一种梅花花瓣中类黄酮代谢物提取与鉴定的方法
阅读说明：本技术 一种梅花花瓣中类黄酮代谢物提取与鉴定的方法 (Method for extracting and identifying flavonoid metabolites in plum blossom petals ) 是由 张�杰 吴思惠 马召旭 高蓉蓉 熊涛 朱欢欢 张俊卫 包满珠 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然化合物提取与鉴定技术领域,具体涉及一种梅花花瓣中类黄酮代谢物提取与鉴定的方法。本发明使用的提取方法为超声提取,超声温度不超过25℃、超声时间为15-45min；超声功率为160-200W。采用本发明的提取方法得到的提取物,可以直接进行类黄酮鉴定,能够有效鉴定出31-50种类黄酮化合物。本发明提供的提取与鉴定的方法对有效评估和利用梅花种质资源具有重要意义。(The invention relates to the technical field of natural compound extraction and identification, in particular to a method for extracting and identifying flavonoid metabolites in plum blossom petals. The extraction method used by the invention is ultrasonic extraction, the ultrasonic temperature is not more than 25 ℃, and the ultrasonic time is 15-45 min; the ultrasonic power is 160-200W. The extract obtained by the extraction method can be directly used for flavonoid identification, and 31-50 flavonoid compounds can be effectively identified. The extraction and identification method provided by the invention has important significance for effectively evaluating and utilizing plum blossom germplasm resources.)
技术领域
本发明涉及天然化合物提取与鉴定技术领域，具体涉及一种梅花花瓣中类黄酮代谢物提取与鉴定的方法。
背景技术
黄酮类化合物广泛存在于各种植物中，其具有抗氧化、抗肿瘤、改善免疫功能、调节血脂等多种生理活性及药用价值。人体主要通过食用蔬菜及水果来摄取类黄酮。
梅花是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)的植物，原产我国南方，已有三千多年的栽培历史，梅花中含有丰富的类黄酮物质。对于梅花中类黄酮的提取工艺，目前相关研究较少，梅花生物类黄酮混合物尚没有正式的国家标准，没有系统的完善的提取方法。现有的梅花花瓣类黄酮提取测定方法存在操作步骤繁琐、样品浪费多等缺点。
现有技术在对梅花类黄酮进行提取后，由于提取物纯度低、杂质高，不能对提取物进行准确的特征鉴定分析，梅花类黄酮成分特征还没有统一的鉴定标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种梅花花瓣中类黄酮代谢物提取与鉴定的方法。
在使用有机溶剂作为浸提剂进行梅花花瓣中类黄酮代谢物提取时，浸提剂不仅可以浸提类黄酮，还可以溶解梅花花瓣中其他代谢物。为了确保提取出的梅花类黄酮纯度更高，可以直接上机鉴定。本发明对超声提取工艺及浸提剂进行优化。
本发明提供的具体技术方案如下：
本发明第一方面提供类黄酮的提取方法，使用超声处理辅助提取，超声处理的温度不超过25℃、超声处理的时间为15-45min；超声功率为160-200W。
在现有技术中，常用的提取温度为60-80℃，原因是高温会增加提取效率。本发明采用低温萃取，并且通过对超声时间、超声功率和浸提剂的优化，克服了低温萃取效率低的缺点，也克服了高温会导致部分提取物降解的缺点。
在本发明提供的提取方法中，所述浸提剂为乙醇或甲酸甲醇。
在本发明提供的提取方法中，所述乙醇为55-65％的乙醇；所述甲酸甲醇为1.5-2.5％的甲酸甲醇。
在本发明提供的提取方法中，所用花瓣与浸提剂的料液比为(0.015g-0.025g):(120μL-200μL)。
现有技术中，通常使用较多的原料及浸提剂，期望提取较多的类黄酮，本发明在对提取工艺进行优化后，在较少量的原料及浸提剂的超声处理下，能够获得高提取率，并且提取物可直接进行上样鉴定分析。
具体地，本发明提供的提取方法，将花瓣研磨，加入55-65％的乙醇浸提剂，震荡摇匀，在4-25℃下，使用160-200W处理30-45min。
