艾滋病病毒n肽融合抑制剂fppr-n36及其应用
阅读说明：本技术 艾滋病病毒n肽融合抑制剂fppr-n36及其应用 (AIDS virus N peptide fusion inhibitor FPPR-N36 and application thereof ) 是由 庄敏 凌虹 原晨 于 2021-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种艾滋病病毒N肽融合抑制剂FPPR-N36及其应用,所述的N肽融合抑制剂的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示。本发明的N肽融合抑制剂选取HIV-1gp41N端融合肽近端(FPPR)的10个氨基酸(HXB2,Env,536-545)与N36(HXB2,Env,546-581)相连,确保可以形成完整的α螺旋结构。此外,本发明还检测了该N肽融合抑制剂对不同亚型HIV-1假病毒和细胞膜融合的的抑制效果、与CHR形成的6股螺旋束(6HB)的α螺旋比例及稳定性以及与CHR的相互作用的能力。结果表明,相较于已知的N36抑制剂,本发明的N肽融合抑制剂更稳定,且具有广谱性,对HIV-1的抑制能力也更强,且可抑制N36和IZN36筛选出的抵抗突变株。因此,本发明的提出为抗艾滋病病毒药物的研制提供了更多的、更具有抑制潜力的选择。(The invention discloses an HIV N peptide fusion inhibitor FPPR-N36 and application thereof, wherein the amino acid sequence of the N peptide fusion inhibitor is shown as SEQ ID NO: 1. The N peptide fusion inhibitor of the invention selects 10 amino acids (HXB2, Env, 536-581) near end (FPPR) of HIV-1gp41N end to be connected with N36(HXB2, Env, 546-581) to ensure that a complete alpha helical structure can be formed. In addition, the invention also tests the inhibition effect of the N-peptide fusion inhibitor on different subtypes of HIV-1 pseudoviruses and cell membrane fusion, the alpha helix proportion and stability of 6-strand helix bundle (6HB) formed by CHR and the capability of interacting with CHR. The results show that compared with the known N36 inhibitor, the N peptide fusion inhibitor of the invention is more stable, has broad spectrum, has stronger HIV-1 inhibiting capability and can inhibit the resistant mutant strains screened by N36 and IZN 36. Therefore, the invention provides more choices with more inhibition potential for the development of anti-HIV drugs.)
技术领域
本发明涉及一种艾滋病病毒N肽融合抑制剂，还涉及该抑制剂在抑制HIV- 1中的应用，属于多肽抑制剂(药物)领域。
背景技术
艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是一种有包膜的球形病毒颗粒，包膜蛋白由表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41构成。gp41含有胞外区、跨膜区和胞质区，其中胞外区是促使膜融合的关键。胞外区含有5个功能区：融合肽(FP)、融合肽近端(FPPR)、N末端重复区域(NHR)、C末端七重复区域(CHR)和近膜区(MPER)。FP含有多个疏水氨基酸，可以插入细胞膜，促使6股螺旋束(6HB)的形成，FP16(gp160512-527)是最具代表性的FP核心序列，含有疏水性的氨基酸且结构灵活，具有促进插入细胞膜的作用。FPPR(gp160528-541)呈螺旋结构，可以与MPER相互作用，同时还可以增加gp41的Tm值，从而增加三聚体的稳定性。NHR和CHR含有多个七疏水重复序列，按顺序分为a，b，c，d，e，f，g位。其中NHR可自发形成ɑ螺旋，组成三聚体卷曲螺旋(coiled-coil core)。HIV侵入靶细胞的过程分为三个步骤:(1) gp120通过CD4结合位点(CD4bs)与CD4结合，导致可变区V1和V2的变化，暴露辅助受体CCR5和CXCR4的结合位点，V3区与辅助受体结合后改变gp120构象，进而使gp41构象发生改变，疏水性FP暴露，插入并固定在宿主细胞膜表面；(2)3个CHR通过反向平行的方式与自发形成三聚体卷曲螺旋的NHR结合，形成6HB；(3)病毒膜与宿主细胞膜逐渐拉近，形成融合孔(fusionpore)，病毒基因组通过融合孔进入细胞内，完成融合过程。病毒的融合过程为抗病毒药物的研发提供了精准的靶点，融合肽抑制剂是衍生于gp41 NHR或CHR序列的人工合成肽，作用于自然状态的病毒或融合中间体，与gp41的相应部分结合形成异源性6HB，抑制CHR与NHR形成病毒自身6HB，从而抑制膜融合和病毒进入靶细胞。N肽抑制剂的抑制机制分为两个方面，一方面以单体或二聚体形式与gp41的NHR相互作用，形成异源三聚体，从而干扰病毒6HB的形成。另一方面是自发形成三聚体卷曲螺旋，靶向暴露的gp41 CHR，形成异源性6HB，从而阻止病毒自身6HB的形成，三聚体形式的抑制剂溶解度好，抑制潜力也明显增加。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有艾滋病病毒N肽抑制剂体外筛选后抵抗突变株出现，提供了一种可以抑制N36和IZN36的抵抗突变株的艾滋病病毒N肽融合抑制剂。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一种艾滋病病毒N肽融合抑制剂，命名为FPPR-N36，所述的N 肽融合抑制剂的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
本发明的一种艾滋病病毒N肽融合抑制剂选取HIV-1gp41 N端融合肽近端 (FPPR)的10个氨基酸(HXB2,Env，536-545)与N36(HXB2,Env，546- 581)相连，确保可以形成完整的α螺旋结构。同时，本发明还检测了N肽抑制剂对不同亚型HIV-1假病毒和细胞膜融合的的抑制效果、与CHR形成的6 股螺旋束(6HB)的α螺旋比例及稳定性以及与CHR的相互作用的能力。结果表明，相较于已知的N36抑制剂，本发明的N肽融合抑制剂更稳定，且具有广谱性，对HIV-1的抑制能力也有所增强。
编码所述的艾滋病病毒N肽融合抑制剂的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。
同时，本发明还提出了所述的艾滋病病毒N肽融合抑制剂在制备抑制艾滋病病毒药物中的用途。
其中，优选的，所述的艾滋病病毒为HIV-1。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种新型的艾滋病病毒N肽融合抑制剂，命名为FPPR- N36，该N肽融合抑制剂是由HIV-1gp41 N端融合肽近端(FPPR)的10个氨基酸(HXB2,Env，536-545)与N36(HXB2,Env，546-581)相连后得到，本发明通过分子构象模拟预测N肽抑制剂的结构，确保其可以形成完整的α螺旋。假病毒感染抑制实验和细胞融合抑制实验检测N肽抑制剂对不同亚型假病毒和细胞膜融合的抑制效果。圆二色光谱(CD)实验检测N肽抑制剂形成的卷曲螺旋及其与CHR(C34)形成的6HB的α螺旋比例及稳定性。非变性凝胶电泳(Native-PAGE)检测N肽抑制剂与CHR的相互作用形成的6HB的量。结果表明，相较于已知的N36抑制剂，本发明的N肽融合抑制剂更稳定，且具有广谱性，对HIV-1的抑制能力也更强。
附图说明
图1是N肽融合抑制剂FPPR-N36的分子构象模拟的模式图。
图2是N肽融合抑制剂FPPR-N36对HIV-1不同亚型假病毒感染的抑制效果的结果图。N36为单体对照。
