一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用 (Preparation method and application of grass carp TNF-alpha recombinant protein ) 是由 许国晶 张金路 马汝芳 朱永安 巩俊霞 杜兴华 王志忠 李壮 张明磊 于 2021-03-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用,属于鱼类分子免疫学技术领域。本发明通过构建重组质粒转入表达菌株,并使用IPTG诱导表达草鱼TNF-α,优化表达条件,纯化获得目标蛋白TNF-α,并进一步验证了制备得到的TNF-α重组蛋白具有促进pIgR的基因和蛋白表达的作用,从而增强草鱼免疫功能,因此具有良好的实际应用之价值。(The invention provides a preparation method and application of grass carp TNF-alpha recombinant protein, belonging to the technical field of fish molecular immunology. The invention constructs recombinant plasmid and transfers the recombinant plasmid into an expression strain, uses IPTG to induce and express the TNF-alpha of the grass carp, optimizes expression conditions, purifies and obtains the target protein TNF-alpha, and further verifies that the prepared TNF-alpha recombinant protein has the function of promoting the expression of the gene and the protein of pIgR, thereby enhancing the immune function of the grass carp, and having good value of practical application.)
技术领域
本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)由活化的单核细胞、巨噬细胞和T细胞分泌，因可以在体内抑制并杀伤肿瘤细胞而得名。除了能使肿瘤细胞发生出血性坏死外，TNF-α还可以参与机体炎性反应和免疫应答的调节，具有促进细胞生长、分化、凋亡等重要作用。目前为止，TNF-α基因已经在许多种鱼中被克隆，包括：河豚、牙鲆、虹鳟、金头鲷、鳜鱼、斑马鱼、鲤鱼、金鱼等。从已有的研究看来，鱼类TNF-α的生物学功能和哺乳动物的TNF-α存在相似之处，也有不同之处。例如，重组金鱼TNF-α能诱导巨暖细胞的趋化反应、吞唾作用、呼吸爆发反应。重组虹鳟TNF-α能增强白细胞的迁移和吞噻作用，并能上调IL-1、IL-8、TNF-α和COX-2等基因的表达。重组金头鲷TNF-α能诱导吞噬性粒细胞向注射位点的快速募集和头肾组织中粒细胞的生成，但它对鼠的L929成纤维细胞却没有细胞毒的作用。另外，重组金头鲷TNF-α和重组鲤鱼TNF-α不能直接激活吞唆细胞，而是通过刺激内皮细胞间接地激活吞哩细胞。这说明鱼类和脊椎动物的TNF-α是有种属特异性的。以上研究表明，鱼类的TNF-α在免疫调节反应中起到重要的作用。
草鱼具有饲料成本低、价格稳定、经济效益明显等特点，是我国水产养殖的一种优良主养或配养鱼种。为追求经济效益最大化，国内养殖户多采取高密度精养方式，但这一养殖方式却为鱼类的疾病传播，特别是病毒性疾病的暴发提供了便利条件。草鱼对应激反应敏感，在养殖过程中病害频发，死亡率较高，疾病防治成本日益增大。这些因素每年使得草鱼养殖业遭受巨大的经济损失。因此克隆、重组表达和分离纯化草鱼TNF-α，研究利用重组草鱼TNF-α防治草鱼疾病的方式方法，这种免疫制剂具有的非特异的广谱性抗病活性，使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，同时对其他养殖鲤科鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用。本发明通过构建重组质粒转入表达菌株，并使用IPTG诱导表达草鱼TNF-α，优化表达条件，纯化获得目标蛋白TNF-α，并进一步验证了制备得到的TNF-α具有促进pIgR的基因和蛋白表达的作用，从而增强草鱼免疫功能，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将草鱼TNF-α目的基因连入载体质粒中构建TNF-α的重组表达载体；
S2、将上述重组表达载体导入宿主菌，获得TNF-α的重组菌株，诱导重组菌株表达，获得TNF-α重组蛋白。
其中，所述步骤S1其具体方法包括：
采用基于PCR的精确合成法(PCR-based Accurate Synthesis，PAS)，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因TNF-α(Genbank：JQ040498.1)，并连入载体质粒中。
其中，所述载体质粒可以为pCZN1、pMAL-c5x和pET-32a，相对应的，设计三对引物，序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示。
经研究发现，TNF-α构建到pET32a呈包涵体形式表达、而在pCZN1表达不明显，而构建到pMAL-c5x则以上清形式表达，对pMAL-c5x破碎后的上清进行Ni亲和纯化，获得纯度很高的目的表达蛋白，无其他明显杂带存在，因此优选载体质粒为pMAL-c5x。
