一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用
阅读说明：本技术 一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用 (Tumor micro-acid-responsive fusion protein and application thereof ) 是由 秦志海 王发展 娄筱寒 张莉 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种融合蛋白及其应用。具体为一种肿瘤微环境酸响应融合蛋白及其在肿瘤治疗中的应用；该融合蛋白从C端到N端依次包含：具有肿瘤微环境弱酸响应性pHLIP的氨基酸序列、间隔基和CCL21。所述融合蛋白以CCL21为靶点,重塑肿瘤微环境中肿瘤相关淋巴管至周围组织间的CCL21浓度梯度,抑制肿瘤淋巴转移。本发明的融合蛋白的活性域CCL21更接近天然CCL21功能,可以更好地锚定到肿瘤细胞表面,有效地发挥通过重塑肿瘤微环境治疗肿瘤的作用,对乳腺肿瘤或前列腺肿瘤的治疗,尤其是对三阴性乳腺肿瘤的治疗,效果更为显著。(The invention discloses a fusion protein and application thereof. In particular to a tumor microenvironment acid response fusion protein and application thereof in tumor treatment; the fusion protein comprises the following components from C end to N end in sequence: amino acid sequence, spacer and CCL21 of pHLIP with weak acid response of tumor microenvironment. The fusion protein takes CCL21 as a target spot to remodel the CCL21 concentration gradient from a tumor-related lymphatic vessel to peripheral tissues in a tumor microenvironment and inhibit tumor lymphatic metastasis. The active domain CCL21 of the fusion protein disclosed by the invention is more similar to the function of natural CCL21, can be better anchored to the surface of a tumor cell, effectively plays a role in treating tumors by remodeling a tumor microenvironment, and has a more remarkable effect on treatment of breast tumors or prostate tumors, particularly treatment of triple-negative breast tumors.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病率为女性恶性肿瘤的第一位，其发病率和死亡率逐年上升。三阴性乳腺肿瘤(TNBC)占每年乳腺癌确诊病例的10-20％，恶性程度高，转移性强，一直是乳腺癌研究的热点和治疗的难点。由于不表达雌激素受体、孕激素受体和HER-2，TNBC患者无法从常规的内分泌治疗和抗HER-2治疗中获益。目前，TNBC的治疗手段有限，且缺乏针对性的治疗策略，与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC患者预后较差，主要由于其更易复发转移。肿瘤转移，尤其是淋巴转移是TNBC患者治疗失败的主要原因，抑制淋巴转移对改善TNBC患者预后具有重要意义，也是许多科研工作者在基础医学和临床研究工作中亟待解决的难题。
