T细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用

文档序号：480716 发布日期：2022-01-04 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 T细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用 (T cell antigen receptor, polymer compound thereof, preparation method and application thereof ) 是由陈花刘光娜雷蕾刘芳贾乐梅黄道盛赵学强林欣于 2021-03-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种T细胞抗原受体、表达T细胞抗原受体(TCR)的免疫细胞,及其制备方法和应用。本发明所述的TCR能够特异性地被病毒抗原肽提呈细胞激活,提高胞外细胞因子IFNγ、IL2的释放水平及乳酸脱氢酶释放量,且显著地杀伤靶细胞。(The invention provides a T cell antigen receptor, an immune cell expressing the T cell antigen receptor (TCR), a preparation method and application thereof. The TCR can be specifically activated by virus antigen peptide presenting cells, improves the release level of extracellular cytokines IFN gamma and IL2 and the release amount of lactate dehydrogenase, and obviously kills target cells.)

技术领域

本发明涉及能够识别CMV pp65的T细胞抗原受体技术领域，具体涉及多种TCR以及在治疗和/或预防CMV相关疾病中的用途。

背景技术

T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的，TCR是呈递在主要组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，通过抗原特异性TCR与pMHC复合物结合引发T细胞与抗原呈递细胞直接的物理接触，相互作用，导致一系列后续细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

CN107827959A公开了一种分离抗原特异性T细胞以及抗原特异性T细胞中克隆编码抗原特异性TCR基因的方法。该TCR能够与HBVS183-91抗原短肽复合物FLLTRILTI-HLA*A0201结合，同时转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。CN106279404A公开了一种可溶且稳定的异质二聚TCR，其在α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键的异质二聚TCR，该TCR可溶且稳定，能够被很好地复性、重折叠、纯化同时能够与原配体特异性结合。但上述专利均未公开针对巨细胞病毒的特异性TCR。

巨细胞病毒(Cytomegalocirus，CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，也称细胞包涵体病毒。巨细胞病毒分布广泛，在人群中感染非常普遍，中国成人感染率达95％以上，通常呈阴性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生炎症疾病。CN102656188A公开了能够识别来自巨细胞病毒的抗原的T细胞受体，其与通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的来自巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65的肽特异性结合，所述肽具有氨基酸序列NLVPMVATV。但该申请中T细胞受体对靶细胞的杀伤作用不明显。

因此，本发明提供了一种T细胞抗原受体，能够特异性地被病毒抗原肽提呈细胞激活，提高胞外细胞因子IFNγ、IL2的释放水平及乳酸脱氢酶释放量，且显著地杀伤靶细胞。

发明内容

本发明提供了多种T细胞抗原受体(TCR)，其特异性结合MHC分子提呈的巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65抗原肽，所述的巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。本发明所述的TCR能够特异性地识别对应的CMV pp65抗原肽-MHC分子复合物，激活TCR-T细胞，进而产生高水平的细胞因子IFNγ、IL2、TNFα，体内体外试验均显著杀伤肿瘤细胞。具体如下：

本发明的第一方面，提供了一种T细胞抗原受体，所述的T细胞抗原受体特异性结合CMV pp65。优选的，结合表位包含SEQ ID NO：13。

优选的，所述的T细胞抗原受体通过主要组织相容性复合物分子(MHC)的呈递，与来自巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65的抗原肽特异性结合。

优选的，所述的T细胞抗原受体至少包含一个α链可变区和/或β链可变区。

优选的，所述的T细胞抗原受体是αβ异二聚体。

优选的，所述的T细胞抗原受体包含α链的CDR1α-CDR3α和β链的CDR1β-CDR3β。

CDR1α的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1-2中的任一种或包含与SEQ ID NO：1-2中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2α的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3-4中的任一种或包含与SEQ ID NO：3-4中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3α的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5-6中的任一种或包含与SEQ ID NO：5-6中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR1β的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7-8中的任一种或包含与SEQ IDNO：7-8中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR2β的氨基酸序列包含SEQ IDNO：9-10中的任一种或包含与SEQ ID NO：9-10中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性，CDR3β的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11-12中的任一种或包含与SEQ ID NO：11-12中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性；

在本发明的一个

具体实施方式

中，所述的CDR1α-CDR3α及CDR1β-CDR3β包含下列任一组：

在本发明的一个具体实施方式中，其β链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：34-35中的任一种或包含与SEQ ID NO：34-35任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

在本发明的一个具体实施方式中，其α链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：36-37中的任一种或包含与SEQ ID NO：36-37任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

优选的，其α链与β链的氨基酸直接连接或间接连接，优选为间接连接，更优选通过fp2A(furin-SGSG-p2A)连接。

进一步优选的，所述fp2A的氨基酸序列包含SEQ ID NO：215。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的α链与β链的连接顺序，可以为α链、fp2A与β链，或者，β链、fp2A与α链。

在本发明的一个具体实施方式中，进一步优选的，所述的T细胞抗原受体的氨基酸序列包含SEQ ID NO：30或32或包含与SEQ ID NO：30或32所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

本发明的第二方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合CMV pp65。优选的，结合表位包含SEQ ID NO：13。

优选的，所述的抗体或其抗原结合片段包含α链的CDR1α-CDR3α和β链的CDR1β-CDR3β。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列包含SEQ ID NO：30或32或包含与SEQ ID NO：30或32所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

优选的，所述的抗体或其抗原结合片段还可以包含如Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、(Fab’)2、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体的片段。