所述步骤S2中，所述宿主菌可为真核菌类或原核菌类，例如，但不限于，农杆菌、酵母菌、大肠杆菌等；考虑到实施便利性和可控性等，进一步优选为大肠杆菌，如大肠杆菌Arctic Express。
诱导重组菌株表达可采用IPTG作为诱导剂进行，优选的，所述诱导诱导重组菌株表达方法包括：诱导表达温度为30-40℃(进一步优选为37℃)，诱导表达时间为3-5h(进一步优选为4h)，诱导剂为IPTG，所述IPTG的添加终浓度为0.1-1.0mM，进一步优选为0.5mM。
所述制备方法还包括对获得的TNF-α重组蛋白进行纯化，所述纯化方法包括采用Ni柱进行纯化。
本发明的第二个方面，提供上述制备方法获得的草鱼TNF-α重组蛋白。
本发明的第三个方面，提供上述草鱼TNF-α重组蛋白在如下任意一种或多种中的应用：
1)促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；
2)提高鱼类免疫能力；
3)制备鱼类免疫增强剂；
4)防治鱼类疾病。
其中，所述鱼类为淡水鱼，优选为鲤科鱼类，更进一步优选为草鱼。
与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
上述技术方案通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼TNF-α，优化表达条件，通过上清纯化方式纯化目标蛋白TNF-α，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼TNF-α蛋白；所得的TNF-α重组蛋白再经转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。
上述技术方案制备得到的TNF-α重组蛋白可促进pIgR的基因和蛋白表达，增强草鱼免疫功能，使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中TNF-α重组表达图；其中，A是pMAL-c5x-TNF-α诱导表达结果；B是pET-32a(+)-TNF-α诱导表达结果；C是pCZN1-TNF-α诱导表达结果；其中A-C中M是标准分子量蛋白的考马斯亮蓝染色结果；1表示IPTG未诱导重组质粒结果；2表示IPTG诱导重组质粒表达结果；3表示IPTG诱导重组质粒破碎后上清结果；4表示IPTG诱导重组质粒破碎后沉淀结果。
图2为本发明实施例中的Ni柱亲和纯化TNF-α电泳图；其中，M是标准分子量蛋白；1-2表示超声波破碎处理后结果；3-5表示250mM咪唑洗脱结果，分子量为62.83kDa。
图3为本发明实施例中的抗His单抗的转印免疫印迹检测结果图；其中，M是标准分子量蛋白；1表示TNF-α与抗His单抗孵育结果。
图4为本发明实施例中的不同浓度TNF-α刺激后L8824细胞pIgR基因表达水平变化结果图。
图5为本发明实施例中的TNF-α刺激L8824细胞不同时长后pIgR基因表达水平变化结果图。
图6为本发明实施例中的不同浓度TNF-α刺激后L8824细胞pIgR蛋白水平变化结果图。
图7为本发明实施例中的TNF-α刺激L8824细胞不同时长后pIgR蛋白水平变化结果图；其中，A表示L8824细胞总细胞pIgR蛋白水平变化ELISA结果；B表示L8824细胞培养液上清中pIgR分泌量的ELISA结果。
图8为本发明实施例中的TNF-α与抑制剂PDTC刺激L8824细胞后pIgR基因表达水平变化结果图。
图9为本发明实施例中的TNF-α与抑制剂PDTC刺激L8824细胞后pIgR蛋白表达水平变化结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因TNF-α(Genbank：JQ040498.1)，分别连入载体pCZN1的BamHI(GGATCC)-HindIII(AAGCTT)位点之间、连入载体pET-32a(+)的无缝克隆位点和XhoI(CTCGAG)位点之间、连入载体pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)位点之间；获得的重组质粒pCZN1-TNF-α、pET-32a(+)-TNF-α、pMAL-c5x-TNF-α转入转入Arctic-Express。使用IPTG诱导表达草鱼pIgR，优化表达条件后分析pCZN1-TNF-α、pET-32a(+)-TNF-α表达的目标蛋白部分呈包涵体形式表达、pMAL-c5x-TNF-α表达的目标蛋白部分呈可溶形式表达。为方便后续研究及应用，通过上清纯化方式，纯化目标蛋白TNF-α，Ni柱亲和纯化获得目标蛋白。
所述的构建TNFα表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼TNFα基因，分别连入载体pCZN1的BamHI(GGATCC)-HindIII(AAGCTT)位点之间、连入载体pET-32a(+)的无缝克隆位点和XhoI(CTCGAG)位点之间、连入载体pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)位点之间，构建重组质粒pCZN1-TNF-α、pET-32a(+)-TNF-α、pMAL-c5x-TNF-α。
所述的免疫学检测筛选方法是转印免疫印迹法；其中所述的转印免疫印迹法是用抗His的单克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼TNFα蛋白反应，确定抗原决定簇是分子量为62.83KD的草鱼TNF-α重组蛋白。
使用原核表达系统生产的哺乳动物重组TNF-α已经达到商品化，并广泛用于研究和临床治疗工作。但是由于种属间的TNF-α蛋白存在较大的差异，在鱼体中使用哺乳动物的重组TNF-α蛋白具有一定的局限性，因此我们发明制备了草鱼TNF-α优化重组表达并用于后续的研究。