刊载于药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2018,53(3):375-382《低pH插入肽研究概况》的论文，公开了细胞外微酸环境已成为肿瘤等疾病诊断和治疗的有效靶点。低pH插入肽(pH low insertion peptides,pHLIPs)是一种可以靶向细胞外微酸环境的多肽载体,这种载体可将负载物以低pH依赖方式选择性转运至病变细胞。借助化疗方法治疗癌症的最大问题是药物给健康组织带来的毒性,使用pHLIP将药物以低pH依赖方式靶向转运至癌细胞,在保证药物对癌细胞有杀伤效应的前提下大大减小了其对健康组织的毒性。pHLIPs家族具有非常广阔的应用前景,不仅可用于靶向酸性病变组织,还可通过改变氨基酸序列调节pHLIP性质,进而调节其药动学特性及靶向性。此外,pHLIP可用于研究新型药物递送系统:①单分子转运研究可适用于将极性药物传递到病变组织；②pHLIPs与脂质体或纳米粒的结合可促进细胞膜变形融合,有效运送药物至细胞质或细胞膜。
中国药学杂志2020年2月第55卷第4期刊载《低pH插入肽修饰的载siRNA脂质体的制备与体外评价》的论文，公开了核酸类(siRNA等)药物在疾病的治疗上具有高度特异性、安全和靶点多样性等独特优势。但其游离形式在体内容易被核酸酶(RNase)降解、半衰期短、转染效率低，这大大限制了其临床应用。该实验设计构建一种微酸环境敏感的脂质体载体，用于实现siRNA(小干扰RNA)的肿瘤组织水平、细胞水平甚至细胞器水平的高效定位递送。方法采用薄膜分散法，以二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)为膜材制备空白脂质体；用两亲性材料SA-R8压缩siR-NA，再与空白脂质体孵育制备载siRNA脂质体；将端基功能化的磷脂(DSPE-PEG2000-MAL)与低pH插入肽(pHLIP)反应连接，再与载siRNA脂质体孵育融合，构建低pH插入肽修饰的载siRNA脂质体；借助动态光散射原理，流式细胞术和激光共聚焦技术，表征脂质体的粒径及分布，监测细胞摄取、胞内转运与分布特征。结果是制备的载siRNA脂质体平均粒径在150～190nm内；在pH6.5环境下siRNA的细胞摄取量显著高于pH7.4环境；并且siRNA能很好地定位在细胞质。结论是该载体显示出了较强的pH敏感性，在微酸环境下可以显著提高siRNA的肿瘤细胞摄取水平。
中华核医学与分子影像杂志2019年8月第39卷第8期刊载《荧光标记的低pH插入肽靶向乳腺癌酸性微环境的显像研究》的论文，公开了利用荧光标记低pH插入肽(pHLIP)显像，分析其在体外不同pH环境下与乳腺癌细胞膜的亲和力及其在乳腺癌荷瘤裸鼠体内的动态分布特征。方法通过红色荧光染料罗丹明B及近红外荧光染料青色素5(Cy5)分别标记pHLIP轻基端(B-pHLIP和Cy5-pHLIP)，进行体外和体内荧光显像。分析在体外不同pH值(7.8、7.4、7.0和6.6)环境下B-pHLIP与MDA-MB-231乳腺癌细胞膜结合的荧光强度及其对细胞活性的影响。体内观测Cy5-pHLIP在肿瘤及各组织脏器不同时间点(2h、24h、3d和7d)的动态荧光分布、荧光强度变化及肿瘤/本底比值(T/NT),并进行离体组织的荧光显像。采用单因素方差分析和最小显著差异t检验分析数据。结果pH值6.6、7.0、7.4和7.8时B-pHLIP在细胞内相对荧光强度分别为(100.00±9.70)％、(69.90±5.50)％,(19.80±1.40)％和(0.40±0.04)％,其中pH值6.6时的相对荧光强度最高，与其他组相比差异有统计学意义(F＝230.504,￠＝5.029～17.669,均P<0.05)。pHLIP对细胞活性没有显著影响。荷瘤裸鼠尾静脉注射Cy5-pHLIP后2h、24h、3d和7d的T/NT分别为3.42±0.27、3.00±1.23、3.38±0.62、3.51±0.37,差异无统计学意义(F＝0.192,P>0.05)。离体荧光分布显示,Cy5-pHLIP在肿瘤组织内有较高浓聚，同时大肠段有大量pHLIP分布。结论pHLIP在细胞外酸性微环境下与肿瘤细胞膜的亲和力显著增加。Cy5-pHLIP能够在体内长效、可视化监测pHLIP的靶向肿瘤分布，但pHLIP在肠道的分布增加了肿瘤显像判读的复杂性。
