一种高选择性超灵敏的特异性丙二腈荧光探针与应用
阅读说明：本技术 一种高选择性超灵敏的特异性丙二腈荧光探针与应用 (High-selectivity and ultrasensitive specific malononitrile fluorescent probe and application thereof ) 是由 汪鑫 程思雨 柳彩云 张艳 苏美珺 荣晓迪 王坤 李玺威 祝汉闯 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高选择性超灵敏的特异性丙二腈荧光探针与应用,具体地,本发明的探针可作为丙二腈荧光探针用于丙二腈的快速定量定性检测。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：可以高特异性地识别丙二腈；可以快速响应丙二腈；可以灵敏地分析丙二腈的浓度；生物毒性低,可以应用生物细胞中的丙二腈成像；合成简单,性质稳定,可以长期保存使用。(The invention relates to a specific malononitrile fluorescent probe with high selectivity and ultrasensitiveness and application thereof, and particularly relates to the probe which can be used as the malononitrile fluorescent probe for rapid quantitative and qualitative detection of malononitrile. Such probes can achieve at least one of the following technical effects: malononitrile can be recognized with high specificity; malononitrile can be quickly responded; the concentration of malononitrile can be sensitively analyzed; the biological toxicity is low, and malononitrile imaging in biological cells can be applied; simple synthesis and stable property, and can be stored for a long time.)
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高选择性超灵敏的特异性丙二腈荧光探针及其在测量、检测或筛选丙二腈及活细胞荧光成像方法中的应用。
背景技术
氰化氢(HCN)是最危险的氰化物种类之一，丙二腈(NCCH2CN)是哺乳动物组织代谢中氰化氢(HCN)的前体，但丙二腈的毒性要高于氰化氢,并且丙二腈在哺乳动物组织代谢过程中可以完全转化为氰化氢，这就导致丙二腈的存在严重威胁了生物体的生命健康。丙二腈在生产生活中有着广泛的应用，可用于生产磺酰脲类除草剂如吡嘧磺隆等，又可用于制造除草剂双草醚，在医药上用以制造利尿药物。作为有机合成原料，在医药方面可以用于合成维生素B1、氨蝶呤等一系列重要药物，以及在合成染料、农药方面等都有重要用途。
丙二腈作为一种剧毒品，可以通过很多途径进入人体内，比如通过我们皮肤吸收或者通过伤口入侵，又或者是通过呼吸道吸入、误食等，都会进入我们体内危害健康。丙二腈进入生物体内后，会使中枢神经系统迅速瘫痪，而且还会引起呼吸酶和血液中血红蛋白中毒，引起呼吸困难，全身细胞也会出现内窒息状态。当少量的丙二腈经过消化道进入人体内，很容易引起慢性中毒。若人们长期引用受到丙二腈污染的地下水，会导致出现头疼、头晕、心悸等症状的发生。
由于丙二腈的广泛应用以及潜在的健康风险和环境污染，因此了解它的性质、来源和分布，阐明对环境和人体的影响，探究安全、快速且有效的检测方法，对于保护环境和人类健康具有十分重要的意义。目前对于氰化物的检测已经有一定的研究，但对于丙二腈的检测方法相对较少，常用的丙二腈检测方法主要包括气相色谱、液相色谱和质谱的联用，这些方法存在测试仪器价格昂贵，需要专业的研究人员进行操作并且对生物和环境的适用性低等局限性。因此，迫切需要开发一种更为灵敏简便的方法来实现对丙二腈的检测。
近年来，荧光探针因其高选择、超灵敏、合成简单等独特的优势而成为研究者关注的焦点。但是目前已报道的对丙二腈检测的荧光探针分析方法较少，而且仍存在一定的缺陷，例如选择性差、合成太过复杂等。因此，发展高选择性、高灵敏度、合成简单的、水溶性好、特异性识别丙二腈的荧光探针具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类具有高选择性超灵敏的特异性丙二腈荧光探针，以及它们的用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、能够特异性识别丙二腈等特点，并且能够在生理水平条件下对丙二腈进行有效测量、检测或筛选。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
式(I)中，R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1，R2，R3，R4，R5和R6均为氢原子的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：