本发明的制备技术路线设计新颖，其通过构建重组质粒转入表达菌株，使用IPTG诱导表达草鱼TNF-α，优化表达条件，通过上清纯化方式纯化目标蛋白TNF-α，Ni柱亲和纯化获得高纯度的草鱼TNF-α蛋白；所得的TNF-α重组蛋白再经转印免疫印迹法验证其特性。这样的制备技术路线严密合理且可行，充分发挥了现有免疫学检测筛选方法的作用和效果。
TNF-α在免疫功能和炎症反应等过程中扮演了重要的角色，是一种多效应的细胞因子。制备的TNF-α重组蛋白刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，可促进草鱼pIgR基因表达及细胞中pIgR蛋白表达及培养液上清中pIgR蛋白表达。pIgR是由黏膜上皮细胞合成，是重要的免疫因子，能够与分泌型的免疫球蛋白(Ig)多聚体结合，介导其跨过上皮细胞进行转运和分泌，进而保证分泌型免疫球蛋白在黏膜防御屏障中发挥局部清除病原体及毒素的作用，因此，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件。本发明的TNF-α重组蛋白可促进pIgR的基因和蛋白表达，增强草鱼免疫功能，使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供上述草鱼TNF-α重组蛋白在如下任意一种或多种中的应用：
1)促进鱼类pIgR基因和/或蛋白表达；
2)提高鱼类免疫能力；
3)制备鱼类免疫增强剂；
4)防治鱼类疾病。
其中，所述鱼类为淡水鱼，优选为鲤科鱼类，更进一步优选为草鱼。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：TNF-α重组蛋白的优化制备方法。
1.草鱼TNF-α表达引物的设计
根据草鱼TNF-α(Genbank：JQ040498.1)开放阅读框cDNA序列和表达载体的多克隆位点序列，加入pMAL-c5x的NdeI(CATATG)-HindIII(AAGCTT)、pET-32a(+)的无缝克隆XhoI(CTCGAG)、pCZN1的BamHI(GGATCC)-HindIII(AAGCTT)，设计了特异引物。
TNF-α-F1：CATATGAACAAGAGCCAGAGTAATCAGGAAAGC(SEQ ID NO.1)
TNF-α-R1：AAGCTTTTAGTGATGATGATGATGATGCAGGGCGA(SEQ ID NO.2)
TNF-α-F2：CACCATCATCATCATCATAACAAGAGCCAGAGTAATC(SEQ ID NO.3)
TNF-α-R2：CTCGAGTTACAGGGCGAACACGCCGAAGAAGGTT(SEQ ID NO.4)
TNF-α-F3：GGATCCAACAAGAGCCAGAGTAATCAGGAAAGCGCCAC(SEQ ID NO.5)
TNF-α-R3：AAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGCAGGGCGAACACG(SEQ ID NO.6)
2.TNF-α表达基因的扩增、纯化及双酶切
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收。然后以内切酶对产物进行双酶切，37℃酶切6h，取出后直接利用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收。
3.双酶切体系如下
4.原核蛋白的表达鉴定
蛋白大小理论分子量为19.87kd(不含标签)，氨基酸序列翻译如下：
NKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.7)
构建方案一：
构建至pMAL-c5x载体，C-his标签融合表达。蛋白分子量为62.83kd(含标签)。
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISHMNKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.8)
构建方式二：
构建至pET-32a载体，无缝连接构建到trx标签后。蛋白分子量为32.48kd(含标签)。
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAHHHHHHNKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.9)
构建方案三：
构建至pCZN1载体的BamHI和HindIII之间，采用低温诱导表达。蛋白分子量为22.22kd(含标签)。
MNHKVHHHHHHMELGTLEGSNKSQSNQESATGLKLTMRDHFSKANFTSKAAIHLTGAYDPEVSNKTLDWRVNQDQAFSSGGLKLVNREIIIPDDGIYFVYSQVSFHICCASDRGADQDIVHMSHAVMRISDSYGGKKALFSAIRSACVHASDSDDLSYNTIYLGAAFQLQAGDKLLTETTPLLLPRVENENGKTFFGVFAL(SEQ ID NO.10)
5.pMAL-c5x-TNF-α、pET-32a(+)-TNF-α、pCZN1-TNF-α载体转化至大肠杆菌ArcticExpress
(1)将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min；
(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；
(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。
6.IPTG诱导pMAL-c5x-TNF-α、pET32a-TNF-α、pCZN1-TNF-α载体融合蛋白的表达