申请号为201410323457.6，发明名称为一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用的中国专利，公开了一种肿瘤血管阻断剂多肽，编码其的基因，表达其的表达载体以及其在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。该发明的肿瘤血管阻断剂多肽从N端到C端依次包含：截断的组织因子tTF的氨基酸序列、连接子和肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。该发明的肿瘤血管阻断剂多肽能够通过pHLIP定位到肿瘤血管内皮细胞表面，从而特异的在肿瘤血管产生血栓，阻断肿瘤部位血液供应，达到治疗肿瘤的目的；并且，由于其活性域(tTF)具有接近其天然的结构，因此与现有技术的肿瘤靶向肽介导组织因子相比具有更好的凝血活性。
申请号为201811028594.1，发明名称为一种人组织因子凝血复合物的中国专利，公开了一种tTF-PHLIP融合蛋白，本发明方法将人组织因子(tTF)基因构建于慢病毒表达载体中，经过筛选后获得稳定表达细胞株,再通过差速离心等的方法，获得具有局部快速止血功能的高效凝血复合物。真核表达修饰后的tTF-PHLIP融合蛋白固定于细胞质膜上并形成二次跨膜结构，再经过上述方法，获得具有局部快速止血功能，以及伤口感染预防、促进伤口愈合、防止组织黏连等作用的高效凝血复合物。
申请号为201911208044.2，发明名称为靶向肿瘤的CD38-pHLIP融合肽的中国专利，公开了靶向肿瘤的CD38-pHLIP融合肽。本发明的融合肽是由低pH插入肽与CD38的功能结构域连接而成。肿瘤微环境呈酸性，在酸性环境下，低pH插入肽可插入到肿瘤细胞膜上，利用低pH插入肽的上述性质，将与其连接的CD38靶向定位在肿瘤细胞膜表面，该项技术使得原来肿瘤细胞表面不表达CD38的肿瘤细胞也可被CD38标记，从而使得针对CD38的抗体药物可对原来并不表达CD38的肿瘤细胞同样发挥作用。本发明的研究成果扩大了一种特定肿瘤抗体药物的适应症，临床应用前景良好。
总之，通过对已公开论文和专利文献的检索，至今未见本发明的实质性的内容被公开。
侵袭和转移是恶性肿瘤的主要特征，肿瘤细胞通过输入淋巴系统进行淋巴转移是肿瘤患者发生恶性转移致死的主要途径之一。临床研究表明，过表达趋化因子受体7(CCR7)的肿瘤患者更易复发转移，CCR7在乳腺癌、食管鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤细胞表面过表达，这种过表达与肿瘤细胞的淋巴转移密切相关。CCR7及其配体CCL21介导的信号可调控肿瘤细胞迁移，提示CCL21/CCR7信号轴可作为治疗肿瘤淋巴转移的新靶点。
有研究者构建了表达CCL21的小鼠前列腺癌细胞，将其接种至小鼠体内，发现肿瘤微环境中过量的CCL21可抑制CCR7+前列腺癌的远处转移，延长荷瘤小鼠的生存期。然而，这种机制方面的研究不具有实际应用的可能。有研究报道，瘤内注射CCL21可通过招募T细胞发挥抗肿瘤作用。然而，由于肿瘤的高渗透压，瘤内注射的方式无法使得CCL21滞留在肿瘤内部；此外，作为一种侵入性的操作，瘤内注射具有促进肿瘤转移的风险。近期，有研究者将表达CCR7 trap的基因递送系统靶向递送至肿瘤部位，肿瘤细胞表达的CCR7 trap分泌到细胞外与其表面的CCR7结合，阻断了CCL21/CCR7信号轴介导的肿瘤细胞向肿瘤相关淋巴管迁移，进而抑制肿瘤淋巴转移。然而，肿瘤微环境对肿瘤的生长和转移有着至关重要的作用，此技术忽略了CCL21可招募T细胞。针对现有技术的不足，本发明通过重塑肿瘤微环境发挥抗肿瘤的作用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种以CCL21为靶点，重塑肿瘤微环境中肿瘤相关淋巴管至周围组织间的CCL21浓度梯度，抑制肿瘤淋巴转移的技术方案。具体为提供一种肿瘤微环境酸响应融合蛋白以及其在治疗肿瘤药物中的应用，本发明的融合蛋白的活性域CCL21更接近天然CCL21功能，可以更好地锚定到肿瘤细胞表面，有效地发挥通过重塑肿瘤微环境治疗肿瘤的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤微环境酸响应融合蛋白，该融合蛋白从C端到N端依次包含：具有肿瘤微环境弱酸响应性pHLIP的氨基酸序列，间隔基和CCL21。
