具体实施方式

为了更好的理解本发明的实质，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述。

本发提供的一种靶向叶酸受体α嵌合抗原受体，其结构组成依次包括：人CD8α信号肽、结合叶酸受体α的多肽、人免疫球蛋白G1 Fc段、人CD8α铰链区、人NKG2D跨膜段、人2B4胞内段和人CD3ζ胞内段。其跨膜段采用的是NKG2D，而不是在CAR-T经常采用的CD8α跨膜段，且胞内段采用2B4的胞内段作为共刺激结构域而非CAR-T中经常采用CD28、CD134和CD137等共刺激分子。跨膜段和胞内段采用NKG2D-2B4-CD3ζ相比采用CD8α-CD28-CD137-CD3ζ等针对T细胞的激活的结构更加适用于NK细胞，能更好的激活NK细胞杀伤活性。在NK细胞中，采用NKG2D跨膜段能比CD8α跨膜段更好的传递信号；胞内采用2B4共刺激分子结构域和CD3ζ信号域，相比于胞内采用CD28、CD134、CD137和CD3ζ，能赋予CAR修饰的NK细胞更强的肿瘤杀伤活性、增殖能力和存活时间。

实施例一

一、靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体序列设计。

如图1所示，靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体(简称αFR-CAR)中，结合叶酸受体α的多肽的N端与人CD8α信号肽的C端连接，其C端与人免疫球蛋白G1 Fc段的N末端连接，人免疫球蛋白G1 Fc段的C末端与人CD8α铰链区的N端连接组成嵌合抗原受体胞外段。人2B4的胞内段的C端与人CD3ζ胞内段的N端连接组成嵌合抗原受体胞内段。人NKG2D跨膜段的N端与人CD8α铰链区的C末端相连，人NKG2D的跨膜段的C端与人2B4的胞内段的N端连接组成整个靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体。

其中，αFR-CAR各个片段具体序列如下：

1、人CD8α信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGGCCCTCCCAGTTACCGCCCTTCTCCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCC。

2、结合叶酸受体α的多肽为抗叶酸受体α(αFR)抗体的单链可变区(scFv)包括轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)。轻链可变区(V_L)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTC。

重链可变区(V_H)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGT。

抗叶酸受体α(αFR)抗体的单链可变区(scFv)的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTCGGAGGAGGCGGATCAGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGT。

3、人免疫球蛋白G1 Fc段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

GAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGCTCCTGGGGGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCTGGCAAA。

4、人CD8α铰链区的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

GCCAAGCCCACCACTACACCCGCCCCACGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC。

5、人NKG2D跨膜段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

CCATTTTTTTTCTGCTGCTTCATCGCTGTAGCCATGGGAATCCGTTTCATTATTATGGTAACA。

6、人2B4胞内段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

TGGAGGAGAAAGAGGAAGGAGAAGCAGTCAGAGACCAGTCCCAAGGAATTTTTGACAATTTACGAAGATGTCAAGGATCTGAAAACCAGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAGACTTTTCCTGGAGGGGGGAGCACCATCTACTCTATGATCCAGTCCCAGTCTTCTGCTCCCACGTCACAAGAACCTGCATATACATTATATTCATTAATTCAGCCTTCCAGGAAGTCTGGATCCAGGAAGAGGAACCACAGCCCTTCCTTCAATAGCACTATCTATGAAGTGATTGGAAAGAGTCAACCTAAAGCCCAGAACCCTGCTCGATTGAGCCGCAAAGAGCTGGAGAACTTTGATGTTTATTCC。