(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；
(2)次日按1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；
(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；
(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀，重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。
7.Ni柱纯化
(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。
(2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。
(3)用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，30mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。
(4)用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH 8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。
(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜。
(6)进行12％SDS-PAGE分析。
8.结果分析
如图1所示，TNF-α构建到pET32a呈包涵体形式表达、pCZN1表达不明显，构建到pMAL-c5x以上清形式表达，对pMAL-c5x破碎后的上清进行Ni亲和纯化，获得纯度很高的目的表达蛋白，无其他明显杂带存在，目标蛋白分子量为62.83KD(图2所示)。
二、免疫学检测筛选
1.转印免疫印迹法检测
(1)取样品上样5μL。
(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束。
(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100V转膜，约为1.5h，恒流250mA。
(4)电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。
(5)将膜置于5％脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。
(6)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
(7)次日将膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min。
(8)用含5％牛奶的封闭液稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1h。
(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。
(10)ECL显影，曝光。
2.结果分析
抗His标签蛋白单抗能与分子量为62.83KD的TNF-α重组蛋白发生特异性结合。
实施例2：qPCR检测本发明TNFα重组蛋白刺激草鱼L8824细胞后pIgR基因的表达水平变化。
1.L8824细胞复苏
(1)开启紫外灯对细胞培养室和超净工作台进行灭菌处理，恒温水浴锅调至37℃。
(2)从-80℃冰箱中取出冻存的L8824细胞，立即置于水浴锅中，其间不断摇晃冻存管加速其解冻。
(3)于超净工作台将冻存管内的细胞悬液转移至一新的离心管中，离心5min。
(4)吸弃上清，加入新鲜培养基，用微量移液器反复吹打，使细胞分散均匀。
(5)将细胞悬液转入无菌的细胞培养瓶中，再加入适量新鲜培养基，于28℃精密恒温培养箱中培养，次日更换一次培养基后继续培养。
2.L8824细胞培养
使用含胎牛血清的培养基传代培养L8824细胞。
(1)细胞贴壁长满单层后，倾去培养基，用PBS清洗细胞2-3遍。
(2)加入1mL胰消化液作用5-10min。
(3)待消化完全后，吸弃消化液，加入3mL M199培养基将细胞从培养瓶内壁吹打下来，然后转入离心管中，用微量移液器小心反复吹打，使细胞充分散开成单个细胞。
(4)确定所需细胞密度，接种于无菌培养瓶中，再加入适量新鲜培养基，于28℃精密恒温培养箱中继续培养。
3.不同浓度TNFα重组蛋白对草鱼L8824细胞中pIgR基因的表达水平影响
待草鱼L8824稳定过夜后，每孔中使用不同浓度(1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)细胞因子TNF-α处理L8824细胞，同时用PBS组为空白对照组，刺激48h后，使用Trizol法提取细胞中总RNA，经RT-PCR合成cDNA第一链。放入-20℃保存，用于实时荧光定量PCR分析。
4.TNF-α刺激L8824细胞不同时长后pIgR基因表达水平变化
待草鱼L8824稳定过夜后，每孔中100ng/mL TNF-α处理L8824细胞，同时用未用任何刺激组为空白对照组，刺激0h、12h、24h、36h、48h后，使用Trizol法提取细胞中总RNA，经RT-PCR合成cDNA第一链。放入-20℃保存，用于实时荧光定量PCR分析。
5.qPCR检测
以β-actin基因作为内参，C-ActinF、C-ActinR为内参引物，CF、CR为特异性引物(表1)，每个样品做3个平行。根据测得的Ct值，利用2-ΔΔCt法计算免疫刺激后pIgR基因的相对表达量，采用SPSS 16.0统计软件中的单因素方差(one-way ANOVA)分析基因表达量的差异，显著性水平为0.05。