优选地，所述CCL21的氨基酸序列如下所示(从N端到C端)：SDGGGQDCCLKYSQKKIPYS IVRGYRKQEP SLGCPIPAIL FLPRKHSKPE LCANPEEGWV QNLMRRLDQP PAPGKQSPGCRKNRGTSKSG KKGKGSKGCK RTEQTQPSRG
所示的氨基酸序列即为CCL21的氨基酸残基序列，当其处于游离状态时，无法持久锚定到细胞膜表面；当其通过微酸响应性多肽定位于肿瘤血管内皮细胞膜上时，则会持久锚定到细胞膜表面，重塑肿瘤微环境，抑制肿瘤原位生长和转移。
优选地，所述微酸响应性多肽pHLIP的氨基酸序列如下所示(从N端到C端)：AEQNPIYWAR YADWLFTTPL LLLDLALLVD ADEGT，该微酸响应性多肽pHLIP在肿瘤部位的微酸性环境中能够产生构象变化，形成α-螺旋结构，并穿过细胞膜，从而定位于肿瘤细胞膜。
优选地，所述间隔基由5-50个、又优选5-30个、更优选15个氨基酸构成，本发明中所述间隔基具有如下所示的氨基酸序列(从N端到C端)：GGGGSGGGGSGGGGS；所述间隔基能够使表达得到的融合蛋白活性域(即趋化因子CCL21)和肿瘤微环境弱酸响应性域(即pHLIP)的功能保持完整。
优选地，本发明所述肿瘤微酸响应性融合蛋白的氨基酸序列如下所示(从N端到C端)。SDGGGQDCCL KYSQKKIPYS IVRGYRKQEP SLGCPIPAIL FLPRKHSKPE LCANPEEGWVQNLMRRLDQP PAPGKQSPGC RKNRGTSKSG KKGKGSKGCK RTEQTQPSRG GGGGSGGGGS GGGGSAEQNPIYWAR YADWLFTTPL LLLDLALLVD ADEGT
本发明还公开了上述肿瘤微酸响应性融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用；优选在制备治疗乳腺肿瘤或前列腺肿瘤药物中的应用；更优选在制备治疗三阴性乳腺肿瘤药物中的应用。
本发明的技术方案产生技术功能的机理如下：
重塑肿瘤组织CCL21梯度可抑制TNBC淋巴转移。CCL21主要由淋巴内皮细胞产生，其通过与细胞表面的糖胺聚糖等结合可形成淋巴管至周围组织由高到低的浓度梯度。DCs向表达CCL21的淋巴管移动，这种方向性与淋巴管至周围组织间趋化因子CCL21由低到高的浓度梯度一致，而额外给予大量CCL21掩盖CCL21浓度梯度可显著抑制DCs向淋巴管迁移。CCL21的非典型受体CCRL1可以在淋巴结的局部空间清除CCL21，维持CCL21的浓度梯度。在不改变淋巴结CCL21表达总量的前提下，敲除CCRL1可以逆转淋巴结局部CCL21浓度梯度，调控CCR7+细胞的淋巴结内迁移。表达CCR7的肿瘤细胞同样能够响应CCL21浓度梯度进行细胞迁移，重塑肿瘤相关淋巴管至周围组织间CCL21梯度可抑制TNBC淋巴转移。如果阻断CCL21/CCR7信号轴介导的肿瘤细胞向肿瘤相关淋巴管迁移，即有希望阻止肿瘤的远处转移，从而达到治疗的目的。但是，若使用不能结合到细胞表面的CCL21，在进行相同的处理后，DCs的淋巴迁移则无显著变化，提示CCL21结合到细胞表面形成CCL21浓度梯度对其生物学效应发挥至关重要。
以CCL21为靶点，重塑肿瘤微环境中肿瘤相关淋巴管至周围组织间的CCL21浓度梯度具有抑制TNBC淋巴转移的潜力，与阻断CCL21/CCR7信号轴介导的肿瘤细胞向肿瘤相关淋巴管迁移相比，重塑肿瘤相关淋巴管至周围组织间CCL21浓度梯度，利用CCL21/CCR7信号轴介导的细胞迁移具有明显的优势，主要表现为，重塑CCL21浓度梯度不仅可以阻断CCL21/CCR7信号轴介导的肿瘤细胞向淋巴管迁移，还可以使得肿瘤组织招募更多的免疫细胞发挥抗肿瘤作用。因此，特异性重塑肿瘤相关淋巴管至周围组织间CCL21浓度梯度是本发明技术方案的重要技术手段。
