基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法
阅读说明：本技术 基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法 (Method for detecting 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine by using immunochromatographic test paper based on gold nanoparticles ) 是由 叶伟伟 王丽文 张宇 钱天润 于 2021-05-08 设计创作，主要内容包括：一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法,通过柠檬酸钠还原三水合四氯金酸制备金纳米颗粒(AuNPs),在碱性条件下将8-OHdG抗体(Ab)包被于金纳米颗粒的外层形成Ab@AuNPs作为探针。将牛血清蛋白(BSA)与8-OHdG用碳二亚胺盐酸盐(EDC)偶联制备人工抗原,并包被于硝酸纤维素膜上形成检测线(T线),将羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线(C线)。由于待测物中的8-OHdG与检测线上包被的人工抗原竞争8-OHdG抗体,可以通过检测线颜色的变浅变化检测8-OHdG,肉眼检测限为50mg/L。本发明可以简单、快速、灵敏地检测8-OHdG。(A method for detecting 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine by using immunochromatographic test paper based on gold nanoparticles comprises the steps of preparing gold nanoparticles (AuNPs) by reducing tetrachloroauric acid trihydrate through sodium citrate, and coating an 8-OHdG antibody (Ab) on the outer layer of the gold nanoparticles under an alkaline condition to form the Ab @ AuNPs as a probe. Bovine Serum Albumin (BSA) and 8-OHdG are coupled by carbodiimide hydrochloride (EDC) to prepare an artificial antigen, and the artificial antigen is coated on a nitrocellulose membrane to form a detection line (T line), and goat anti-mouse IgG is coated on the nitrocellulose membrane to form a quality control line (C line). Because 8-OHdG in the object to be detected competes with the artificial antigen coated on the detection line for the 8-OHdG antibody, the 8-OHdG can be detected through the lightening change of the color of the detection line, and the limit of visual detection is 50 mg/L. The invention can simply, rapidly and sensitively detect the 8-OHdG.)
技术领域
本发明涉及一种8-羟基-2’-脱氧鸟苷的检测技术方法，尤其涉及一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法。
背景技术
活性氧自由基(ROS)可以诱导动物和人类的DNA氧化损伤，形成大量的DNA损伤产物。食品中存在的邻苯二甲酸盐、重金属、防腐剂、农兽药残留等，可以使人体细胞中的ROS水平升高。另外，外源性活性氧也会造成DNA氧化损伤，如吸烟、紫外线辐射和电离辐射。8-OHdG是研究最多的DNA氧化损伤产物，被公认为氧化应激合适的生物标志物。8-OHdG具有与任何碱基配对的能力，在DNA复制时会引起基因突变和癌基因的表达。
目前，常用的8-OHdG检测方法主要有酶联免疫吸附分析(ELISA)、毛细管电泳(CE)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)等。虽然这些传统的检测技术已经具备优良的选择性以及合适的检测限，但是大多存在仪器昂贵、样品前处理繁琐、操作过程复杂等问题。近年来，由于免疫层析法具有快速、简单、经济、准确等诸多优点，在许多领域被广泛使用，无需特殊设备和复杂的技术。免疫层析结合比色法可以通过简单的颜色变化监测待测物的存在，但是比色分析灵敏度不高，通过与不同种类的纳米材料结合可以提高检测灵敏性和选择性。常用的纳米材料包括碳纳米材料、金属纳米材料、二氧化硅纳米颗粒和量子点。胶体金(AuNPs)合成简单，得到的产物也很稳定，并且金纳米颗粒具有强烈的红色，结合金纳米颗粒构建免疫层析试纸可以实现更加简单、快速的8-OHdG检测。
发明内容
为了克服已有8-OHdG检测方法的速度较慢、操作复杂、成本昂贵等不足，本发明提供了一种简单、快速、灵敏的基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，所述方法包括以下步骤：
1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体的体积比为10:1～2:1,制得的金标抗体在4℃下保存备用；
2)8-OHdG完全抗原制备：配置8-OHdG溶液、牛血清蛋白BSA溶液和碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50:5:1～10:5:1；室温反应1.5～2.5h后，用500MW的透析膜和500mL 1×PBS透析过夜，于4℃下保存备用；