在本发明提供的提取方法中，还包括，浸提液4℃环境下放置12-24h后离心，收集上清液，根据芦丁标准曲线，使用分光光度计进行定量分析。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护，上述的提取方法在生产类黄酮产品中的应用。
第二方面，本发明请求保护使用上述提取方法提取得到的梅花类黄酮产品。
第三方面，本发明提供一种类黄酮的鉴定方法，在使用上述的提取方法获得提取物后，使用高效液相色谱质谱联用分析类黄酮成分。
本发明还请求保护上述的提取方法或上述的鉴定方法在筛选梅花种质资源中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的提取方法通过对超声时间、温度、功率和浸提剂的优化，在提取过程中，保证梅花类黄酮稳定不降解，并且通过料液比的精准控制，保证得到高提取率可直接上样检测的类黄酮提取物；
(2)采用本发明的提取方法得到的类黄酮，纯度高、杂质少，可以直接在LC-Q-TOF-MS液质联用仪器上进行上机检测；
(3)针对本发明提取得到的提取物，可以准确鉴定梅花花瓣中31-50种类黄酮特征成分，为梅花种质资源鉴定提供良好的理论支撑。
附图说明
图1是本发明实施例1中正模式离子流图。
图2是本发明实施例1中负模式离子流图。
图3是本发明实施例2中正模式离子流图。
图4是本发明实施例2中负模式离子流图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例中，所用梅花为白须朱砂，白须朱砂在我国各地均有栽培。
本发明实施例中芦丁标准曲线的制备方法为：
(1)精密称取芦丁标准品0.010g，加60％乙醇浸提剂溶解定容至5ml，配制成质量浓度为2mg/ml的标准品溶液。
(2)分别吸取该标准品溶液25μl、50μl、100μl、150μl、200μl于5只试管中，加质量分数5％NaNO2溶液100μl、摇匀放置6min，加质量分数10％Al(NO3)3溶液100μl，摇匀放置6min；再加质量分数4％NaOH溶液1000μl，加水至2.5ml，摇匀放置15min。
(3)将不同质量浓度的芦丁标准溶液用UV-4802双光束扫描型紫外可见分光光度计在510nm处，以蒸馏水为空白参比，测定其吸光度，由吸光值和芦丁标准品溶液浓度绘制标准曲线。
(4)用最小二乘法求线性回归方程Abs＝10.872c-0.1135(R2＝0.9963，Abs为吸光度；c为总黄酮质量浓度(mg/mL)。
实施例1梅花花瓣类黄酮的提取及鉴定分析
本实施例提供对梅花花瓣中类黄酮进行提取和定量分析的方法，具体步骤如下：
(1)以‘白须朱砂’盛花期的花瓣为试材，将梅花鲜样在液氮速冻后，电子天平称取0.015-0.025g梅花花瓣冻干样品，置于液氮速冻后的2ml研磨管中，每管加入钢珠两粒，用研磨仪器进行自动研磨。
(2)以料液比1：8000(g/μl)加入浸提剂，用涡旋仪震荡摇匀，用超声清洗器在25℃下超声；本实施例中浸提剂为60％乙醇，超声波辅助提取的超声功率为200W、超声时间为45min，超声期间加入冰块使温度不超过25℃。
(3)将样品在4℃条件下放置24h后离心，离心转速13000rmp，时间10min。
(4)梅花总类黄酮提取量的计算：根据芦丁标准曲线，用UV-4802双光束扫描型紫外可见分光光度计对梅花花瓣样品中类黄酮总量进行定量分析，‘白须朱砂’盛花期花瓣类黄酮提取率为14.1731％。
(5)使用Q-TOF-LC-MS液质联用仪器获得质谱信息，仪器型号为Q-TOF 6520massspectrometer；色谱柱为Thermo Hypersil Gold C18,100mm*2.1mm，1.9μm；柱温35℃；28min；流速0.3ml/min；进样量为5μL；扫描范围30m/z-1200m/z；全扫描电喷雾(ESI)在正负模式下进行；干燥气体(drying gas nitrogen)为氮气10L/min；气体温度(gastemperature)350℃；雾化气压力(nebulizer pressure)40psig；毛细管电压(capillaryvoltage)3.5kv；破裂电压(fragmentor)135v；撇渣器(skimmer)65v；碰撞能量(Thecollision energy)分别为10eV、20eV、30eV；紫外DVD选用波长520nm、350nm、320nm。流动相A(含0.1％V甲酸的超纯水)，流动相B(含0.1％V甲酸的乙腈)。梯度洗脱条件为0min 5％B；20min 95％B；22min 95％B；22.1min 5％B；28min 5％B，正模式离子流图见图1，负模式离子流图见图2。图1及图2中峰型明确，出峰数量多，证明本实施例提取得到的提取物中，类黄酮含量高、种类丰富。