7、人CD3ζ胞内段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。

8、整个αFR-CAR的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

ATGGCCCTCCCAGTTACCGCCCTTCTCCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGCCCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGAGCATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATAACCTGGTCTCCTGGTACCAGCAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGGCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACGCCGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTCGGAGGAGGCGGATCAGGCGGAGGAGGCTCTGGCGGAGGCGGAAGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCAGGGCGGTCCCTGAGACTCTCCTGCACAACTTCTGGATTCACTTTTGGCGATTATGCTATGATCTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATCTACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGAACGGTACGATTTTTGGAGTGGAATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACCGTCACCGTGAGCAGTGAGCCCAAATCTAGCGACAAAACTCACACATGCCCACCTTGCCCAGCACCTGAGCTCCTGGGGGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCTCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCTGGCAAAGCCAAGCCCACCACTACACCCGCCCCACGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACCCATTTTTTTTCTGCTGCTTCATCGCTGTAGCCATGGGAATCCGTTTCATTATTATGGTAACATGGAGGAGAAAGAGGAAGGAGAAGCAGTCAGAGACCAGTCCCAAGGAATTTTTGACAATTTACGAAGATGTCAAGGATCTGAAAACCAGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAGACTTTTCCTGGAGGGGGGAGCACCATCTACTCTATGATCCAGTCCCAGTCTTCTGCTCCCACGTCACAAGAACCTGCATATACATTATATTCATTAATTCAGCCTTCCAGGAAGTCTGGATCCAGGAAGAGGAACCACAGCCCTTCCTTCAATAGCACTATCTATGAAGTGATTGGAAAGAGTCAACCTAAAGCCCAGAACCCTGCTCGATTGAGCCGCAAAGAGCTGGAGAACTTTGATGTTTATTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。

将设计好的αFR-CAR的多聚核苷酸由上海和元生物技术有限公司合成，并且插入慢病毒表达载体pLenti-EF1α，经测序正确后，使用TIANGEN公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。然后测序验证序列是否正确。

经验证αFR-CAR的全长基因序列正确与设计序列完全一致。

1、αFR-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEGSKRPSGVSNRFSGSKSGNAASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVTWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

2、人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP。

3、抗叶酸受体α(αFR)抗体的单链可变区(scFv)的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEGSKRPSGVSNRFSGSKSGNAASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVSS。

抗叶酸受体α(αFR)抗体的单链可变区(scFv)的轻链可变区(V_L)的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNLVSWYQQHPGKAPKLMIYEGSKRPSGVSNRFSGSKSGNAASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSSLSVVFGGGTKLTVL。

抗叶酸受体α(αFR)抗体的单链可变区(scFv)的重链可变区(V_H)的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：

QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFGDYAMIWARQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERYDFWSGMDVWGKGTTVTVSS。

4、人免疫球蛋白G1 Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPGVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

5、人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：

AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。

6、人NKG2D跨膜段的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，具体为：

PFFFCCFIAVAMGIRFIIMVT。

7、人2B4胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，具体为：

WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS。

8、人CD3ζ胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，具体为：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

实施例二

获得所述包含靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体的慢病毒。具体包括以下步骤：

1、过表达αFR-CAR的慢病毒制备，其设备和材料如下表1所示。

表1过表达慢病毒载体所需的设备和材料

1.2慢病毒的包装：

Day0：将状态良好的293T细胞用胰酶替代物(TrypLE^TM Express)消化、离心、收集，用DMEM培养基(含10％FBS)重悬细胞制成细胞悬液，计数细胞悬液浓度。将293T细胞以4×10⁶个接种于10cm培养皿内培养过夜。

Day1:待细胞长至90％汇合度，提前一个小时更换新鲜培养基，按照Lipofectamine 2000说明书所述进行转染，取两支1.5ml离心管分别加入600μl OPTI-MEM培养基，其中一管中加入αFR-CAR质粒4μg、pLP1质粒3μg、pLP2质粒3μg、pLP/VSVG质粒3μg，轻轻震荡混匀，另一管加入40μl Lipofectamine 2000轻轻混匀。然后将两管轻轻混匀后室温静置5分钟后，将转染复合物加入293T细胞中，放入孵箱中37℃、5％CO₂培养。

Day 2：更换新鲜的DMEM完全培养基。

Day 4：收集293T细胞的培养基上清，2000rpm离心去除细胞碎片和死细胞，然后用0.45μm滤器过滤后备用。

1.3慢病毒的浓缩：

收集的病毒上清4℃，25000rpm(82700g)离心2小时后，弃去上清，加入100μl新鲜培养基4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。溶解后集中病毒悬液分装成50μl每份，保存在-80℃。即得到过表达αFR-CAR慢病毒。

实施例三

宿主细胞可为NK-92细胞、人原代NK细胞、人原代T细胞、人原代巨噬细胞或细胞因子诱导的杀伤细胞中的一种。以NK-92细胞为例说明过表达αFR-CAR的NK-92细胞的构建。

