一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和小孢子提取方法
阅读说明：本技术 一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和小孢子提取方法 (Bud screening method and microspore extraction method suitable for tetraploid Chinese cabbage free microspore culture ) 是由 刘晓东 王明秋 孟川 吴芳 王玉海 牟金贵 陈占良 马蕾 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及大白菜游离小孢子培养技术领域,公开了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法。取四倍体大白菜花序由外向内的第三圈花蕾,其花瓣长度和花药长度之比小于等于1/2,该方法得到的花蕾进行游离小孢子的提取,小孢子处于单核靠边期,适宜四倍体大白菜游离小孢子培养,能够为四倍体大白菜游离小孢子再生植株的培育提供技术基础。(The invention relates to the technical field of free microspore culture of Chinese cabbage, and discloses a bud screening method suitable for free microspore culture of tetraploid Chinese cabbage and an extraction method of free microspore of tetraploid Chinese cabbage. Taking a third round of buds of the tetraploid Chinese cabbage from outside to inside in inflorescence, wherein the ratio of the length of petals to the length of anthers is less than or equal to 1/2, extracting free microspores from the buds obtained by the method, wherein the microspores are in a mononuclear border period, and the method is suitable for culturing the free microspores of the tetraploid Chinese cabbage and can provide a technical basis for culturing regeneration plants of the free microspores of the tetraploid Chinese cabbage.)
技术领域
本发明涉及大白菜游离小孢子培养技术领域，尤其涉及一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法。
背景技术
大白菜游离小孢子培养和植株再生因其影响因素居多，诱导培养促其多数基因型材料出胚或出胚材料提高出胚率，需要特定的培养技术，其中用于游离小孢子培养的花蕾选择标准是其首要的技术之一。十字花科作物的花粉小孢子发育分为四分体时期、单核时期、双核时期和三核时期，并非任何时期的小孢子都适于培养，单核时期又可细分为单核早期、单核中期和单核靠边期；不同阶段的花粉小孢子对外界刺激的敏感程度不同，因而小孢子诱导出胚结果不同。
不同种植物适宜培养的小孢子所处的发育阶段有所不同。Sato等首次成功地进行大白菜游离小孢子培养所选用的大白菜花蕾的长度为2.0mm～2.5mm，该长度的花蕾中大多数小孢子处于单核靠边期，所以研究认为单核靠边期的小孢子最适合进行游离小孢子培养。筛选提取单核靠边期的小孢子，花蕾选取是关键。传统的花蕾选取方法仅靠显微镜观察选择花蕾，因花蕾大小范围较广，费时费工，提取游离小孢子效率低下。