本发明的第三方面，提供了一种编码本发明所述的T细胞抗原受体的β链的核酸。

优选的，编码T细胞抗原受体的β链的核酸序列包含SEQ ID NO：38或39或包含与SEQ ID NO：38或39所示核酸序列具有至少80％同源性。

本发明的第四方面，提供了一种编码本发明所述的T细胞抗原受体的α链的核酸。

优选的，编码T细胞抗原受体的α链的核酸序列包含SEQ ID NO：40或41或包含与SEQ ID NO：40或41所示核酸序列具有至少80％同源性。

本发明的第五方面，提供了一种编码本发明所述的T细胞抗原受体或抗体或其抗原结合片段的核酸。

优选的，所述的编码T细胞抗原受体的α链与β链之间采用编码fp2A的核酸序列连接。进一步优选的，所述的编码fp2A的核酸序列包含SEQ ID NO：216。

优选的，编码T细胞抗原受体的核酸序列包含SEQ ID NO：31或33，或包含与SEQ IDNO：31或33所示核酸序列具有至少80％同源性。

优选的，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列包含SEQ ID NO：31或33，或包含与SEQ ID NO：31或33所示核酸序列具有至少80％同源性。

本发明所述的核酸序列可以是单链或双链，可以是DNA也可以是RNA。

优选的，所述的核酸序列可以是经过密码子优化的。进一步优选的，所述的密码子优化包括将病毒等使用的大量稀有密码子变为对应的哺乳动物密码子和/或移除mRNA不稳定基序和/或隐藏的剪接位点。

本发明的第六方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包含本发明任一所述的核酸。

优选的，所述的表达载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体在体内细胞中持续高水平表达。

优选的，所述的表达载体可以是原核表达载体或逆转录病毒载体。

进一步优选的，所述的原核表达载体为大肠杆菌系列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达载体为pET-26b或pET28a+。

进一步优选可以是劳氏肉瘤病毒(RSV)、慢病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠科白血病病毒(MLV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞增生病毒29(MC29)或禽骨髓成红细胞增多症病毒(AEV)等等。更进一步优选的，所述的表达载体是慢病毒表达载体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达载体为pHAGE-IRES-RFP。

进一步优选的，所述的表达载体中β链、α链与骨架载体的连接顺序为启动子、β链、fp2A、α链、IRES和RFP序列。

本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含本发明任一所述的核酸或表达载体。

优选的，所述的宿主细胞可以是真核的或原核的。更优选的，所述的宿主细胞为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的宿主细胞为Stbl3、BL21或transetta。

本发明的第八方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞表达本发明所述的T细胞抗原受体或者抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的免疫细胞包含一个或多个本发明任一所述的异源的核酸序列。

优选的，所述的免疫细胞包括但不限于干细胞、淋巴细胞(包括T细胞、B细胞)。进一步，所述免疫细胞是B细胞，所述B细胞表达上述的抗体或其抗原结合片段。所述免疫细胞是T细胞，所述T细胞的T细胞抗原受体结构如上所限定。

优选的，所述的T细胞可以是CD4+T、CD8+T等。

进一步优选的，所述的免疫细胞分离自受试者的T细胞衍生。

优选的，所述的免疫细胞是来自CMV血清阴性供体的T细胞。

本发明的第九方面，提供了一种免疫细胞的制备方法，包括将编码上述抗体或其抗原结合片段，或者所述的T细胞抗原受体的核酸序列转染至免疫细胞中表达获得。

优选的，还包括敲除细胞内源性TCR的步骤。具体的，可以为将靶向内源TCR的guide构建至慢病毒载体，与包装质粒、转染试剂共转至T细胞。

本发明的第十方面，提供了一种重组T细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)从阳性T细胞克隆得到本发明任一所述的核酸；

2)分离、培养原代T细胞；

3)将步骤1)得到的核酸递送至步骤2)所述的原代T细胞中，获得表达本发明任一所述T细胞抗原受体的重组T细胞。

优选的，所述的T细胞选自造血干细胞或外周血淋巴细胞(PBL)源T细胞。

本发明的第十一方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段或T细胞抗原受体的制备方法，包括如下步骤：

(1)从阳性T细胞克隆得到本发明任一所述的核酸；

(2)将步骤(1)得到的核酸连接至载体骨架，获得表达载体；

(3)将步骤(2)获得的表达载体转化至宿主细胞，然后诱导其表达；

(4)获得抗体或其抗原结合片段或者T细胞抗原受体。

优选的，所述的阳性T细胞为与MHC呈递的巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65抗原肽特异性结合。进一步优选的，所述的MHC呈递的巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65抗原肽复合物为单体或多聚体复合物。

本发明的第十二方面，提供了一种多聚体复合物，所述多聚体复合物包含本发明任一所述的T细胞抗原受体。

优选的，所述多聚体复合物还包括单体，生物素分子，以及链霉亲和素分子或亲和素分子，其中，所述单体包括MHC分子α链胞外区和β2m链及抗原肽，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素分子结合。

优选的，所述的MHC分子α链胞外区的C端连接avi-tag序列。

优选的，所述的MHC分子α链胞外区不含信号肽序列。并在成熟肽序列前面添加M氨基酸。

优选的，所述的β2m链不含有信号肽序列。且在成熟肽序列前面添加M和A两个氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的β2m链为不含信号肽且在成熟肽序列前加了两个氨基酸，优选为M、A。

优选的，所述的抗原肽包含SEQ ID NO：13。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的多聚体复合物包含：

(1)T细胞抗原受体；优选包含SEQ ID NO：30或32中的任一种或包含与SEQ ID NO：30或32任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

(3)单体，所述的单体包括抗原肽、C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和不含信号肽的β2m链；所述的抗原肽为SEQ ID NO：13；