表1 qPCR实验所用引物
6.结果分析
使用不同浓度细胞因子TNF-α处理L8824细胞48h，通过qPCR测定pIgR基因变化，结果显示，与对照组相比，1ng/mL、10ng/mL TNF-α处理后，L8824细胞中pIgR基因相对表达量虽高于对照组，但差异不显著(P>0.05)，而100ng/mL TNF-α作用后pIgR相对表达量显著高于对照组，为对照组的3.16倍(P<0.05)，说明TNF-α促进作用呈现剂量依赖性。随着加入TNF-α浓度升高，其对草鱼L8824细胞pIgR基因表达水平的上调作用越明显，故选择100ng/mL这个浓后续的实验。
利用100ng/mL TNF-α孵育L8824细胞，不同时间点通过qPCR测定pIgR基因表达变化，结果显示pIgR基因表达量呈现先上升后下降趋势，12h和24h虽有升高，但差异不显著(P>0.05)，36h和48h基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，36h达到峰值，是对照组的3.46倍，48h已成下降趋势。
实施例3:ELISA检测本发明TNF-α刺激L8824细胞后pIgR蛋白水平变化。
1.L8824细胞处理
同实施例2。
2.ELISA检测
(1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记。
(2)用PBS包被液将L8824细胞或细胞培养液上清稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
(4)抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。
(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1h。
(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
(7)每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。
3.结果分析
不同浓度TNF-α处理细胞48h，通过ELISA检测细胞pIgR蛋白量及分泌至培养液上清中pIgR蛋白量的动态变化。结果显示总细胞pIgR蛋白量呈上升趋势，L8824细胞中的pIgR蛋白表达量自1ng/mL TNF-α处理时已显著高于对照组(P<0.05)，随着TNF-α浓度升高，pIgR蛋白表达量也逐渐升高。分泌至培养液上清中pIgR蛋白量也随着TNF-α浓度的升高呈现上升趋势，1ng/mL TNF-α处理后，分泌量已显著高于对照组(P<0.05)，且分泌至培养液上清中pIgR蛋白量要高于总细胞pIgR蛋白量，说明pIgR蛋白表达量与TNF-α存在剂量依赖关系。
100ng/mL TNF-α孵育L8824细胞不同时长，结果显示，与对照组相比，总细胞pIgR蛋白量从24h起显著高于对照组(P<0.05)，随时间的延长，蛋白表达量显著升高，在96h仍然呈现上升趋势。收集培养液上清通过ELISA检测显示，L8824细胞自12h起，pIgR分泌量显著上调(P<0.05)，其表达量在96h仍继续上升，随时间的延长，蛋白表达量呈上升趋势，表明培养液中pIgR蛋白分泌量及总细胞pIgR蛋白量与TNF-α存在时间依赖关系，在120h出现下降趋势。
实施例4:本发明TNF-α和抑制剂PDTC刺激L8824细胞后pIgR应答变化。
1.L8824细胞培养
同实施例2。
2.L8824细胞处理
待草鱼L8824稳定过夜后，使用抑制剂PDTC与TNF-α同时处理L8824细胞，或者抑制剂PDTC、TNF-α分别单独处理细胞48h后，实时荧光定量PCR和ELISA分析pIgR基因水平变化和pIgR蛋白水平变化。
3.结果分析
(1)抑制剂PDTC与TNF-α对pIgR基因表达的调节作用
只用抑制剂PDTC处理组与对照组相比，pIgR基因的相对表达量显著减少(P<0.05)；与TNF-α单独处理组相比，抑制剂PDTC处理组pIgR基因的表达量显著降低(P<0.05)；抑制剂PDTC单独处理组与抑制剂PDTC和TNF-α同时处理组相比，单独处理组的pIgR基因表达量显著低于共同处理组；抑制剂PDTC和TNF-α同时处理组与TNF-α单独处理组相比，共同处理组的pIgR基因表达量显著降低(P<0.05)；抑制剂PDTC和TNF-α同时处理组与对照组相比较，pIgR基因表达量略微升高，但差异不显著；TNF-α处理组与对照组相比，其pIgR基因表达量显著升高(P<0.05)。
(2)抑制剂PDTC与TNF-α对pIgR蛋白表达的调节作用
抑制剂PDTC处理组与对照组相比，总细胞pIgR蛋白表达量较对照组显著下降(P<0.05)，培养液上清中pIgR蛋白分泌量较对照组也显著下降(P<0.05)；与TNF-α单独处理组相比，抑制剂PDTC处理组pIgR蛋白表达量显著降低(P<0.05)，培养液上清中pIgR蛋白分泌量较其TNF-α单独处理组也显著下降(P<0.05)；抑制剂PDTC处理组与PDTC+TNF-α处理组相比，抑制剂PDTC单独处理组的总细胞pIgR蛋白表达量显著下降(P<0.05)，培养液上清中pIgR蛋白表达量较共同处理组也显著下降(P<0.05)；PDTC+TNF-α处理组与TNF-α单独处理组相比，总细胞pIgR蛋白表达量和培养液上清中pIgR蛋白分泌量显著低于各自的TNF-α单独处理组(P<0.05)；PDTC+TNF-α处理组得总细胞pIgR蛋白表达量和培养液上清中pIgR蛋白分泌量与各自对照组比较差异不显著；TNF-α单独处理组的总细胞pIgR蛋白表达量和培养液上清中pIgR蛋白分泌量显著高于对照组(P<0.05)。另外，分泌至培养液上清中pIgR蛋白量要高于总细胞pIgR蛋白表达量。