1、所需材料如下表2所示：

表2过表达αFR-CAR的NK-92细胞的构建材料

1.2αFR-CAR的过表达病毒感染NK-92：

1.3将NK-92细胞接种于12孔板中，每孔2×10⁵个细胞(每孔培养基1ml，白细胞介素-2 100U/ml)。

1.4每孔加入50μl实施例二中制备的慢病毒浓缩液以及10μg/ml的聚凝胺。

1.5在37℃、5％CO₂培养过夜并更换新鲜培养基(含100U/ml白细胞介素-2)。

1.6NK-92细胞感染五天后即可实施αFR-CAR-NK-92筛选：

向感染了αFR-CAR慢病毒的NK-92细胞培养基中加入5μg/ml嘌呤霉素后培养6天。其中，每次换液或传代时，均向培养基中加入5μg/ml嘌呤霉素。

1.7αFR-CAR-NK-92筛选完成后，即可进行流式细胞术检测表达情况，具体步骤为：收集上述细胞并用PBS洗一遍；采用表2中抗体染色室温孵育30分钟后使用PBS洗涤一遍，离心收集细胞；100μl PBS重悬细胞上机检测。

流式细胞术检测结果如图2所示，由图可知，靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体修饰NK-92细胞(αFR-CAR-NK-92)阳性率很高。

对上述获得的αFR-CAR-NK-92细胞的杀伤效应进行检测。

1.所需材料如下表3所示：

表3检测αFR-CAR-NK-92细胞杀伤效应材料

2.采用测定LDH释放的方法检测本方法得到的αFR-CAR-NK-92对结直肠癌细胞杀伤:

LDH释放检测实验各孔的加液设置：ER和ESR孔中分别加入效应细胞悬液50μl，在ER、TMR和TSR孔中分别加入靶细胞悬液50μl，在ESR、TMR和TSR孔中分别加入1640培养基、NK培养基、NK培养基各50μl，在CMB、VCC孔中分别加入培养基100μl。(每孔设置2个复孔)

ER指效应细胞加靶细胞释放的LDH；ESR指效应细胞自发释放的LDH；TSR指靶细胞自发释放的LDH；TMR指靶细胞最大释放(加裂解液)；CMB指空白培养基；VCC指体积校正孔(空白培养基加裂解液)

2.1Day 0：靶细胞铺板：消化离心收集HCT-116细胞，无血清的1640培养基重悬，经细胞计数使细胞密度至5×10⁴/ml，在96孔板中每孔接种50ul细胞悬液，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

2.2Day 1：效应细胞铺板：按NK-92正常传代方法制备不同效靶比(1：1；5：1；10：1；20：1)的NK-92、NK-92-EV、αFR-CAR-NK-92细胞悬液，在对应的孔中接种50ul细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养18h。其中，αFR-CAR-NK-92分别包括两种：一种是αFR-CAR-NK-92(T细胞元件)是现有的CAR结构构建的CAR-NK-92细胞，一种是αFR-CAR-NK-92(NK细胞元件)为本发明CAR结构构建的CAR-NK-92细胞。αFR-CAR-NK-92(T细胞元件)结构为：人CD8α信号肽、结合叶酸受体α的多肽、人免疫球蛋白G1 Fc段、人CD8α铰链区、人CD28跨膜段、人CD28胞内段、人CD3ζ胞内段。

2.3Day 2：检测：①在TMR和VCC孔中分别加入10μl裂解液，裂解细胞，培养箱中继续培养30分钟。②每孔中加入100μl工作液，室温、避光5分钟。③每孔加入50μl终止液，酶标仪上检测在490nm的吸光度。

结果计算：

杀伤效率＝(ER-ESR-TSR+CMB)/(TMR-VCC-TSR+CMB)×100％。

LDH释放实验的结果如图3所示，由图可知，αFR-CAR-NK-92(即αFR-CAR-NK-92(NK细胞元件)对HCT-116细胞有很强杀伤作用。而采用现有针对T细胞设计的CAR结构的αFR-CAR-NK-92(即：αFR-CAR-NK-92(T细胞元件))的杀伤作用是小于本发明针对NK细胞设计的αFR-CAR-NK-92的，说明通过本方法设计的CAR结构在NK细胞中是优于现有CAR结构。