(4)生物素分子；以及

(5)链霉亲和素分子或亲和素分子；其中，所述单体与所述生物素分子偶联，所述生物素分子与所述链霉亲和素或亲和素结合。

优选的，所述的MHC分子为MHC I类分子或MHC II类分子。更优选的，所述的MHC分子为MHC I类分子。

优选的，所述的MHC分子为HLA-A*1101。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的MHC分子α链的氨基酸序列如SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：24所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的MHC分子α链的核苷酸序列如SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：25所示核苷酸序列具有至少80％同源性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的MHC分子的β2m链的氨基酸序列如SEQ IDNO：26或SEQ ID NO：26所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的MHC分子的β2m链的核苷酸序列如SEQ IDNO：27或SEQ ID NO：27所示氨基酸序列具有至少80％同源性。

为提高抗原肽-MHC四聚体与T细胞抗原受体结合的特异性，所述的单体还包括至少一个氨基酸的化学修饰、突变、插入和/或缺失。

优选的，所述的MHC分子α链胞外区和β2m链为非共价结合。

优选的，所述的多聚体复合物至少包含一个单体。

优选的，每个单体至少偶联一个生物素分子。

本发明的第十三方面，提供了一种本发明任一所述的多聚体复合物的制备方法，包括如下步骤：

I)表达和纯化在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和β2m链；

II)将抗原肽、步骤I)获得的β2m链和在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区复性折叠，制备单体；

III)将步骤II)制备的单体生物素化，获得生物素化的单体；

IV)将步骤III)获得的生物素化的单体与带荧光标记的链霉亲和素或亲和素反应，制备抗原肽-MHC分子四聚体；

V)将步骤IV)得到的抗原肽-MHC分子四聚体与T细胞共孵育，形成T细胞抗原受体与抗原肽-MHC分子四聚体复合物。

优选的，所述步骤I)中包括分别克隆在编码C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区的核苷酸序列和MHC分子β2m链的核苷酸序列，连接至载体后，转化到表达菌中培养，加入诱导剂，提取包涵体。

进一步优选的，所述表达菌培养至OD₆₀₀值在0.2-0.4之间。

进一步优选的，所述诱导剂加入后的最终摩尔浓度为0.5-1mM。

优选的，诱导表达4-6h。

优选的，所述步骤II)包括β2m链的复性折叠，即将抗原肽、MHC分子β2m链、C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区依次加入稀释缓冲液中避光水浴，其中，所述的β2m链的复性折叠包括包涵体变性、加入蛋白酶抑制剂，而后透析。

优选的，所述的抗原肽、不含信号肽的β2m链与C端连接avi-tag序列的α链的摩尔比为(30-50)：(2-2.5)：1。进一步优选为40：2:1。

优选的，所述步骤II)中还包含纯化单体的步骤。

优选的，所述步骤III)中的生物素化是在BirA酶的催化下，将单体与BiomixA、BiomixB结合。

优选的，所述步骤III)中还包括纯化生物素化单体的步骤。

优选的，所述步骤IV)中的单体与链霉亲和素反应的摩尔比为(4-7)：1。

本发明的第十四方面，提供了一种上述多聚体复合物在制备、筛选或检测本发明所述抗体或其抗原结合片段或T细胞抗原受体中的应用。

本发明的第十五方面，提供了一种T细胞抗原受体的制备方法，包括如下步骤：

I)表达和纯化在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和β2m链；

II)将抗原肽、步骤I)获得的在C端连接avi-tag序列的MHC分子α链胞外区和β2m链复性折叠，制备单体；

III)将步骤II)制备的单体生物素化，获得生物素化的单体；

IV)将步骤III)获得的生物素化的单体与带荧光标记的链霉亲和素或亲和素反应，制备抗原肽-MHC分子四聚体；

V)将步骤IV)得到的抗原肽-MHC分子四聚体与T细胞共孵育，形成T细胞抗原受体与抗原肽-MHC分子四聚体复合物，分离获得T细胞抗原受体。

本发明的第十六方面，提供了本发明任一所述的T细胞抗原受体、本发明任一所述的抗体或其抗原结合片段、本发明任一所述的核酸、本发明所述的表达载体、本发明所述的宿主细胞、本发明所述的免疫细胞、本发明任一所述的多聚体复合物在制备诊断或治疗肿瘤或与CMV相关疾病的产品中的应用。

优选的，所述的CMV相关疾病选自新生儿CMV包涵体病、急性获得性CMV感染或免疫妥协人员CMV感染导致的疾病。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的CMV相关疾病选自肝、脾或中枢神经系统疾病，残疾，传染性单核细胞增多症，骨骼肌疼痛，CMV视网膜炎，胃肠CMV或脑炎等等。

本发明的第十七方面，提供了本发明任一所述的T细胞抗原受体、本发明任一所述的抗体或其抗原结合片段、本发明任一所述的核酸、本发明所述的表达载体、本发明所述的宿主细胞、本发明所述的免疫细胞、本发明任一所述的多聚体复合物在T细胞标记、检测、细胞分选或活化中的应用。

本发明的第十八方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含下列任一组：

i)本发明所述的T细胞抗原受体；

ii)本发明所述的核酸；

iii)本发明所述的表达载体；

iv)本发明所述的宿主细胞；

v)本发明所述的免疫细胞；

vi)本发明所述的多聚体复合物；或

vii)本发明所述的抗体或其抗原结合片段。

优选的，所述的药物组合物还可以包含药学上可接受的辅料。

优选的，所述的药物组合物还可以与其他治疗剂共同使用。进一步优选的，所述的治疗剂可以为免疫调节剂。

本发明的第十九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包含下列任一组：

i)本发明所述的T细胞抗原受体；

ii)本发明所述的核酸；

iii)本发明所述的表达载体；

iv)本发明所述的宿主细胞；

v)本发明所述的免疫细胞；

vi)本发明所述的多聚体复合物；或

vii)本发明所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明的第二十方面，提供了一种检测巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65的方法，所述的方法包括将待检测样品与本发明所述的抗体或其抗原结合片段或者T细胞抗原受体接触，然后检测巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65与抗体或其抗原结合片段或者T细胞抗原受体形成的复合物。