图3是N肽融合抑制剂FPPR-N36形成的卷曲螺旋及其与C34形成6HB螺旋比例和稳定性的结果图。
圆二色谱(CD)实验分析N肽抑制剂形成的α螺旋结构(A)及抑制剂本身的稳定性(C)；N肽抑制剂与C34形成6HB的α螺旋结构(B)及6HB的稳定性(D)。
图4是非变性凝胶电泳(Native-PAGE)测定N肽融合抑制剂FPPR-N36和 C34形成6HB情况的结果图。
第一泳道是N36，由于携带正电荷，在电泳中移出胶板，因而没有条带；第二泳道是C34，由于带有负电荷，显现条带。第三、四泳道是N肽与C34形成的6HB。
图5 N肽抑制剂对HIVN36抵抗株的抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
艾滋病病毒N肽融合抑制剂FPPR-N36的氨基酸序列为：Thr-Leu-Thr-Val- Gln-Ala-Arg-Gln-Leu-Leu-Ser-Gly-Ile-Val-Gln-Gln-Gln-Asn-Asn-Leu-Leu-Arg- Ala-Ile-Glu-Ala-Gln-Gln-His-Leu-Leu-Gln-Leu-Thr-Val-Trp-Gly-Ile-Lys-Gln-Leu- Gln-Ala-Arg-Ile-Leu(SEQ ID NO:1)。
一、N肽融合抑制剂FPPR-N36构象模拟
利用SWISS Model预测N肽融合抑制剂FPPR-N36的空间构象，pymol软件分析N肽融合抑制剂FPPR-N36的分子构象。N肽融合抑制剂FPPR-N36的分子构象模拟的模式图如图1所示，通过分子构象模拟预测N肽抑制剂的结构，确保可以形成完整的α螺旋。
二、N肽融合抑制剂FPPR-N36对不同亚型的HIV假病毒感染的抑制效果
1.Env假病毒的构建：首先提取Env真核表达质粒pCDNA3.1-Env和骨架质粒psG3Δenv。然后进行真核细胞转染实验：将人胚肾293T细胞(购自美国 ATCC)以5×105个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将1μg psG3Δenv和1 μg pCDNA3.1-Env融合蛋白表达载体转染至293T细胞内，所用的转染试剂为 Lipofectamine LTX(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书，实验中选择的HIV-1毒株及亚型如表1所示，分别按照上述方法构建得到不同亚型的HIV假病毒。
表1实验中选择的HIV-1毒株亚型及嗜性
2.假病毒半数组织细胞感染量(TCID50)检测：用含有DEAE的培养液稀释假病毒，DEAE的终浓度为7.5μg/mL。将12.5μL上述构建得到的假病毒加入孔内进行5倍梯度稀释，将TZM-bl细胞以1×104个/孔的密度铺于96孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。培养48h后加入等量Bright- GloTM Luciferase assay底物，取100μL混合液加入96孔黑色化学发光检测板中，放入ModulusTMII检测仪读取发光值。
3.假病毒感染抑制实验：假病毒稀释为终浓度100倍TCID50/孔。用含有DEAE的培养液稀释N肽抑制剂N36和FPPR-N36，DEAE的终浓度为7.5 μg/mL。进行二倍梯度稀释，将稀释好的N肽抑制剂依次加到96孔深孔板中，与病毒按体积1：1混合。将96孔细胞培养板中的培养液吸出，取100μL孵育后的病毒-N肽抑制剂混合物加入相应的孔中，再将TZM-bl细胞以1×104个/孔的密度铺于96孔板内，37℃继续培养48h。培养48h后加入等量Bright-GloTMLuciferase assay底物，取100μL混合液加入96孔黑色化学发光检测板中，放入ModulusTMII检测仪读取发光值，结果如表2、图2所示。
表2 N肽抑制剂对不同亚型假病毒感染的抑制效果
