一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用
阅读说明：本技术 一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用 (Artificial dual-bacterium system for producing mcl-PHA and application thereof ) 是由 贾晓强 刘亚茹 杨松源 于 2021-02-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用,人工双菌体系由重组菌E.coliΔp-m-a-e与重组菌P.putida-acs组成。采用E.coliΔp-m-a-e利用木糖为底物分泌乙酸和胞外脂肪酸；采用P.putida-acs利用葡萄糖为主要生长碳源,利用乙酸和FFA合成中长链聚羟基脂肪酸酯。将底物利用与PHA合成等任务分配到不同菌株中执行,双菌形成了基于“营养供给”和“解毒”的互利共生关系,提高了体系代谢功能,双菌共培养得到mcl-PHA产量为0.541g/L,产量是单菌纯培养的3.9倍,双菌体系能够实现对复杂底物的利用,进而降低底物成本。(The invention relates to an artificial double-bacterium system for producing mcl-PHA and application thereof, wherein the artificial double-bacterium system consists of a recombinant bacterium E.coli delta p-m-a-e and a recombinant bacterium P.putida-acs. E.coli delta p-m-a-e is adopted to secrete acetic acid and extracellular fatty acid by taking xylose as a substrate; adopts P.putida-acs to utilize glucose as a main growth carbon source and utilizes acetic acid and FFA to synthesize medium-long-chain polyhydroxyalkanoate. Tasks such as substrate utilization, PHA synthesis and the like are distributed to different strains to be executed, the double bacteria form a mutual benefit symbiotic relationship based on 'nutrition supply' and 'detoxification', the metabolic function of a system is improved, the mcl-PHA yield obtained by double bacteria co-culture is 0.541g/L and is 3.9 times of that obtained by single bacteria pure culture, and the double bacteria system can realize the utilization of complex substrates, so that the substrate cost is reduced.)
技术领域
本发明涉及一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用，属于微生物学混合菌群研究领域。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)是一种由微生物全合成的高分子聚酯，具有生物可降解性和生物相容性等多种高附加值特性。目前已商业化的PHA产品主要为短链聚羟基脂肪酸酯(short chain length polyhydroxyalkanoate，scl-PHA)，其高成本以及应用范围小限制了PHA的进一步发展与应用。mcl-PHA是一类单体碳原子数为6-14个的PHA，主要由荧光假单胞菌属(fluorescent Pseudomonads)在非生长平衡条件下合成。它们具有低结晶度、低玻璃化转变温度、低拉伸强度和高断裂伸长率，是一种弹性体聚合物。此外，相较于scl-PHA，mcl-PHA结构更复杂，更容易被改性后用于药物递送材料、皮肤掩膜和心脏瓣膜等新型生物医学材料[1]。因此，开发合成mcl-PHA的工艺同时降低其生产成本有望解决目前PHA存在的问题。
木质纤维素来源的可发酵糖如葡萄糖和木糖等是一种廉价的可再生资源，利用其合成mcl-PHA与利用长链脂肪酸为底物合成相比，能够有效降低生产成本，但无法实现高效生产。目前，木质纤维素已被应用于PHA的合成，主要方式是通过各种方法将木质纤维素转化为可发酵糖(葡萄糖和木糖)，进而再用糖成分进行生物发酵生产PHA。但大多数研究是合成PHB的研究，合成mcl-PHA则鲜有报道，Davis等人[2]利用几种不同的假单胞菌从不同方法处理的野生黑麦草水解物中合成mcl-PHA。尽管mcl-PHA的收率与糖混合物的收率相似，但最高收率为0.3g/L，难以满足工业生产的需求。根据以前的研究报道，主要原因在于葡萄糖和木糖是PHA结构不相关碳源，不同的碳源对于PHA的生物合成有很大的的影响。通常，碳源可分为“相关”碳源{与PHA单体相关的结构，例如胞外脂肪酸(extracellular free fattyacids,FFA)}和“不相关”碳源(与PHA单体无关的结构，例如木糖和葡萄糖)[3]。