优选的，所述检测巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65为检测巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。

优选的，所述的抗体或其抗原结合片段或者T细胞抗原受体包括可检测的标记物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的标记物可以是His和/或HA。

本发明所述的检测巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65的方法，不是疾病的诊断方法。首先，待检测样品并非生物体或其离体组织或细胞，其次，即便生物体中存在巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65或者包含一定浓度或表达水平的巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65也并非确定是疾病，只是一种可能性。

本发明的第二十一方面，提供了一种治疗和/或预防与CMV相关疾病的方法，所述的方法包括给予个体有效量的本发明所述抗体或其抗原结合片段、所述的T细胞抗原受体、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞、所述的免疫细胞或所述的药物组合物。

优选的，所述的方法包括将表达本发明所述T细胞抗原受体的T细胞过继性转移至受试者的步骤。

优选的，所述的方法包括将本发明所述的T细胞抗原受体定位在与CMV相关疾病(优选为肿瘤或转移性肿瘤)的附近，以提高毒素或免疫刺激剂的效力。

优选的，用于治疗和/或预防同种异体造血干细胞移植后的CMV再活化。

优选的，用于治疗和/或预防器官移植(例如肾、肝、胰、肠、角膜)、组织移植、细胞移植(胰岛细胞、角膜缘干细胞)或干细胞治疗后的CMV再活化。

优选的，所述的表达本发明所述T细胞抗原受体的T细胞衍生自受试者。

优选的，所述的表达本发明所述T细胞抗原受体的T细胞与所述造血干细胞、器官、组织、细胞或干细胞衍生自相同的供体。

本发明的第二十二方面，提供了一种诊断与CMV相关疾病的方法，所述的方法包括取样，将样品与本发明所述的抗体或其抗原结合片段或T细胞抗原受体接触，然后检测CMVpp65与抗体或其抗原结合片段或T细胞抗原受体形成的复合物。

优选的，所述的抗体或其抗原结合片段或T细胞抗原受体包括可检测的标记物。

本发明所述的TCR能够特异性地识别对应的CMV pp65抗原肽-MHC分子复合物，激活TCR-T细胞，进而产生高水平的细胞因子IFNγ、IL2、TNFα，体内体外试验均显著杀伤肿瘤细胞。

本发明所述的“T细胞抗原受体”是能够识别当由MHC分子或其四聚体递呈时的肽的分子。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于胰腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、淋巴瘤、基底细胞癌、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、、胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。优选的，所述的肿瘤选自胰腺癌、肝癌、口腔鳞状上皮癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为淋巴瘤。

本发明所述的“与CMV相关疾病”包含CMV pp65感染所导致的疾病，包括新生儿CMV包涵体病，严重可影响肝、脾和中枢神经系统以及残疾。还包括急性获得性CMV感染，类似于传染性单核细胞增多症，包括发烧、骨骼肌疼痛等等。还包括免疫妥协人员，例如移植过器官的人，或患有HIV的人，感染可导致CMV视网膜炎、胃肠CMV和脑炎等等。

本发明所述的“包含”在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“预防”是指通过施用本发明所述的产品来抑制症状或者延缓特定症状紧张的所有行为。

本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预防的本发明所述的产品的量或剂量。

本发明所述的“产品”包括但不限于本发明所述的抗体或其抗原结合片段、所述的T细胞抗原受体、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主细胞、所述的免疫细胞或者所述的多聚体复合物，以及其他辅助或与上述上述产品协同的试剂。

本发明所述的“产品”可以为试剂盒、芯片、抗体偶联物或多功能抗体等药物组合物。

本发明所述的“受试者”包括但不限于人或非人哺乳动物。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猴子、猪或兔子等。

本发明所述的“同源性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以在不改变原序列主要结构或功能的前提下，根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与本发明所述的具体序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同源性。例如，本发明所述的“与SEQ ID NO：1-2中任一种所示氨基酸序列具有至少80％同源性”即为在保留与巨细胞病毒(CMV)磷蛋白pp65肽表位：MHC复合物结合功能的前提下，可以根据实际工作需要对SEQ ID NO：1或2进行调整，包含一个或多个改变例如取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸等，截短，或者一端或两端的加长，只要其保持80％以上同源性并且保留与pp65表位：MHC复合物或pp65表位：MHC分子四聚体结合的能力。所述的改变可以是取代、添加或缺失。可以是相同极性的氨基酸之间的取代、相同电荷的氨基酸之间的取代、不带电荷氨基酸之间的取代、脂肪族氨基酸之间的取代、芳香族氨基酸之间的取代、无极性氨基酸之间的取代或者具有相关性质的侧链部分的氨基酸之间的取代。其中，碱性侧链包括但不限于赖氨酸、精氨酸或组氨酸。酸性侧链包括但不限于天冬氨酸或谷氨酸。不带电荷的氨基酸包括但不限于天冬氨酰、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。非极性侧链包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或半胱氨酸。其中，所述的至少80％包括但不限于80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：抗原肽-MHC单体的SDS PAGE检测结果，其中，M为蛋白Marker，条带1、2为单体；

图2：A1101-ATV四聚体检测C44-TCR-T细胞阳性率；

图3：TCRβ链和α链在pHAGE载体中连接示意图，其中连接顺序依次为启动子、β链、furin-p2A、α链、IRES和RFP序列；

图4：流式细胞检测TCR的膜表面表达情况，具体为HLA-A*A1101 ATVQGQNLK特异性TCR(C44，C45)的膜表面表达情况，其中，BV421是系列荧光素中的一种，BV的全称是Brilliant Violet；