4.细胞融合抑制实验：首先提取Env真核表达质粒和pSCTZα、pRev和 pSCTZω(Carol D.Weiss)。1)293T细胞转染：将293T细胞(购自美国 ATCC)以5×105个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将0.1μg Env表达质粒、1μg pSCTZα及0.6μg pRev转染至293T细胞内，所用的转染试剂为 Lipofectamine LTX(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。2)RC4 细胞转染：将RC4细胞(来自俄勒冈健康与科学大学)以5×105个/孔的密度铺于6孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，将1.6μgpSCTZω转染至RC4细胞内，所用的转染试剂为Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen)，转染操作参考试剂说明书。3) 293T细胞和RC4细胞融合：将转染后的293T细胞以1×104个/孔的密度铺到 96孔板中。放入孵箱中孵育6h。4)6h后将转染后的RC4细胞以1×104个/孔的密度铺到同一个96孔板中。5)将N肽融合抑制剂N36wt以及FPPR-N36在 96孔深孔板中进行系列梯度稀释后加入96孔细胞培养板里，过夜孵育。6)按照GalactoStar试剂盒说明书的要求进行配置和操作，最后放入ModulusTMII检测仪读取荧光值，结果如表3所示。
表3 N肽抑制剂对HIV Env细胞-细胞融合实验的抑制效果
三、N肽融合抑制剂FPPR-N36的α螺旋形成情况及稳定性
圆二色谱实验(Circular dichroism，CD)：将N肽用超纯水溶解，C肽用 pH7的PBS缓冲液溶解，12000r/min，离心10min，无不溶物。取9μL的6M 盐酸胍加入1μL储存液使其10倍稀释且变性，用NanoDrop 2000读取protein A280的值，对N肽、C肽进行计算定量。将N肽抑制剂FPPR-N36或N36wt 和C34的储存液用含有20mM磷酸钠盐和0.2M氯化钠的肽抑制剂缓冲液稀释，配制终浓度为10μM终体积为200μL的混合液，37℃孵育30min。用 Chirascan圆二色谱仪在20℃条件下进行检测，其中扫描范围为300-190nm，谱带宽度为1.0nm，反应时间为4.0s，扫描速度为5nm/min。去掉buffer的背景值从而得到α螺旋的曲线图。α螺旋构象的特征是常在208nm和222nm处呈负峰。通过208和222nm处的负值来检测α螺旋的形成情况。选定波长222nm 处，以1℃/min的速度使温度从4℃上升到95℃，从而对肽的热稳定性进行检测，对得到的曲线进行平滑处理，计算中点温度即Tm值，且Tm值与多肽的稳定性成正比例。逆向变性95℃～4℃用同样方式检测。结果如图3所示。
四、N肽融合抑制剂FPPR-N36与C34形成6HB的情况
非变性凝胶电泳实验(Native-PAGE)：将N肽抑制剂FPPR-N36或 N36wt和C34的储存液用含有20mM磷酸钠盐和0.2M氯化钠的肽抑制剂缓冲液配成浓度为40μM、终体积为25μL的样品，37℃水浴孵育30min。取4μL 的6×Non-reduced Loading Buffer(0.35M Tris-HClpH6.8，30％甘油，10％ SDS，0.012％溴酚蓝)加入到20μL上述处理好的样品中，125V，2h电泳。电泳完成后，取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250中，放入空气震荡器振荡中染色 2h。染色完成后，放入脱色液中，室温放入空气震荡器振荡脱色，直到脱色完全。用GIS-2010凝胶成像分析系统进行拍照。结果如图4所示。
五、N肽融合抑制剂对HIV N36抵抗株的抑制效果
将前期研究中利用HIV-1JR野生型毒株体外培养筛选出的对N肽融合抑制剂N36和IZN36抵抗的突变株JR-Q577R E648K和JR-E560K Q577R T641I 两种包膜(2012JBC)构建假病毒，进行假病毒抑制实验，方法同上。结果发现，N肽融合抑制剂FPPR-N36可以有效抑制两种突变株，其IC50分别为 4.08μM和3.65μM。
序列表
<110> 哈尔滨医科大学
<120> 艾滋病病毒N肽融合抑制剂FPPR-N36及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln
1 5 10 15
Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln
20 25 30
Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu
35 40 45
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