肿瘤的弱酸性微环境为重塑CCL21浓度梯度提供了良好的契机。肿瘤微环境由肿瘤细胞、多种基质细胞以及细胞外成分构成，其对肿瘤生长、转移及抗癌药物疗效发挥方面有重要影响。大部分实体瘤具有弱酸性的特征，实体瘤的弱酸性特征为为重塑CCL21浓度梯度提供了良好的契机。
多肽pHLIP在肿瘤的弱酸性微环境中发生构象改变，使得其C端插入细胞内而N端保留在细胞外，通过多肽pHLIP与抗体的化学偶联物可通过pHLIP的酸响应性将抗体锚定到肿瘤细胞膜表面，使自然杀伤细胞发挥抗体依赖细胞介导的细胞毒作用从而实现高效的肿瘤治疗效果。化学合成存在制备工艺复杂且质量难以控制的问题，蛋白融合技术可在一定程度上避免上述问题。
间隔基(linker)的设计是融合蛋白的关键技术之一，连接融合蛋白两种成分的linker不能影响两端蛋白的自然折叠，保证目的蛋白各自的功能互不影响。发明人在生物治疗和药用生物大分子靶向递送等领域已开展的大量研究工作发现linker的长度可显著影响纳米药物与细胞的相互作用。合理设计酸响应性CCL21，通过linker的引入，使融合蛋白的两种成分分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，更有利于CCL21在肿瘤部位发挥趋化活性，进而抑制TNBC淋巴转移。
本发明创新性地通过利用能够响应弱酸性环境发生构象改变的pHLIP，在linker长度和柔性优化的基础上，设计肿瘤微环境酸响应性CCL21融合蛋白，从而较好地达到治疗肿瘤的目的。
实验证明，本发明所述的肿瘤微环境酸响应性融合蛋白，能够响应肿瘤微酸性环境的特点，产生构象变化，形成α-螺旋结构，从而定位于肿瘤细胞，并重塑肿瘤微环境CCL21浓度梯度，从而能够特异地在招募T淋巴细胞到肿瘤组织，抑制肿瘤细胞向淋巴管迁移，达到抑制肿瘤生长和淋巴转移的治疗目的。
综上所述，本发明在linker长度和柔性优化的基础上，设计肿瘤微环境酸响应性CCL21融合蛋白(pHLIP-CCL21)，响应肿瘤的弱酸性微环境将CCL21锚定到肿瘤细胞表面进而重塑肿瘤组织的CCL21浓度梯度，从而有效地达到了治疗肿瘤淋的目的，为开发具有自主知识产权的肿瘤淋巴转移生物治疗药物奠定基础。
本发明的有益效果是：本发明所述的微酸响应性融合蛋白pHLIP-CCL21的pHLIP组分在体外能够响应弱酸性环境发生构象改变，从而将CCL21锚定到肿瘤细胞表面，重塑CCL21浓度梯度，不仅可以阻断CCL21/CCR7信号轴介导的肿瘤细胞向淋巴管迁移，还可以使得肿瘤组织招募更多的免疫细胞发挥抗肿瘤作用，达到抑制肿瘤的原位生长和淋巴转移的目的。
附图说明
图1是根据本发明实施例1融合蛋白pHLIP-CCL21的表达和纯化检测结果，(A)pHLIP-CCL21融合蛋白的示意图，(B)质粒酶切图片，(C)SDS-PAGE检测pHLIP-CCL21的分子量；
图2是根据本发明实施例2pHLIP-CCL21体外响应弱酸性环境锚定到细胞表面的流式细胞仪检测结果，(A)CCL21和pHLIP-CCL21分别在pH 7.4条件下与4T1-luc孵育一段时间后流式细胞仪检测其锚定到肿瘤细胞表面的情况(B)CCL21和pHLIP-CCL21分别在pH 6.8条件下与4T1-luc孵育一段时间后流式细胞仪检测其锚定到肿瘤细胞表面的情况；
图3是根据本发明实施例3pHLIP-CCL21体外响应弱酸性环境锚定到肿瘤细胞膜表面的显微镜检测结果，(A)pHLIP-CCL21分别在pH 6.8和pH 7.4条件下与4T1-luc孵育一段时间后共聚焦显微镜检测其锚定到肿瘤细胞表面的情况，标尺为50μm；
图4是根据本发明实施例4pHLIP-CCL21体内抑制肿瘤淋巴转移，(A)不同处理组小鼠TNBC原位肿瘤体积随时间变化曲线，(B)不同处理组小鼠体重随时间变化曲线，(C)流式细胞术检测岗哨淋巴结内肿瘤细胞，n＝6，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1.融合蛋白pHLIP-CCL21的表达和纯化。如图1
(1)质粒构建及验证
扩增目的基因片段：设计引物，通过PCR扩增出足够量的产物。
目的片段及载体连接：通过Nco I和Xho I酶连接酶将PCR产物和克隆载体pET28a进行连接。
酶切：对克隆载体进行酶切，将外源基因通过酶连至终载。
获得重组质粒：连接液转入TOP10感受态中，检测筛选出阳性克隆进行验证。
(2)融合蛋白pHLIP-CCL21的表达