图5：流式细胞检测TCR与CMV pp65四聚体探针结合的亲和力，具体为HLA-A*A1101ATVQGQNLK特异性TCR(C44，C45)与CMV pp65四聚体探针结合的亲和力检测结果；

图6：C44-TCR-T、C45-TCR-T细胞因子IFNγ的释放水平及靶细胞荧光素酶水平的检测结果图，其中，C44、C45为实施例2制备的TCR，NE代表空白对照组，NT代表只有T细胞组，Raji为未转pp65的Raji细胞，1G4代表针对NY-ESO-1特异的TCR；

图7：淋巴瘤动物模型中评价C45-TCR在小鼠体内抑制肿瘤生长情况；

图8：淋巴瘤动物模型，无T细胞注射组(PBS)、对照T细胞注射组(NC)、及CMV TCR-T注射组(C45-TCR)的小鼠肿瘤生长情况统计结果；

图9：淋巴瘤动物模型，无T细胞注射组(PBS)、对照T细胞注射组(NC)、及CMV TCR-T注射组(C45-TCR)的小鼠体内TCR-T细胞特异增殖统计结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：CMV抗原表位四聚体的构建和效果检测

一、CMV抗原表位四聚体的构建

1)表达序列优化的HLA-A*1101(其氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示)的α链和β2m链(其氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示)。其中，α链的结构为相应HLA型α链的胞外区序列链接了Avi-tag序列，以BamHI酶切位点间隔，以提供生物素化的位点。β2m链去掉了信号肽序列，在成熟肽序列前面加了两个氨基酸(M和A)。表达载体为PET28a+，表达菌为transetta或BL21。IPTG浓度为0.5mM，诱导表达4h。提取α链和β2m链蛋白包涵体。

2)CMV抗原表位(抗原肽)的选择：HLA-A*1101型对应抗原表位ATVQGQNLK(SEQ IDNO：13)。

3)pMHC I单体折叠及纯化：将步骤2)所述抗原肽、相应的步骤1)所述β2m链复性蛋白和α链蛋白以摩尔比40:2:1的比例按顺序加入还原体系中，折叠反应72h。将得到的产物过Superdex75 10/300GL柱子纯化。收集纯化产物用avidity试剂盒生物素化，再次纯化得到生物素化的单体，凝胶电泳检测单体纯度。

4)将步骤3)所述生物素化的单体与APC标记的链霉亲和素结合反应，得到对应的四聚体，命名为A1101–ATVQGQNLK-四聚体(简称A1101–ATV四聚体)。

二、CMV抗原表位四聚体效果检测

1.分离人外周血单核细胞(PBMC)或准备TCR-T细胞，制备细胞悬液，细胞密度为1×10⁶细胞/mL。

2.将细胞离心，3000rpm，5min。去除上清，用50μL含有1％血清的PBS重悬。

3.加入2μL四聚体室温孵育30min。

4.加入2μL CD8抗体，冰上孵育20min。

5.加入1mL PBS，3000rpm，5min。

6.去除上清，加入1mL PBS，3000rpm，5min。

7.去除上清，用500μL的4％多聚甲醛重悬细胞，用滤膜过滤细胞悬液。

8.用流式细胞仪检测阳性细胞。

三、实验结果

单体的SDS PAGE检测结果见图1。如图1所示，经复性折叠和HPLC纯化，得到的单体清晰地显示重链(C端连接Avi-tag序列的α链胞外区)和轻链(去除信号肽区的β2m链)对应大小的蛋白，且纯度较高。

将构建好的四聚体分别与对应HLA型PBMC细胞共孵育钓取特异性T细胞。A1101型对应的TCR(C44-TCR)能够同时被同一表位自主研发和商业化四聚体(MBL，TS-M012-1)所识别(见图2)，且商业化四聚体阳性群占感染细胞的90.5％，自主研发四聚体阳性群占感染细胞的91％。C45-TCR结果参见图4。

实施例2：pHAGE-TCR-RFP载体的构建

一、获取CMV pp65表位特异的TCR的β和α基因片段

1)用从MBL公司购买的或本公司自制的HLA-A*1101-ATVQGQNLK-四聚体，根据产品说明书与外周血染色，将四聚体染色阳性的T细胞进行流式单细胞分选，反转录获得cDNA(IV Reverse Transcriptase,Invitrogen)。根据多重PCR(Multiplex PCR)原理，通过两轮PCR(KOD-Plus-Neo，TOYOBO)扩增出TCRβ基因的可变区片段。

反转录引物为：TRBC1-TCAGGCAGTATCTGGAGTCATTG(SEQ ID NO：136)

PCR扩增引物为：

上游引物1：T细胞受体β可变区--TRBV_F1(SEQ ID NO：56至95，其中SEQ ID NO：60、59也可以单独分别作为制备C44、C45的β基因的可变区片段的TRBV_F1)

上游引物2：T细胞受体β可变区--TRBV_F2(SEQ ID NO：96至135，其中SEQ ID NO：102、100也可以单独分别作为制备C44、C45的β基因的可变区片段的TRBV_F2)

下游引物1：T细胞受体β恒定区--TRBC2-GCACCTCCTTCCCATTCACC(SEQ ID NO：137)

下游引物2：T细胞受体β恒定区-TRBC3-GCTTCTGATGGCTCAAACACAG(SEQ ID NO：138)

具体的，根据PCR聚合酶KOD-Plus-Neo产品说明书，一轮PCR体系为20μL，退火温度为60℃，反应30个循环。取第一轮PCR反应的产物1μL，作为二轮PCR的模板，二轮PCR体系为30μL，退火温度为60℃，反应30个循环。然后将第二轮PCR产物跑琼脂糖胶，将对应大小的条带进行切胶回收(天根胶回收试剂盒)，送测序，测序引物为下游引物2。得到TCRβ基因序列。C44、C45的β链核苷酸序列如SEQ ID NO：38、39所示。