3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(6)和PVC底板(7),将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(5)和吸水垫(6)依此粘贴在PVC底板(7)上，相互之间重叠1-2mm；在结合垫上喷涂步骤1)制备好的金标抗体，在硝酸纤维素膜上以0.5～1.5μL/cm的量喷涂步骤2)制备好的8-OHdG完全抗原与羊抗鼠IgG，分别为检测线和质控线，干燥20～40min；将干燥后的试纸切成3～6mm宽的试纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；
4)8-OHdG的测定：配置含有BSA、吐温-20、蔗糖和NaCl的上样液，用上样液配置不同浓度的8-OHdG样液，将8-OHdG样液滴加到步骤3)制备好的试纸条上，反应3～5min后，在可见光下观察结果。
进一步，所述步骤1)中，8-OHdG抗体浓度为0.5～1.5μg/mL，金纳米颗粒的浓度为4～40nM，金标抗体的浓度为40～400nM。
再进一步，所述步骤2)中，8-OHdG溶液浓度为0.5～1.5g/L，BSA溶液浓度为3～5g/L，EDC浓度为25～30g/L，8-OHdG完全抗原的浓度为1mg/mL。
更进一步，所述步骤3)中，金标抗体的喷涂量为4～6μL，金标抗体的喷涂浓度为400～4000nM，羊抗鼠IgG的浓度为0.5～1.5mg/mL。
所述步骤4)中，BSA的质量分数为0.5～1.5％，吐温-20的质量分数为1～5％，蔗糖的质量分数为1～5％,NaCl的质量分数为0.9％，8-OHdG样液的体积为50～100μL。
本发明利用金纳米颗粒构建免疫层析试纸，基于抗原抗体的特异性结合，比色法检测8-OHdG。通过金纳米颗粒上修饰的8-OHdG抗体富集8-OHdG进行检测，实现8-OHdG检测的目的。
本发明利用金纳米颗粒良好的分散性和稳定性，易于合成，表面容易通过硫醇或胺基实现生物功能化修饰，并且具有强烈的红色等特点，与8-OHdG抗体结合构成8-OHdG检测的探针。当检测到8-OHdG时，8-OHdG与检测线上的8-OHdG完全抗原竞争探针，在可见光下观察，检测线红色变浅。
本发明的有益效果主要表现在：将表面生物功能化的金纳米颗粒负载到免疫层析试纸上，用于8-OHdG的检测分析。实验证明该方法构建的胶体金免疫层析试纸可用于快速、简便、灵敏的8-OHdG的分析检测。
附图说明
图1为本发明检测方法的检测原理图；
图2为本发明金纳米颗粒透射电子显微镜(TEM)图；
图3为本发明基于胶体金免疫层析试纸检测8-OHdG的检测线颜色及随浓度变化图；
图4为本发明基于胶体金免疫层析试纸检测8-OHdG的灰度值随浓度变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。
参照图1～图4，一种基于抗原抗体特异性结合的胶体金免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，所述方法包括以下步骤：
1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体的体积比为10:1～2:1,制得的金标抗体在4℃下保存备用；
2)8-OHdG完全抗原制备：配置8-OHdG溶液、牛血清蛋白(BSA)溶液和碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50:5:1；室温反应2h后，用500MW的透析膜和500mL1×PBS透析过夜，于4℃下保存备用；
3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线4、硝酸纤维素膜5、吸水垫6和PVC底板7,将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6依此粘贴在PVC底板7上，相互之间重叠1-2mm；在结合垫2上喷涂步骤1)制备好的金标抗体，在硝酸纤维素膜5上以1μL/cm的量喷涂步骤2)制备好的8-OHdG完全抗原与羊抗鼠IgG，分别为检测线3和质控线4，干燥30min；将干燥后的试纸切成宽为5mm的纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；
4)8-OHdG的测定：配置含有BSA、吐温-20、蔗糖和NaCl的上样液，用上样液配置不同浓度的8-OHdG样液，将8-OHdG样液滴加到步骤3)制备好的试纸条上，反应5min后，在可见光下观察结果。
进一步，所述步骤1)中，8-OHdG抗体浓度为0.5～1.5μg/mL，金纳米颗粒的浓度为4～40nM，金标抗体的浓度为40～400nM。
所述步骤2)中，8-OHdG溶液浓度为0.96g/L，BSA溶液浓度为4.5g/L，EDC浓度为28.5g/L，8-OHdG完全抗原的浓度为1mg/mL。
所述步骤3)中，金标抗体的喷涂量为5μL，金标抗体的喷涂浓度为400～4000nM，羊抗鼠IgG的浓度为1mg/mL。
所述步骤4)中，BSA的质量分数为1％，吐温-20的质量分数为3％，蔗糖的质量分数为3％,NaCl的质量分数为0.9％，8-OHdG样液的体积为80μL。
本发明将金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，用于富集样液中的8-OHdG。在免疫层析试纸上包被8-OHdG完全抗原，可以与样液中的8-OHdG竞争金纳米颗粒的结合位点。上述现象可以通过在可见光下试纸检测线的颜色进行分析，进而检测8-OHdG。与传统的检测方法相比，无需特殊设备和复杂的技术，操作简单，成本低，易于测量。
实施例1：一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，制备所得的金纳米颗粒浓度为6nM，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体(1.2μg/mL)的体积比为5:1,制得的金标抗体浓度为96nM，在4℃下保存备用；
