生长，还能减少农药及人力的投入，保证大豆产量的稳定性。GmPti5在培育抗蚜虫大豆品种方面，具有广阔的应用前景。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例2的GmPti5基因表达载体构建示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例2的过量表达GmPti5的大豆株系表达水平柱状图；
图3是本发明的一个较佳实施例2的过量表达GmPti5的大豆株系对蚜虫抗性柱状图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1GmPti5基因的发现及克隆
(1)GmPti5基因的发现：对抗蚜虫大豆材料P746及感蚜虫品种东农47构建重组自交系，通过构建高密度遗传连锁图谱及图位克隆，发现其中存在的与蚜虫抗性相关的差异基因，该基因与公开数据库进行比对，发现其属于乙烯相依因子家族，定名为Glycine maxpathogenesis-related genes transcriptional activator 5，GmPti5。
(2)GmPti5基因的获取：提取抗蚜虫大豆材料P746的RNA，通过反转录获得第一链cDNA，已第一链cDNA为模版，进行GmPti5基因的PCR扩增，扩增引物为：
上游引物：5’-ATGGGAAGCAAGAAAACCTAC-3’
下游引物：5’-TTAACCTGTGCCACTTGTGA-3’。
实施例2利用GmPti5基因构建抗蚜虫大豆株系
(1)大豆转化载体构建
以实施例1中获得的GmPti5基因全长cDNA为模版，用含有Nde I和Sal I接头的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经过Nde I及Sal I双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pGM109的的花椰菜花叶病毒35S启动子之后的Nde I和Sal I位点之间，得到重组载体pGm109-35S-GmPti5,如图1所示。
特异性引物为：
上游引物：5’-CGCCATATGATGGGAAGCAAGAAAACCTAC-3’
下游引物：5’-CGCGTCGACTTAACCTGTGCCACTTGTGA-3’
(2)农杆菌介导的子叶节法转化大豆易感蚜虫材料
将步骤(1)中构建的重组载体通过农杆菌介导的子叶节法转化到大豆易感蚜虫材料中，后经过共培养、芽诱导、生根培养、种植、检测阳性克隆，连续筛选3代，获得稳定遗传的抗蚜虫大豆材料。
农杆菌活化具体操作为：从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到5mL YEP液体培养基，每mL YEP液体培养基添加利福平100μg、添加卡那霉素50μg，于28℃，200rpm震荡培养24h至OD600达到1.0。
上述转接过程具体为：活化后的菌液按1：100的比例，转入含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃，200rpm摇床震荡培养6h，OD600达到0.6时可用于转化。
上述侵染过程具体为：侵染幼嫩茎尖生长点，种子萌发1天后，切除胚芽及胚根，将剩余部分放入菌液中浸泡30分钟，取出后置于于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
共培养过程为，将侵染后的外植体铺放于含有共培养基培养皿上，用封口膜封好培养皿，28℃黑培养5天。
共培养培养基为每升MSB培养基中添加0.25mg GA3及1.67mg BAP。
芽诱导培养过程为：将共培养后的外植体转接到含有选择分化固体培养基的平皿上，在温度为26℃，光照强度为5000lux，16h/8h光暗条件下培养。
上述芽诱导培养基为每升MSB培养基中添加100mg Cef及1.67mg BAP。
生根培养，选择芽诱导培养3周后，待不定芽长到2cm时，切下不定芽并移到含有生根培养基的三角瓶里进行生根培养。
上述生根培养基为每升MSB培养基添加100μg IBA。
种植过程具体为：待根生长至2cm，苗高7cm时，移栽于花盆中，温室培养。
(3)转化阳性株系筛选及表达量分析
提取转基因大豆幼苗的基因组DNA，PCR扩增后，进一步检测和筛选阳性植株。
扩增引物序列为：
上游引物：5’-GCCACAAATTCATAACACAACAAG-3’
下游引物：5’-TACATCACAATCACACAAAACTAAC-3’
提取上述所得阳性植株总RNA，做qPCR分析，检测不同转基因株系的基因表达情况，获得稳定遗传的GmPti5基因过量表达的转基因株系。
上述qPCRR特异引物序列为：
上游引物：5’-AAAGAAGCACTACAGAGGAGTC-3’
下游引物：5’-GCAACAATTTCAGCTGGGAAAT-3’
上述qPCR所用的大豆内参基因Fbox，其扩增的特异性引物序列为：
上游引物：5’-TTGCTTATTCAATCCGCTTGTC-3’
下游引物：5’-TAAACAAATTCTTGAGCACCCG-3’。
继续筛选以观察T1代的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，并且检测了遗传稳定的转基因株系和对照株系蚜虫抗性情况。
蚜虫抗性检测方法为：
将上述大豆转基因系和对照品系在温室盆栽种植，每个系种10盆，每盆栽1棵，在第一对三出复叶正面接种孵化1天的蚜虫，7天后统计植株上蚜虫数量。
如图2所示，实施例2中获得的4个过量表达GmPti5基因的T0代株系中，与对照品种相比，L1和L6中GmPti5基因表达量显著高于对照品种。如图3所示，与对照品种相比，这4个稳定遗传GmPti5过量表达转基因材料对蚜虫抗性提高16.5％-60.1％。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种可提高大豆蚜虫抗性基因的重组载体及其应用
<130> 2021.6.5
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> soybean
<400> 1
atgggaagca agaaaaccta cgaggaagaa gaaagcacgg ctctattttc ccattcccaa 60
acacaaacag acttgttgtt acccttcaac gagaacgacc cacaggacat ggtcatatac 120
caagtcctcc acgaagccaa tgctctcacc aacacattcc tccctcagcc caccagaaac 180
ataacaaaga agcactacag aggagtccgc cgccgtcctt ggggaaaata cgccgctgag 240
attcgcgact cggcgcgcca cggcgccagg atatggctcg gcaccttcct aaccgctgaa 300
gaggctgcca tggcttatga ccgagccgcg ttcaagatga ggggctccaa ggctttgctc 360
aatttcccag ctgaaattgt tgctgctgct actgcaacag agttatcttt caaaagtagt 420
agtaataata ataataataa taataataac aatcccgatg ctgtttctga ttccagtgct 480
ggtagctctt gcacgaacaa ttccacttgg gtaaatagga atcagtcaga aatcacaagt 540
ggcacaggtt aa 552
<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> soybean
<400> 2
Met Gly Ser Lys Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Glu Ser Thr Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ser His Ser Gln Thr Gln Thr Asp Leu Leu Leu Pro Phe Asn Glu Asn
20 25 30
Asp Pro Gln Asp Met Val Ile Tyr Gln Val Leu His Glu Ala Asn Ala
35 40 45
Leu Thr Asn Thr Phe Leu Pro Gln Pro Thr Arg Asn Ile Thr Lys Lys
50 55 60
His Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly Lys Tyr Ala Ala Glu
65 70 75 80
Ile Arg Asp Ser Ala Arg His Gly Ala Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe
85 90 95
Leu Thr Ala Glu Glu Ala Ala Met Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Phe Lys
100 105 110
Met Arg Gly Ser Lys Ala Leu Leu Asn Phe Pro Ala Glu Ile Val Ala
115 120 125
Ala Ala Thr Ala Thr Glu Leu Ser Phe Lys Ser Ser Ser Asn Asn Asn
130 135 140
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Pro Asp Ala Val Ser Asp Ser Ser Ala
145 150 155 160
Gly Ser Ser Cys Thr Asn Asn Ser Thr Trp Val Asn Arg Asn Gln Ser
165 170 175
Glu Ile Thr Ser Gly Thr Gly
180