2)如上，对四聚体染色阳性T细胞的进行反转录获得cDNA(IV ReverseTranscriptase，Invitrogen)。根据产品说明书通过两轮PCR(KOD-Plus-Neo，TOYOBO)扩增出TCRα基因片段。

反转录引物为：T细胞受体α恒定区-TRAC1-CGACCAGCTTGACATCACAG(SEQ ID NO：139)

PCR扩增引物为：

上游引物3：T细胞受体α可变区-TRAV_F1(SEQ ID NO：142至186，其中SEQ ID NO：183、177也可以单独分别作为制备C44、C45的α基因的可变区片段的TRAV_F1)

上游引物4：T细胞受体α可变区-TRAV_F2(SEQ ID NO：42-55、187至214，其中SEQID NO：52、47也可以单独分别作为制备C44、C45的α基因的可变区片段的TRAV_F2)

下游引物3：T细胞受体α恒定区-TRAC2-GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTC(SEQ ID NO：140)

下游引物4：T细胞受体α恒定区-TRAC3-CAGGGTCAGGGTTCTGGATA(SEQ ID NO：141)

具体的，根据PCR聚合酶KOD-Plus-Neo产品说明书，一轮PCR体系为20μL，退火温度为60℃，反应30个循环。取第一轮PCR反应的产物1μL，作为二轮PCR的模板，二轮PCR体系为30μL，退火温度为60℃，反应30个循环。然后将第二轮PCR产物跑琼脂糖胶，将对应大小的条带进行切胶回收(天根胶回收试剂盒)，送测序，测序引物为下游引物4。得到TCRα基因序列。具体的，C44、C45的α链核苷酸序列如SEQ ID NO：40、41所示。

二、pHAGE-TCR载体的构建

将TCRβ，fp2A，TCRα经长引物(包含fp2A序列)overlap-PCR扩增(KOD-Plus-Neo,TOYOBO)得到TCRβ-fp2A-TCRα片段，分别命名为C44或C45。

扩增的引物包含上游引物5(SEQ ID NO：14(C44)、SEQ ID NO：15(C45))、下游引物5(如SEQ ID NO：16所示)，上游引物6(SEQ ID NO：17(C44)、SEQ ID NO：18(C45))、下游引物6(如SEQ ID NO：19所示)。

具体的，先用引物5和引物6分别将TCRβ和TCRα扩增出来，PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。将PCR产物跑胶回收(天根胶回收试剂盒)，分别取回收产物1μL作为模板，用上游引物5和下游引物6进行overlap PCR，PCR体系为50μL，退火温度为60℃，反应30个循环。跑琼脂糖胶得到约1800bp的条带，进行切胶回收。

将慢病毒载体pHAGE-IRES-RFP用NotI和NheI进行双酶切。酶切体系为40μL，其中含NotI和NheI分别1.5μL，质粒2-3μg，37℃酶切6h，然后在体系里加入1μL碱性磷酸酶(NEB)，处理1h以减少质粒自连，将酶切后的质粒跑胶回收，用nanodrop测浓度，作为骨架用于构建质粒。

根据Clone Express II One Step Cloning kit产品说明书，将TCR通过overlap与酶切后线性化的pHAGE-IRES-RFP载体进行连接(见图3)，转化至Stbl3菌株，在含氨苄的LB平板上培养12-16h，挑取单克隆菌进行测序，测序引物选用pHAGE载体上的引物seq-pHAGE-F和seq-pHAGE-R，以及下游引物4。获得相应TCR，简称分别为C44(其核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示)、C45(其核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示)。

实施例3：pMHC四聚体染色法检测TCR的膜表达和亲和力

1、构建内源性TCR敲除的JurkatT细胞系

基于Jurkat细胞TCR的序列特征，在α链和β链的恒定区设计guide序列(TRA_oligo1-CACCGTCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO：20)，TRA_oligo2-AAACGCCGTGTACCAGCTGAGAGAC(SEQ ID NO：21)，TRB_oligo1-CACCGGGCTCAAACACAGCGACCTC(SEQ ID NO：22)，TRB_oligo2-AAACGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCC(SEQ ID NO：23))。

将合成的α链和β链的guide序列分别构建到sgRNA-LentiCRISPR-puro和sgRNA-LentiCRISPR-BSD慢病毒载体中，与包装质粒psPAX2，pMD2.G和PEI转染试剂按照一定的比例共转293T细胞，收取48h和72h的细胞培养上清，浓缩后的两个病毒同时感染人类JurkatT细胞系。感染48h后用合适浓度的嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行药杀，直至两个药物各自的对照组细胞全部死亡。存活的细胞用流式分选单细胞到96孔板中进行培养。对于获得的单克隆细胞系，用TCRα链和β链的抗体分别对其表达进行鉴定，两条链都缺陷的细胞株即为获得的内源性TCR敲除的Jurkat T细胞，命名为JC5。

2、构建稳定整合CMV-TCR的JC5细胞系

将实施例2构建的上述C44、C45等pHAGE-TCR质粒分别与包装质粒psPAX2，pMD2.G以及转染试剂PEI按照一定的比例混合，转染293T细胞。收取48h和72h的细胞培养上清，浓缩后感染对数生长期的JC5细胞(MOI＝0.3)。感染3天后，用抗人CD3和抗人TCRαβ流式抗体对细胞进行染色，将相同TCR表达水平的细胞分选后进行培养，即为JC5-TCR细胞系。

3、TCR上膜情况及亲和力检测

取1×10⁶JC5-TCR细胞，用Brilliant Violet 421^TM anti-human TCRαβ(Biolegend)以及相应的CMVpp65pMHC四聚体-APC(Tetramer-APC)染色，之后进行流式分析。