转化：将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，42℃热激后涂布在含有30μg/ml卡那霉素的平板上，37℃培养；
活化：挑取单克隆菌落到含有30μg/ml卡那霉素的液体培养基中37℃培养；
诱导：当OD值达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，继续培养，分别于20℃条件下培养过夜，37℃条件下培养6h，未添加诱导剂的为阴性对照；
收集菌体：4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
表达检测：在收集到的菌体中加入缓冲液悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶解。离心收集上清和沉淀，沉淀使用缓冲液进行溶解，分别对上清和沉淀蛋白进行制样，准备上胶检测。
确定条件再表达：在含30μg/ml卡那霉素的培养基中培养菌液，当OD值达到0.6时，添加0.5mM诱导剂IPTG，20℃条件下培养过夜进行大量表达，离心收集细胞菌体。
(3)融合蛋白pHLIP-CCL21的纯化
收集变性粗蛋白：细胞菌体用缓冲液溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白。
平衡：取5ml Ni-NTA，用5倍柱床体积的缓冲液清洗平衡柱子，流速5ml/min；
孵育：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；
上柱：将孵育后的产物上柱，收集流出；
平衡：用缓冲液清洗平衡柱子；
洗杂：用缓冲液洗柱子，并收集流出；
洗脱：用缓冲液洗脱，收集流出；
酶切：将纯化后融合蛋白pHLIP-CCL21加TEV酶4℃酶切，结束后二次过镍柱。
透析浓缩：将纯化后的组分4加0.2％SKL后透析到蛋白保存缓冲液50mM Tris,300mM NaCl,2mMDTT,pH 8.0中，透析结束后用PEG20000浓缩。
纯化检测：对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理，制样，准备SDS-PAGE检测。
实施例2.融合蛋白pHLIP-CCL21的体外微酸性环境响应性如图2
对数生长期的4T1-luc接种到24孔板中培养过夜(调整培养液pH 6.8或者7.4)，将等体积的CCL21或pHLIP-CCL21添加到孔板中使得孔板中CCL21的浓度为1000ng/ml。作用不同2h后，离心收集细胞，PBS洗涤2遍，之后使用CCL21抗体对细胞表面结合的CCL21进行染色，PBS洗涤2遍，之后使用FITC标记的第二抗体进行染色，PBS洗涤2遍，通过流式细胞术分析细胞表面CCL21的结合情况。
实施例3融合蛋白pHLIP-CCL21的体外响应弱酸性环境锚定到肿瘤细胞表面。如图3
对数生长期的4T1-luc接种到用于共聚焦拍照的玻底皿中(3万/mL)培养过夜，调整培养液至pH6.8或者7.4，将等体积的PBS或Cy5荧光基团标记的pHLIP-CCL21(2μg/mL)添加到孔板和玻底皿中。作用4h后弃去培养液，预冷的PBS洗涤3遍，对玻底皿中的细胞进行激光共聚焦拍照，分析pHLIP-CCL21响应弱酸性环境锚定到细胞表面的CCL21的情况。
激光共聚焦拍照结果表明pHLIP-CCL21在体外能够响应弱酸性环境锚定到细胞表面。
实施例4.融合蛋白pHLIP-CCL21的体内抗肿瘤实验如图4
对数生长期的4T1-LUC-GFP(稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的小鼠三阴性乳腺癌细胞株)接种到6-7周龄、雌性BALB/c乳房脂肪垫(每只小鼠注射的体积为100μL，细胞数为100万个)，建立小鼠TNBC原位模型。接种当天测量小鼠体重，荷瘤小鼠接种后第5天开始，每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，第二次测量肿瘤体积以后，根据小鼠肿瘤体积和体重，将TNBC原位模型小鼠随机分为3组，分别为生理盐水注射液(NaCl)阴性对照组、CCL21组和pHLIP-CCL21组，每组设6只动物。于肿瘤接种后第9天开始治疗，通过瘤内注射的方式给药，每2天给药一次，共注射3次。在接种后第30天，断颈处死小鼠，收集肿瘤岗哨淋巴结。通过研磨的方式制备淋巴结单细胞悬液，由于肿瘤细胞稳定表达绿色荧光蛋白，可通过流式细胞术对淋巴结内的肿瘤细胞进行检测。结果显示：pHLIP-CCL21与CCL21相比，能够显著抑制TNBC转移与原位肿瘤生长速度，显著降低岗哨淋巴结内肿瘤细胞的数量。此外，pHLIP-CCL21处理后小鼠体重无明显变化，提示pHLIP-CCL21可能具有较好的生物安全性。