小孢子的分离有三种方法，一种是漂浮培养法，即将花药接种于液体培养基上，任其内花粉自由释放，然后离心培养；二是磁搅拌法，即将花药放入盛有一定量培养基或渗透剂的三角瓶中，置于磁力搅拌仪上，低速旋转，使小孢子随搅拌逐渐溢出，直至花药呈透明，离心、培养；三是挤压法，这是最早的花粉分离方式。目前在芸薹属植物中绝大多数研究者采用第三种方法。然而目前国内外多家单位均开展了开展了大白菜游离小孢子(n＝10)培养研究，明确了相关二倍体大白菜游离小孢子的提取培养方法，对四倍体大白菜游离小孢子的提取方法并未有相关报道。
发明内容
由鉴于此，本发明提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法和四倍体大白菜游离小孢子的提取方法，旨在为四倍体大白菜游离小孢子培养选准花蕾提供形态标准、规范的游离小孢子提取方法及技术体系的建立提供依据。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法，取四倍体大白菜花蕾，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，满足以下条件：
其中，L1为花瓣长度，L为花药长度。
优选的，所述花蕾取四倍体大白菜花序由外向内的第三圈花蕾。
优选的，所述四倍体大白菜花蕾的取样时间在上午9点-11点，花蕾外表皮干燥时进行。
优选的，所述取样在3月下旬至5月上旬大白菜开花期间取样。
优选的，所述四倍体大白菜花蕾的长度为1.5-2mm。
本发明的另外一个目的在于提供从上述方法得到的花蕾中提取游离小孢子的方法，包括以下步骤：将四倍体大白菜花蕾进行消毒，然后置于B5培养基中，挤压花蕾使小孢子充分游离到B5培养基中，尼龙纱网过滤，得到的小孢子提取液用低速离心机离心，去除上清液，所得沉淀物即为四倍体大白菜游离小孢子。
优选的，所述消毒液为0.1％的升汞(HgCl2)溶液。
优选的，所述挤压花蕾B5培养基用量为5-8ml，尼龙过滤网规格为300目。
优选的，所述过滤液进行离心需采用转速为1000转保持5分钟或1200转保持3分钟，重复B5培养基清洗和离心过程。
优选的，所述四倍体大白菜游离小孢子需加入NLN培养基制成悬浮液进一步优选加入10ml的NLN培养基。
进一步的，所述四倍体大白菜游离小孢子悬浮液分装于直径6cm的培养皿中，每皿5ml液体。作为一种实施方式，游离小孢子悬浮于10ml NLN液体培养基中，然后分装于直径6cm的10个培养皿中，每皿1ml悬浮液，每皿添加NLN培养基4ml。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾筛选方法，通过对四倍体大白菜的花瓣和花药长度与小孢子发育时期对应关系进行研究，能够为四倍体大白菜游离小孢子培养选准花蕾提供形态标准，提高四倍体大白菜游离小孢子花蕾的选取效率。同时本发明还对应提供了从上述花蕾中提取游离小孢子的方法，为四倍体大白菜游离小孢子再生植株的培育提供技术基础。
附图说明
图1：大白菜花蕾的解剖结构图；
图2：大白菜花蕾的外观形态取样部位图；
图3：大白菜游离小孢子显微镜形态鉴定；
图4：大白菜游离小孢子采用不同规格尼龙纱网过滤的效果图。
具体实施方式
本发明以四倍体大白菜资源为试材开展四倍体大白菜游离小孢子(n＝20)培养研究，探索相应的培养技术方法，提供了不同于二倍体大白菜游离小孢子培养的四倍体大白菜游离小孢子培养技术体系。
本发明筛选适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾，包括以下步骤：取四倍体大白菜花蕾，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，从花蕾的解剖结构筛选适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾。图1为花蕾剥去萼片后内部的解剖结构图，L1为花瓣长度，L为花药长度。二倍体最佳蕾为不同于二倍体的是，四倍体取样最佳蕾为
四倍体大白菜游离小孢子适宜培养的时期与二倍体相同，均为单核靠边期，但外观形态取样部位完全不同。图2为大白菜花蕾的外观形态取样部位图。二倍体取蕾一般取花序从外向内第二圈蕾，而四倍体则需要取花序从外向内第三圈蕾。结果证明，适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾较二倍体更小，通常长度为1.5-2mm。
作为一种可选的实施方式，本发明的大白菜花蕾在3月下旬-5月上旬大白菜开花期间取样。优选在上午在9点-11点，花蕾外表皮干燥时进行取样。