酶联免疫吸附实验(ELISA)检测αFR-CAR-NK-92的TNF-α和IFN-γ的释放：

Day 0：靶细胞铺板：将靶细胞HCT116按每孔2×10⁴个接种于24孔板中，培养过夜待其贴壁。

Day 1：加入效应细胞共培养：实验组加入4×10⁵个效应细胞(NK-92、EV-NK-92、αFR-CAR-NK-92(T细胞元件)、αFR-CAR-NK-92(NK细胞元件))，而对照组只加入4×10⁵个效应细胞。每个组设3个复孔，共培养24h。

Day 2：收集上清ELISA检测TNF-α和IFN-γ：收集共培养上清，1500rpm离心10min去除细胞和碎片，收集上清。

ELISA检测步骤：①按说明书进行标准品的稀释、生物素标记抗人TNF-α/IFN-γ抗体工作液以及亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备，稀释好的ABC和TMB显色液预先在37℃平衡30分钟以上。②将7个不同稀释浓度的标准品各100μl加入一排酶标板孔中，另外1孔只加样品稀释液，作为零孔。其余孔中加收集的细胞培养上清100μl，酶标板封上封板膜，37℃孵育90分钟。③甩去酶标板内液体，对着吸水纸拍几下，每孔加入生物素抗人TNF-α或IFN-γ抗体工作液，TMB空白显色孔不加，封上封板膜，37℃孵育60分钟。④洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟，每孔洗液300μl。⑤每孔加入100μl ABC工作液，TMB空白显色孔不加。酶标板封上封板膜，37℃孵育30分钟。⑥洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡2分钟，每孔洗液300μl。⑦每孔加入90μl TMB显色液，37℃避光反应20分钟。⑧每孔加入100μl TMB终止液，用酶标仪测定在450nm波长的OD值。

ELISA的结果图如图4所示，由图可知，αFR-CAR-NK-92(NK细胞元件)与HCT-116细胞共培养时，能分泌更多TNF-α和IFN-γ，其作用显著强于αFR-CAR-NK-92(T细胞元件)，说明本法设计的CAR结构在NK细胞中是优于现有CAR结构。

由上述实验结果可知：利用制备得到的靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体转染慢病毒，并感染NK-92细胞后，靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体可表达于NK-92细胞中，即采用本发明的方法可构建靶向叶酸受体α的嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞(αFR-CAR-NK-92)。体外实验表明αFR-CAR-NK-92与HCT-116细胞共培养时，能较现有技术分泌更多TNF-α和IFN-γ且对HCT-116细胞有很强杀伤作用。

以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在申请待批的本发明的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 靶向叶酸受体α嵌合抗原受体、其制备方法及其应用

<130> 211-120

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2403

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 人CD8α信号肽

<222> (1)..(63)

<220>

<221> 轻链可变区（VL）

<222> (64)..(393)

<220>

<221> 抗人叶酸受体α（αFR）的单链可变区（scFv）

<222> (64)..(798)

<220>

<221> 重链可变区（VH）

<222> (439)..(798)

<220>

<221> 人免疫球蛋白G1 Fc段

<222> (799)..(1494)

<220>

<221> 人CD8α铰链区

<222> (1495)..(1638)

<220>

<221> 人NKG2D跨膜段

<222> (1639)..(1701)

<220>

<221> 人2B4胞内段

<222> (1639)..(2061)

<220>

<221> 人CD3ζ胞内段

<222> (2063)..(2403)

<400> 1

atggccctcc cagttaccgc ccttctcctg cccctggccc tgctgctgca cgccgcccgc 60

ccccagtctg ccctgactca gcctgcctcc gtgtctgggt ctcctggaca gagcatcacc 120

atctcctgca ctggaaccag cagtgatgtt gggagttata acctggtctc ctggtaccag 180

cagcacccag gcaaagcccc caaactcatg atttatgagg gcagtaagcg gccctcaggg 240

gtttctaatc gcttctctgg ctccaagtct ggcaacgccg cctccctgac aatctctggg 300

ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgccagtcct atgacagcag cctgagtgtg 360

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctcggaggag gcggatcagg cggaggaggc 420

tctggcggag gcggaagcca ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggcct ggtgcagcca 480

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