CCL21氨基酸序列：
SDGGGQDCCL KYSQKKIPYS IVRGYRKQEP SLGCPIPAIL FLPRKHSKPE LCANPEEGWVQNLMRRLDQP PAPGKQSPGC RKNRGTSKSG KKGKGSKGCK RTEQTQPSRG
CCL21核酸序列：
agtgatggagggggtcaggactgctgccttaagtacagccagaagaaaattccctacagtattgtccgaggctataggaagcaagaaccaagtttaggctgtcccatcccggcaatcctgttctcaccccggaagcactctaagcctgagctatgtgcaaaccctgaggaaggctgggtgcagaacctgatgcgccgcctggaccagcctccagccccagggaaacaaagccccggctgcaggaagaaccggggaacctctaagtctggaaagaaaggaaagggctccaagggctgcaagagaactgaacagacacagccctcaagaggatag
pHLIP氨基酸序列:AEQNPIYWAR YADWLFTTPL LLLDLALLVD ADEGT
pHLIP核酸序列：
gctgaacagaacccgatctactgggctcgttacgctgactggctgttcaccaccccgctgctgctgctggacctggctctgctggttgacgctgacgaaggtacc
间隔基氨基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGS；
间隔基核酸序列：
ggaggaggcggatctgggggtggtggcagtggtgggggaggtagc
融合蛋白氨基酸序列：
SDGGGQDCCL KYSQKKIPYS IVRGYRKQEP SLGCPIPAIL FLPRKHSKPE LCANPEEGWVQNLMRRLDQP PAPGKQSPGC RKNRGTSKSG KKGKGSKGCK RTEQTQPSRG GGGGSGGGGS GGGGSAEQNPIYWAR YADWLFTTPL LLLDLALLVD ADEGT
融合蛋白核酸序列：
gctgaacagaacccgatctactgggctcgttacgctgactggctgttcaccaccccgctgctgctgctggacctggctctgctggttgacgctgacgaaggtaccggaggaggcggatctgggggtggtggcagtggtgggggaggtagtagtgatggagggggtcaggactgctgccttaagtacagccagaagaaaattccctacagtattgtccgaggctataggaagcaagaaccaagtttaggctgtcccatcccggcaatcctgttctcaccccggaagcactctaagcctgagctatgtgcaaaccctgaggaaggctgggtgcagaacctgatgcgccgcctggaccagcctccagccccagggaaacaaagccccggctgcaggaagaaccggggaacctctaagtctggaaagaaaggaaagggctccaagggctgcaagagaactgaacagacacagccctcaagaggatag
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 郑州大学和郑州大学第一附属医院
<120> 一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Lys Lys
1 5 10 15