由图4、5可知，所制备的针对CMV pp65 HLA-A*A1101 ATVQGQNLK的特异C44-TCR、C45-TCR均可以正确表达并且展示在细胞膜外，且与对应四聚体探针具有一定的亲和力。综上结果表明，本申请实施例制备获得的TCR具有良好的亲和力。

实施例4：人原代TCR-T细胞的构建及体外功能检测

1、人类原代T细胞的分离、培养和慢病毒感染

为了进一步验证所筛选到的TCR对CMV pp65抗原的识别和杀伤功能，采用淋巴细胞分离液Ficoll从志愿者的外周血中分离得到单个核细胞(PBMC)，然后根据EasySepHuman T cell isolation kit(stem cell technologies)产品说明书，从PBMC中通过阴选的方法获得T细胞，用含有100U/mL IL2的1640完全培养基将细胞重悬至1×10⁶细胞/mL，培养在抗CD3/CD28抗体包被的培养皿中进行激活。激活48h后，用慢病毒体系将装载有TCR的病毒颗粒(由实施例2制备)感染T细胞，感染方法为32℃下1500rpm离心2h，取出后放在37℃细胞培养箱培养10h，然后通过添换培养基终止感染，并继续放在37℃细胞培养箱进行培养。感染三天后可用流式细胞仪将TCR阳性的细胞分选出来，获得TCR-T细胞(包括上述C44以及C45)。

2.靶细胞的构建

用慢病毒体系将分别装载有pp65-PURO、HLA-A*1101-BSD以及荧光素酶-GFP的病毒颗粒感染对数生长期的Raji细胞。通过药物筛选及流式分选，得到同时稳定表达pp65、HLA-A*1101分子以及荧光素酶-GFP的Raji细胞，命名为Raji-A1101-pp65-荧光素酶。

3.TCR在人原代T细胞中的体外功能验证

将Raji/HLA1101/pp65以及未转pp65的Raji细胞(命名为Raji)分别与1G4-TCR-T、C44-TCR-T、C45-TCR-T细胞按照1：1的数量比例进行共培养后，共培养24小时后，分别收集细胞和上清，初步检测了C44-TCR-T及C45-TCR-T细胞的激活情况及靶细胞的死活情况。从胞外细胞因子IFNγ(见图6)的释放水平来看，C44-TCR-T及C45-TCR-T细胞同靶细胞共孵育后，与对照组1G4-TCR-T相比，可以显著地引起T细胞的激活。且从靶细胞裂解后的释放的荧光素酶量可反映出C44-TCR-T及C45-TCR-T可以显著杀伤靶细胞(见图6)。实验结果证明，本发明实施例构建的C44-TCR-T、C45-TCR-T细胞可以特异性地被CMV pp65抗原肽提呈细胞激活，且能够显著地杀伤靶细胞。

同时，TCRα链和β链的CDR3高变区对TCR的功能影响最大。已有实验证实，CDR3高变区即便高度相似，只相差一个氨基酸，其功能也会相差甚远。例如，将TCR E141的α链和β链的CDR3区首位后的氨基酸依次突变成丙氨酸，构建在慢病毒载体上，制备相应的TCR-T细胞。将其与靶细胞1∶1共培养，检测荧光素酶量以及细胞因子TNFα、IL2和IFNγ的分泌量。结果显示，未突变的E141遇到HLA matched-Raji后能有效的清除靶细胞，并且特异的产生大量的细胞因子IL2。并且，在a3、a5、a6以及b6、b7、b8这些位点，单个氨基酸的突变足以让TCR-T细胞彻底失活(具体参见专利CN202010373100.4)。相应的，突变后的TCR，虽然仅一个氨基酸不同，但足以让TCR-T细胞彻底失活。由此可见，虽然靶点相同，但仅有一个氨基酸不同就会使两个近乎相同的TCR产生完全不同的技术效果，更不用说多个氨基酸不同。

实施例5：动物模型构建及CMV TCR-T体内功能检测

将5×10⁵Raji-HLA-A*1101-pp65-荧光素酶肿瘤细胞通过尾静脉接种给5-6周的NOD/Scid IL-2Rγnull(NCG)雌鼠，构建淋巴瘤模型(见图7)，记为第1天，第6天时，将小鼠分为3个小组，分别为A：PBS注射组(注射等体积PBS)；B：对照NC细胞注射组(NC-T细胞)；C：CMV-TCR-T注射组(C45-TCR-T细胞)，B组小鼠尾静脉注射1×10⁷NC-T细胞，C组小鼠尾静脉注射1×10⁷TCR-T细胞，A组注射等体积200μL PBS。其他TCR-T细胞具体回输量及回输时间见图7。在接下来的几周监测小鼠体内肿瘤细胞生长情况，T细胞体内增殖情况以及小鼠存活情况，如图7-9所示，与对照组比较，本发明实施例构建的CMV特异性C45-TCR-T细胞也能够显著地杀伤小鼠体内肿瘤细胞。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 华夏英泰（北京）生物技术有限公司、清华大学

<120> T细胞抗原受体、其多聚体复合物及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 216

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Ser Glu Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Ser Met Phe Asp Tyr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Tyr Arg Ala Phe Tyr Thr Gly Ala Asn Ser Lys Leu Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Ala Ser Ala Trp Asn Thr Gly Asn Gln Phe Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Gly His Asp Thr

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ser Gly His Arg Ser

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Tyr Phe Ser Glu Thr Gln

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Ser Ser Phe Phe Arg Gly Glu Gly Asn Gln Pro Gln His

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Ser Ser Leu Ala Gly Tyr Lys Gln Glu Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys

1 5

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atttcaggtg tcgtgaagcg gccgcgccac catgggcccc gggctcct 48