本发明还提供了用于测量、检测或筛选丙二腈的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中丙二腈的存在或测量样品中的丙二腈含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中丙二腈的存在或测定样品中的丙二腈含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(Ⅱ)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅱ)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)快速响应
本发明的荧光探针能够对丙二腈瞬时丙二腈快速响应，有利于丙二腈的快速检测。
(2)特异性好
本发明的荧光探针可选择性的与丙二腈发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
(3)生物毒性低，可生理水平条件下应用
本发明荧光探针具有低毒性的特点，有利于将其长时间应用于细胞样品中丙二腈的检测或成像。
(4)灵敏度高
本发明的荧光探针与丙二腈反应非常灵敏，从而有利于对丙二腈的检测。
(5)合成简单
本发明的丙二腈荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是探针(10μM)加入丙二腈(0.5mM)前后的响应时间谱图；
图2(a)是探针(10μM)加入丙二腈(0-1mM)前后的荧光光谱变化；(b)探针(10μM)定量分析不同浓度丙二腈(0-1mM)的工作曲线，其中纵坐标为580nm处的荧光强度值。
图3(a)是探针(10μM)加入丙二腈(0-8μM)前后的荧光光谱变化；(b)是探针(10μM)定量分析不同浓度丙二腈(0-8μM)的工作曲线,其中纵坐标为580nm处的荧光强度值。
图4(a)是探针(10μM)加入丙二腈(0-8μM)前后的吸光度变化曲线；(b)探针(10μM)加入丙二腈(从左至右浓度分别为0，5μM，10μM，20μM，30μM)后溶液颜色发生裸眼可见的变化；
图5不同离子分析物(除特殊表明外，都为100μM)对探针(10μM)的荧光强度的影响，柱状图代表的探针在不同测试条件下在580nm处的荧光强度；
图6不同离子分析物(除特殊表明外，都为100μM)存在下探针(10μM)对丙二腈(100μM)识别后的荧光强度，柱状图代表的探针在不同测试条件下在580nm处的荧光强度；
图7是各个探针浓度对HeLa细胞的毒性分析，浓度分别为：0μM，5μM，10μM，20μM，30μM；
图8是Hela细胞的共聚焦荧光成像图；
图9是探针对斑马鱼行为学影响实验结果。(A)探针(0,10μM)处理斑马鱼幼虫的代表性轨迹图。(B)探针处理后斑马鱼幼虫的相对游动时间(0,10μM)；(C)运动距离。
图10是斑马鱼的共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1：测试荧光探针的时间动力学
配制一个探针浓度为10μM的10mL的测试体系，然后将0.5mM的丙二腈加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH＝8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图1可以清楚地看到，当丙二腈加入后，经检测，在60min左右，荧光强度达到最大值并基本保持不变，这说明该探针对丙二腈能够快速响应，能够为丙二腈的测定提供快速的分析方法。
实施例2：测试荧光探针对于丙二腈的浓度梯度(0-1mM)
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度(0-1mM)的丙二腈加入到测试体系中，摇晃均匀后静置60分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH＝8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且荧光光谱是在25℃下测得的。
用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图2(a)和2(b)可以清晰的看出，在低浓度范围内，随着丙二腈浓度的增加，580nm处的荧光强度逐渐增强，丙二腈浓度和探针等当量时(10μM)，响应倍数约为60倍，当丙二腈浓度为1mM时，响应倍数高达160倍，表明该探针可以实现对丙二腈的灵敏检测。
实施例3：测试荧光探针对于丙二腈的浓度梯度(0-8μM)
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度(0-8μM)的丙二腈加入到测试体系中，摇晃均匀后静置60分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH＝8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图3(a)可以清晰的看出，随着丙二腈浓度的增加，580nm处的荧光强度逐渐增强；并且，由图3(b)可以看出探针(10μM)加入丙二腈(0-10μM)之后，其580nm处的荧光强度的与丙二腈浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对丙二腈进行定量分析。
实施例4：测试荧光探针对于不同浓度丙二腈的吸光度变化和裸眼能力测试
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度(0-8μM)的丙二腈加入到测试体系中，摇晃均匀后静置60分钟，然后用紫外分光光度计测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH＝8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且吸光光谱是在25℃下测得的。
从图4(a)可以清晰的看出，随着丙二腈浓度的增加，510nm处的吸光度度逐渐增强。