根据高效液相色谱质谱得到代谢物的m/z值和离子碎片模式与常用质谱数据库或已发表文献中的代谢物进行比对鉴定代谢物。质谱库有METLIN(https://metlin.scripps.edu/)、Mass Bank(http://www.massbank.jp/)和HMDB(http://www.hmdb.ca/)。本实施例得到的代谢产物见表1。表1中保留时间代表从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间，分子离子[M+]或[M-H]-的值代表准分子离子峰的质荷比，碎片离子的值代表准分子离子经过裂解生成的产物离子的质荷比。
前人大多只对红色梅花的花青素化合物进行鉴定，对除花青素外的类黄酮类物质还没有全面的鉴定。在对黄绿色的‘变绿萼’梅花进行鉴定时，鉴定到的类黄酮类物质有13种，包括，过苯甲酸、异鼠李素、槲皮素、山奈酚3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁，isoquercitrin-6″-O-benzoate、松脂醇、柚皮素、乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷、紫云英苷。
本实施例首次对紫红色的‘白须朱砂’梅类黄酮化合物进行提取并全面鉴定。
本实施例在‘白须朱砂’梅花花瓣中共鉴定出50种重要类黄酮物质。结果如表1所示。本发明首次在梅花中提取并鉴定出了除矢车菊素及其苷、芍药花素及其苷外的花青素化合物——飞燕草素素及其苷，还有查尔酮、表儿茶素等物质。
表1白须朱砂盛花期花瓣中类黄酮化合物
实施例2梅花花瓣类黄酮的提取及定量分析
本实施例采用的方法与实施例1相同，区别仅在于，本实施例的步骤(2)中，浸提剂为2％甲酸甲醇，超声波辅助提取的超声功率为200W、超声时间为30min，超声期间加入冰块使温度不超过25℃。所得到的类黄酮提取率为12.9553％。使用Q-TOF-LC-MS液质联用仪器获得质谱信息，正模式离子流图见图3，负模式离子流图见图4。图3及图4中峰型明确，出峰数量多，证明本实施例提取得到的提取物中，类黄酮含量高、种类丰富。
根据高效液相色谱质谱得到代谢物的m/z值和离子碎片模式与常用质谱数据库或已发表文献中的代谢物进行比对鉴定代谢物。质谱库有METLIN、Mass Bank和HMDB，本实施例得到31种类黄酮化合物，见表2。表2中保留时间代表从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间，分子离子[M+]或[M-H]-的值代表准分子离子峰的质荷比，碎片离子的值代表准分子离子经过裂解生成的产物离子的质荷比。
本实施例在梅花花瓣中共鉴定出31种重要类黄酮物质。首次在梅花中提取并鉴定出了除矢车菊素及其苷、芍药花素及其苷外的花青素化合物——飞燕草素素及其苷，还有查尔酮、表儿茶素等物质。
表2白须朱砂盛花期花瓣中类黄酮化合物
对比例1不同超声处理时间的提取效果
本对比例采用与实施例1相同的提取方法，区别在于，步骤(2)中，超声时间为15min、30min、45min、60min；本对比例中类黄酮提取率见表3。
表3不同超声处理时间的提取效果
其中a、b、c代表方差分析邓肯检验在P＝0.05显著性水平下的差异显著。
对比例2不同浸提剂的提取效果
本对比例采用的方法与实施例1相同，区别仅在于，步骤(2)中。所用提取溶剂为乙酸乙酯-乙醇(1∶1,V/V)。本对比例中使用乙酸乙酯-乙醇作为提取溶剂，所得到的类黄酮提取率见表4。
表4乙酸乙酯-乙醇作为提取溶剂的超声提取率
由表4可知，在使用乙酸乙酯-乙醇作为提取溶剂时，类黄酮提取率显著低于以60％乙醇或2％甲酸甲醇作为提取溶剂时的类黄酮提取率。
对比例3超声时不同温度的提取效果
本对比例采用与实施例1相同的提取方法，区别在于，本对比例中超声处理时的温度为60℃，超声功率为200W，超声45min，类黄酮提取率为13.225％，结果见表5。
表5不同温度的提取效果
对比例4对超声功率、超声时间、浸提剂进行优化的效果
本对比例与实施例1所用超声温度及提取步骤相同，本对比例提供，对不同超声功率、超声时间、浸提剂进行优化的结果，见表6。
表6
从表6的结果可以看出，不同超声功率、超声时间及浸提剂会产生不同的提取效果，并且，不是超声功率越大就会得到越高的提取率，也不是超声时间越长就会得到越高的提取率。
更进一步地，从上述数据可以看出，在提取方法中，对提取率产生影响最大的因素是浸提剂(提取剂)，而类黄酮种类的关系与浸提剂和超声功率及超声时间的关系并不明确。例如在以2％甲酸甲醇，超声波辅助提取的超声功率为200W、超声时间为30min时，得到的类黄酮提取率为12.9553％，鉴定得到的类黄酮种类为31种；而在以60％乙醇为浸提剂，超声功率200W、超声时间45min，进行提取时，提取率仅提升到14.1731％，而鉴定到的类黄酮种类达到50种。
因此，本发明提供的以乙醇为浸提剂、超声处理的温度不超过25℃、超声处理的时间为15-45min；超声功率为160-200W的提取方法得到的提取物最适用于梅花类黄酮种类鉴定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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