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atttcaggtg tcgtgaagcg gccgcgccac catgggctcc aggctgct 48

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tctccagcct gcttcagcag gctgaagtta gtagctccgc ttccgctccg tttccgccgg 60

aaatcctttc tcttgaccat g 81

<210> 17

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gcatgccctg 60

gcttcctgtg g 71

<210> 18

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gccatgctcc 60

tgggggcatc a 71

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agggatcctc tagactcgag ctagctcagc tggaccacag ccgca 45

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caccgtctct cagctggtac acggc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaacgccgtg taccagctga gagac 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccgggctc aaacacagcg acctc 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaacgaggtc gctgtgtttg agccc 25

<210> 24

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Met Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro

1 5 10 15

Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr

20 25 30

Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro

35 40 45

Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu

50 55 60

Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly

65 70 75 80

Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile

85 90 95

Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg

100 105 110

Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn

115 120 125

Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr

130 135 140

Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Glu Gly Arg Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly

165 170 175

Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His

180 185 190

His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly

195 200 205

Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp

210 215 220

Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly

225 230 235 240

Thr Phe Gln Lys Trp Val Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln

245 250 255

Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr

260 265 270

Leu Arg Trp Glu Leu Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln

275 280 285

Lys Ile Glu Trp His Glu

290

<210> 25

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgggtagcc atagcatgcg ctacttctat accagcgtga gtcgtccggg ccgtggtgaa 60

cctcgcttta ttgccgtggg ctatgtggat gacacccagt tcgtgcgctt tgatagcgat 120

gccgcaagtc agcgcatgga accgcgtgcc ccgtggattg aacaagaagg cccggaatat 180

tgggaccaag aaacacgcaa cgttaaggcc cagagccaga cagatcgtgt ggatctgggt 240

acactgcgcg gctattacaa tcagagcgag gatggcagcc acaccattca gatcatgtac 300

ggctgcgatg ttggtccgga cggtcgcttt ttacgtggct accgtcaaga tgcctatgat 360

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<210> 26

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Met Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro

1 5 10 15

Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe

20 25 30

His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile

35 40 45

Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe

50 55 60

Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr

65 70 75 80

Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys

85 90 95

Trp Asp Arg Asp Met

100

<210> 27

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

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atgtaa 306

<210> 28

<211> 561

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

20 25 30

Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

35 40 45

Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp

50 55 60

Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr

65 70 75 80

Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn

85 90 95

Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr

100 105 110

Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val

115 120 125

His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val

130 135 140

Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg

145 150 155 160

Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys

165 170 175

Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp

180 185 190

Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met

245 250 255

Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe

260 265 270

Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser

275 280 285

His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu

290 295 300

Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu

305 310 315 320

Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr

325 330 335

Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp

340 345 350

Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr

355 360 365

Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr

370 375 380

Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp

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Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys

405 410 415

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Ser Ala Ser Thr Ser

420 425 430

Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala

435 440 445

Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro

450 455 460

Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala

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Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu

485 490 495

Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu

500 505 510

Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu

515 520 525

Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln

530 535 540

Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg

545 550 555 560

Gly

<210> 29

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

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<210> 30

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

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Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Phe Phe Arg Gly Glu Gly Asn Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly

115 120 125

Thr Arg Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu

130 135 140

Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys

145 150 155 160

Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu

165 170 175

Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr

180 185 190

Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr

195 200 205

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210 215 220

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Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser

245 250 255

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Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly

275 280 285

Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala

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Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala

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Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

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Met Ser Val Gln Glu Ala Glu Thr Val Thr Leu Ser Cys Thr Tyr Asp

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<210> 31

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atgggccccg ggctcctctg ctgggcactg ctttgtctcc tgggagcagg cttagtggac 60

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<210> 32

<211> 617

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

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Gly Arg Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn

85 90 95

Val Ser Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Ala Gly Tyr Lys Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr

115 120 125

Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

130 135 140

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

195 200 205

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

210 215 220

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Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

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325 330 335

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355 360 365

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385 390 395 400

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405 410 415

Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser

420 425 430

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435 440 445

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485 490 495

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Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu

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Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser

580 585 590

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Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

610 615

<210> 33

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atgggctcca ggctgctctg ttgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg cccagtaaag 60

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ggtcgattct cagggcgcca gttctctaac tctcgctctg agatgaatgt gagcaccttg 300

gagctggggg actcggccct ttatctttgc gccagcagct tggcgggata caagcaagag 360

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cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720

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agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840

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ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc cggcggaaac ggagcggaag cggagctact 960

aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc tatggccatg 1020

ctcctggggg catcagtgct gattctgtgg cttcagccag actgggtaaa cagtcaacag 1080

aagaatgatg accagcaagt taagcaaaat tcaccatccc tgagcgtcca ggaaggaaga 1140

atttctattc tgaactgtga ctatactaac agcatgtttg attatttcct atggtacaaa 1200

aaataccctg ctgaaggtcc tacattcctg atatctataa gttccattaa ggataaaaat 1260

gaagatggaa gattcactgt tttcttaaac aaaagtgcca agcacctctc tctgcacatt 1320

gtgccctccc agcctggaga ctctgcagtg tacttctgtg cagcaagcgc gtggaacacc 1380

ggtaaccagt tctattttgg gacagggaca agtttgacgg tcattccaaa tatccagaac 1440

cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 1500

ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 1560

acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 1620

tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 1680

gacaccttct tccccagccc agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt 1740

gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 1800

ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgctgcggc tgtggtccag ctga 1854

<210> 34

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

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1 5 10 15

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<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

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Val Lys Arg Lys Asp Phe

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<210> 36

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

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<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro

1 5 10 15

Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln

20 25 30

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Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser

195 200 205

Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp

210 215 220

Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu

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Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val

245 250 255

Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu

260 265 270

Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

275 280

<210> 38

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38