本发明还提供了一种从花蕾中提取四倍体游离小孢子的方法，采用花蕾挤压后离心提取小孢子，具体的，取适宜数量的花蕾置于培养中，挤压花蕾使小孢子充分游离到培养基中，过滤网过滤，离心，所得沉淀物即为大白菜游离小孢子。四倍体因小孢子体积偏大，因此本发明要求采用300目尼龙纱网过滤，这不同于二倍体要求的400目。四倍体游离小孢子提取要求离心机转速为1000～1200转离心3～5分钟，可选的为1000转/5分钟或1200转/3分钟，这也不同于二倍体要求的800转/5分钟。其他步骤，二倍体和四倍体小孢子可采用相同的方式。
作为一种实施方式，花蕾数量可选30-35枚。所述花蕾采用本发明以上方法进行采取。采取后的花蕾进行消毒后可进行游离小孢子的提取。优选将采摘的大白菜花蕾用0.1％升汞(HgCl2)表面消毒，无菌水冲洗。
作为一种实施方式，所述培养基采用B5培养基。过滤得到的沉淀物用B5培养基冲洗2～3次。
作为一种实施方式，所得黄色沉淀物即大白菜游离小孢子悬浮于NLN液体培养基中。用血球计数板调整孢子悬浮液中小孢子的密度，优选为0.5-1×105个/ml。
作为一种实施方式，本发明将30～35个花蕾的游离小孢子悬浮于10ml的NLN液体培养基摇匀。将提取得到的游离小孢子悬浮液分装到6cm的培养皿中培养，每皿1ml小孢子悬浮液，然后再加入4ml NLN液体培养基，保证每皿液体5ml。现有研究报道每皿中用2ml悬浮液进行二倍体小孢子的培养，防止小孢子溺毙；也有研究称放10ml悬浮液防止液体蒸发变干。但不同于二倍体，本发明试验结果显示2ml会蒸发变干造成四倍体小孢子旱死，而采用10ml因培养基过多转移时极易造成外溢，污染极其严重，所以本发明选用每皿5ml液体培养四倍体游离小孢子最佳。
本发明上述提取四倍体游离小孢子的方法，能够为四倍体大白菜游离小孢子再生植株的培育提供技术基础。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中所用B5培养基、NLN液体培养基为本领域中的常规已知培养基，按照本领域中的常规方法配置而成。
实施例1
筛选适宜四倍体游离小孢子的花蕾
在3月下旬-5月上旬大白菜开花期间，上午9点-11点，花蕾外表皮干燥时进行取样。
取四倍体大白菜的花序，取从外向内第三圈蕾。对采摘的花蕾进行解剖，剥去花蕾萼片，分别测量花蕾的花瓣长度和花药长度，取满足以下条件的花蕾作为适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾：
其中，L1为花瓣长度，L为花药长度。
对比例1
在3月下旬-5月上旬大白菜开花期间，上午9点之后，花序上无露水时进行花蕾的取样。取四倍体大白菜的花序，取从外向内第二圈蕾。
实施例2
提取四倍体游离小孢子
培养基的消毒和保存：将B5培养基置于高压灭菌锅灭菌，120℃，20min，冷却后常温保存；NLN液体培养基在超净台上以高压灭菌锅灭过菌的盘式过滤器，孔径0.22μm直径15cm的混纤微滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱保存。
按照实施例1所述方法采摘花蕾，剔除裂蕾和虫伤蕾，用0.1％升汞(HgCl2)表面消毒5min，无菌水冲洗3次，备用。
将30-35个花蕾置于15ml试管中，加入经高温灭菌的B5培养基5-8ml，用灭菌玻璃棒轻轻挤压花蕾，使小孢子充分游离到溶液中。用300目尼龙网过滤，并将悬浮液收集于离心管中，1000转/5分钟或1200转/3分钟离心，弃去上清液。再加入B5培养基冲洗2次离心，倒掉上清液只剩下黄色的沉淀物(小孢子)。加入10ml的NLN液体培养基摇匀，此时孢子悬浮液中小孢子的密度为0.5-1×105个/ml。将孢子悬浮液分装入10个直径6cm的培养皿，每皿1ml，然后再加入4ml NLN培养基，保证每皿液体5ml，用Parafilm膜封口。
实施例3
离体小孢子的细胞学观察
小孢子离体期间，和早期胚胎发
按照实施例1和对比例1的方法取四倍体大白菜花蕾，按照实施例2的方法提取游离小孢子，用0.3％品红染液染色后，用倒置显微镜观察小孢子形态变化和细胞分裂情况。小孢子分裂为3瓣的为最佳时期，4瓣以上过期，2瓣以下尚未到期。如图3所示：左图为对比例1提取得到的小孢子，图中仅有2个适宜的小孢子，表明该蕾整体已经长过期了；右图为实施例1提取得到的小孢子，图中半数以上都处于3瓣期，表明该蕾为最佳的蕾。
说明本发明的方法能够筛选到适宜四倍体大白菜游离小孢子培养的花蕾，方法简便，提高了四倍体大白菜游离小孢子花蕾的筛选效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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