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的丙二腈(0，5μM，10μM，20μM，30μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后静置。
由图4(b)可以看出，随着丙二腈加入的量的增多，溶液的颜色发生了明显的变化，这证明借助于该荧光探针能够对丙二腈进行裸眼定性分析。
实施例5：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、三价铁离子、铜离子、碘离子、氟离子、亚硫酸氢根、钙离子、钠离子、钾离子、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸、丙二腈；除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后静置60分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH 8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图5可以清晰的看出，只有丙二腈加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对丙二腈具有较高的选择性，有利于对丙二腈的检测分析。
实施例6：测试荧光探针的抗干扰能力
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(编号A-P分析物分别是空白、三价铁离子、铜离子、碘离子、氟离子、亚硫酸氢根、钙离子、钠离子、钾离子、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸、空白；除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到测试体系中，除了第一个空白组外，其他组分别加入丙二腈(100μM)，摇晃均匀后，静置60分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝5:5(10mM PBS,pH 8.0)体系中进行的，所使用的探针是式(Ⅱ)化合物，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图6可以清晰的看出，其他分析物加入对荧光探针检测丙二腈几乎没有干扰，实验证明，该探针对丙二腈具有较高的抗干扰能力，有利于对丙二腈的检测分析。
实施例7：荧光探针对HeLa细胞的毒性测试
在DMEM高糖培养基中，于96孔板中按照密度为1x106/mL对Hela细胞铺板，置于5％CO2/95％空气的37℃培养箱中培养。培养12小时后，分别加入终浓度为0、5、10、20、30μM的探针，继续培养24小时后，以CCK8试剂盒测定细胞活力
所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
从图7可以清晰的看出，探针具有低毒性的特点，可以将其长时间应用于细胞样品中丙二腈的实时检测。
实施例8:荧光探针对HeLa细胞中外源性丙二腈的共聚焦荧光成像
将HeLa细胞分成五组，a组作为空白对照组，b组用探针(10μM)孵育20min；c组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(5μM)孵育60min；d组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(20μM)孵育60min；e组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(50μM)孵育60min。最后对五组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图8所示。
所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
从图8可以清晰的看出，经该探针和不同浓度丙二腈孵育的HeLa展示出不同的荧光强度，且随着丙二腈浓度增高，荧光强度明显增强。实验证明，该探针该探针可以实现对活细胞中外源性的丙二腈检测。
实施例9:斑马鱼行为学实验
为了更好的验证探针的生物成像能力，对斑马鱼进行了一系列的研究。
将斑马鱼幼虫分为两组，一组不做处理，一组使用探针(10μM)孵化斑马鱼幼虫，并进行行为实验，进一步测试探针的安全性。测试结果如图9所示，图9(A)为斑马鱼的行为轨迹，红色、绿色和黑色线分别表示快、中、慢运动，如图所示，经过探针处理的斑马鱼和对照组的轨迹没有显著差异。从图9(B)和图9(C)可以看出，处理后的斑马鱼在移动时间、移动距离和速度上与对照组差异不大，这表明探针对斑马鱼没有负面影响。
实施例10：荧光探针对斑马鱼中外源性丙二腈的共聚焦荧光成像
将斑马鱼分成五组，a组作为空白对照组，b组用探针(10μM)孵育20min；c组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(5μM)孵育60min；d组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(20μM)孵育60min；e组先用探针(10μM)孵育20min，再加丙二腈(50μM)孵育60min。最后对五组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图10所示。
从图10可以清晰的看出，经该探针和不同浓度丙二腈孵育斑马鱼展示出不同的荧光强度，且随着丙二腈浓度增高，荧光强度明显增强。实验证明，该探针该探针可以实现对活细胞中外源性的丙二腈检测。
上述测试所使用的探针是式(Ⅱ)化合物。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
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