Ile Pro Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu
20 25 30
Gly Cys Pro Ile Pro Ala Ile Leu Phe Ser Pro Arg Lys His Ser Lys
35 40 45
Pro Glu Leu Cys Ala Asn Pro Glu Glu Gly Trp Val Gln Asn Leu Met
50 55 60
Arg Arg Leu Asp Gln Pro Pro Ala Pro Gly Lys Gln Ser Pro Gly Cys
65 70 75 80
Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser
85 90 95
Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Gln Thr Gln Pro Ser Arg Gly
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agtgatggag ggggtcagga ctgctgcctt aagtacagcc agaagaaaat tccctacagt 60
attgtccgag gctataggaa gcaagaacca agtttaggct gtcccatccc ggcaatcctg 120
ttctcacccc ggaagcactc taagcctgag ctatgtgcaa accctgagga aggctgggtg 180
cagaacctga tgcgccgcct ggaccagcct ccagccccag ggaaacaaag ccccggctgc 240
aggaagaacc ggggaacctc taagtctgga aagaaaggaa agggctccaa gggctgcaag 300
agaactgaac agacacagcc ctcaagagga tag 333
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
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35
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gctgaacaga acccgatcta ctgggctcgt tacgctgact ggctgttcac caccccgctg 60
ctgctgctgg acctggctct gctggttgac gctgacgaag gtacc 105
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<212> PRT
<213> 人工合成
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1 5 10 15
Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser
50 55 60
Gln Lys Lys Ile Pro Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr Arg Lys Gln Glu
65 70 75 80
Pro Ser Leu Gly Cys Pro Ile Pro Ala Ile Leu Phe Ser Pro Arg Lys
85 90 95
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gggggtggtg gcagtggtgg gggaggtagt agtgatggag ggggtcagga ctgctgcctt 180
aagtacagcc agaagaaaat tccctacagt attgtccgag gctataggaa gcaagaacca 240
agtttaggct gtcccatccc ggcaatcctg ttctcacccc ggaagcactc taagcctgag 300
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