哺乳动物中，TNF-α介导不同的物反应是通过激活多种信号通路实现的，特别是NF-κB这条保守的信号通路。利用NF-κB抑制剂PDTC抑制NF-κB信号通路激活进而研究TNF-α是否对NF-κB具有调控作用。有研究证明PDTC能有效地抑制NF-κB的激活，其作用机制是细胞受到刺激后，PDTC通过可逆地阻止停留于细胞质中与NF-κB结合的IκB释放。我们的研究结果显示PDTC能部分抑制pIgR的表达，说明在草鱼肝脏细胞中，TNF-α重组蛋白上调pIgR表达可能是通过其对NF-κB信号通路的激活所导致的。
本发明制备的TNF-α重组蛋白刺激草鱼肝脏细胞L8824细胞，结果证实在草鱼肝脏细胞中，TNF-α重组蛋白上调pIgR表达可能是通过其对NF-κB信号通路的激活所导致的；并且结果证实本发明制备的TNF-α重组蛋白可促进草鱼pIgR基因表达及细胞中pIgR蛋白表达及培养液上清中pIgR蛋白表达，pIgR的有效分泌是保证分泌型免疫球蛋白发挥黏膜防御功能的必要条件。因此本发明重组蛋白可作为草鱼免疫增强剂，并且使用后不产生有害残留等优点，最符合当今业界所倡导的自然生态、绿色环保的行业标准，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治也具有重要的参考价值。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省淡水渔业研究院(山东省淡水渔业监测中心)
<120> 一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
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50 55 60
Val Asn Arg Glu Ile Ile Ile Pro Asp Asp Gly Ile Tyr Phe Val Tyr
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Ser Gln Val Ser Phe His Ile Cys Cys Ala Ser Asp Arg Gly Ala Asp
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Gln Asp Ile Val His Met Ser His Ala Val Met Arg Ile Ser Asp Ser
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Tyr Gly Gly Lys Lys Ala Leu Phe Ser Ala Ile Arg Ser Ala Cys Val
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His Ala Ser Asp Ser Asp Asp Leu Ser Tyr Asn Thr Ile Tyr Leu Gly
130 135 140
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145 150 155 160
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Gly Val Phe Ala Leu
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<212> PRT
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1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
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Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
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Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
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210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
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245 250 255
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Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
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Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
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Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
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450 455 460
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485 490 495
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<212> PRT
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