(2)8-OHdG完全抗原制备：配置0.96g/L 8-OHdG溶液、4.5g/L牛血清蛋白BSA溶液和28.5g/L碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50:5:1；室温反应2h后，用500MW的透析膜和500mL 1×PBS透析过夜，制备所得的8-OHdG完全抗原的浓度为1mg/mL，于4℃下保存备用；
(3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线4、硝酸纤维素膜5、吸水垫6和PVC底板7,将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6依此粘贴在PVC底板7上，相互之间重叠1-2mm；如图1所示结合垫2上喷涂5μL的金标抗体(960nM)，在硝酸纤维素膜5上以1μL/cm的量喷涂1mg/mL的8-OHdG完全抗原与1mg/mL的羊抗鼠IgG，分别作为检测线3和质控线4，干燥30min；将干燥后的试纸切成宽为5mm的纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；
(4)8-OHdG的测定：配置含有BSA、吐温-20、蔗糖和NaCl的上样液，用上样液配置不同浓度的8-OHdG样液，将8-OHdG样液滴加到图1所示的样品垫1上，反应5min后，在可见光下观察结果。
实施例2：一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，制备所得的金纳米颗粒浓度为4nM，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体(0.5μg/mL)的体积比为5:1,制得的金标抗体浓度为40nM，在4℃下保存备用；
(2)8-OHdG完全抗原制备：配置0.96g/L 8-OHdG溶液、4.5g/L牛血清蛋白BSA溶液和28.5g/L碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50:5:1；室温反应2h后，用500MW的透析膜和500mL 1×PBS透析过夜，制备所得的8-OHdG完全抗原的浓度为1mg/mL，于4℃下保存备用；
(3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线4、硝酸纤维素膜5、吸水垫6和PVC底板7,将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6依此粘贴在PVC底板7上，相互之间重叠1-2mm；如图1所示，在结合垫2上喷涂5μL的金标抗体(400nM)，在硝酸纤维素膜5上以1μL/cm的量喷涂1mg/mL的8-OHdG完全抗原与1mg/mL的羊抗鼠IgG，分别作为检测线3和质控线4，干燥30min；将干燥后的试纸切成宽为5mm的纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；
(4)8-OHdG的测定：配置含有BSA、吐温-20、蔗糖和NaCl的上样液，用上样液配置不同浓度的8-OHdG样液，将8-OHdG样液滴加到图1所示的样品垫1上，反应5min后，在可见光下观察结果。
实施例3：一种基于金纳米颗粒的免疫层析试纸检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷的方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒制备和表面生物功能化处理：采用柠檬酸钠还原高氯金酸的方法制备金纳米颗粒，制备所得的金纳米颗粒浓度为40nM，并在金纳米颗粒表面修饰8-OHdG抗体，金纳米颗粒和8-OHdG抗体(1.5μg/mL)的体积比为5:1,制得的金标抗体浓度为400nM，在4℃下保存备用；
(2)8-OHdG完全抗原制备：配置0.96g/L 8-OHdG溶液、4.5g/L牛血清蛋白BSA溶液和28.5g/L碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，8-OHdG溶液和BSA溶液用稀盐酸调节pH至5，三种溶液混合并震荡，所述8-OHdG溶液、BSA溶液和EDC溶液的体积比为50：5：1；室温反应2h后，用500MW的透析膜和500mL 1×PBS透析过夜，制备所得的8-OHdG完全抗原的浓度为1mg/mL，于4℃下保存备用；
(3)免疫层析试纸搭建：免疫层析试纸包括样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线4、硝酸纤维素膜5、吸水垫6和PVC底板7。将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6依此粘贴在PVC底板7上，相互之间重叠1-2mm；如图1所示，在结合垫2上喷涂5μL的金标抗体(4000nM)，在硝酸纤维素膜5上以1μL/cm的量喷涂1mg/mL的8-OHdG完全抗原与1mg/mL的羊抗鼠IgG，分别作为检测线3和质控线4，干燥30min；将干燥后的试纸切成宽为5mm的纸条，放入密封袋中加干燥剂保存；
(4)8-OHdG的测定：配置含有BSA、吐温-20、蔗糖和NaCl的上样液，用上样液配置不同浓度的8-OHdG样液，将8-OHdG样液滴加到图1所示的样品垫1上，反应5min后，在可见光下观察结果。
金纳米颗粒用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征得到结果如图2所示。金纳米颗粒形状近似球形，制备得到的金纳米颗粒直径在19-25nm之间，平均直径为23nm，粒径分布均一，无其他特殊形状。
将8-OHdG抗体修饰的金纳米颗粒负载到免疫层析试纸的结合垫上，加不同浓度的8-OHdG样液，十分钟后，在可见光下，测得试纸条检测线的颜色随8-OHdG浓度变化，如图3所示，随着8-OHdG浓度的增加，检测线3红色变浅，质控线4始终是红色，显色强度没有明显变化。用Image J软件的灰度扫描，把峰面积积分结果进行归一化处理，对T线的肉眼的观察结果进行辅助分析，如图4所示，随着8-OHdG浓度的增加，灰度积分面积越小。
本说明书的实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，仅作说明用途。本发明的保护范围不应当被视为仅限于本实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域的普通技术人员根据本发明构思所能想到的等同技术手段。