人工混菌共培养策略已成为代谢工程和合成生物学的新手段，被广泛用来克服纯培养过程的缺点[4,5]。已有研究者将混菌体系应用于PHA的合成，Shalin等[6]通过构建由Bacillus firmus NII 0830和Lactobacillus delbrueckii NII 0925组成的共培养体系实现PHB产量的提高。等[7]利用蓝藻和假单胞菌组成的人工双菌体系将CO2转化为mcl-PHA，产量达到156mg/L。可见，混菌共培养策略已被广泛应用于PHA的合成。对于单菌纯培养与天然混合菌群培养，单菌代谢能力是限制mcl-PHA产量的主要原因，且无法高效利用复杂底物，而自然形成或人工驯化的微生物混合菌群，普遍存在运行周期长、转化效率低、稳定性及可控性差等问题。因此，运用合成生物学的方法和理论，构建人工双菌体系能够实现纯培养微生物无法完成的任务或提高多细胞体系的代谢功能。目前为止，利用人工混菌体系以葡萄糖木糖混合碳源以及木质纤维素水解液为底物合成mcl-PHA的研究未见报道。
[1]Rai R,Keshavarz T,Roether J A,et al.Medium chain lengthpolyhydroxyalkanoates,promising new biomedical materials for the future[J].Materials Science&Engineering R Reports,2011,72(3):29-47.
[2]Davis R,Kataria R,Cerrone F,et al.Conversion of grass biomass intofermentable sugars and its utilization for medium chain lengthpolyhydroxyalkanoate(mcl-PHA)production by Pseudomonas strains[J].BioresourceTechnology,2013,150(4):202-209.
[3]陈国强，魏岱旭.微生物聚羟基脂肪酸酯[M].北京：化学工业出版社，2014：4-12.
[4]Jones J A,Wang X.Use of bacterial co-cultures for the efficientproduction of chemicals.[J].Curr Opin Biotechnol,2017,53:33-38.
[5]Zhang H,Wang X.Modular co-culture engineering,a new approach formetabolic engineering[J].Metabolic Engineering,2016,37:114-121.
[6]Shalin T,Sindhu R,Pandey A,et al.Production of poly-3-hydroxybutyrate from mixed culture[J].BIOLOGIA,2016,71(7):736-742.
[7]H,Hobmeier K,Moos M,et al.Photoautotrophic production ofpolyhydroxyalkanoates in a synthetic mixed culture of Synechococcus elongatuscscB and Pseudomonas putida cscAB[J].Biotechnology for biofuels,2017,10(1):190.
发明内容
鉴于上述，本发明提出一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用，并验证其可行性，具体技术如下：
人工双菌体系由重组菌E.coliΔp-m-a-e与重组菌P.putida-acs组成。以葡萄糖和木糖混糖为碳源，重组菌E.coliΔp-m-a-e利用木糖为底物分泌乙酸和胞外脂肪酸(FFA)；P.putida-acs利用葡萄糖为主要生长碳源，利用乙酸和FFA合成mcl-PHA。
双菌利用中间代谢物乙酸形成了基于“营养供给-解毒”的互利共生关系，即P.putida-acs利用E.coliΔp-m-a-e分泌的乙酸作为碳源，同时解除乙酸对E.coliΔp-m-a-e的抑制。然后进行双菌初始接种比的确定，双菌相对接种时间的确定和发酵培养基氮源浓度的确定。最后将人工双菌体系应用到含葡萄糖和木糖的实际纤维素水解液中。
本发明具体说明如下：
一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系；人工双菌体系由重组菌E.coliΔp-m-a-e与重组菌P.putida-acs组成。
本发明用于生产mcl-PHA的人工双菌体系；人工双菌体系采用重组菌E.coliΔp-m-a-e利用木糖为底物分泌乙酸和胞外脂肪酸(FFA)；采用重组菌P.putida-acs利用葡萄糖为主要生长碳源，利用乙酸和FFA合成中长链聚羟基脂肪酸酯(mcl-PHA)。
本发明人工双菌体系生产mcl-PHA的方法；包括如下步骤：
(1)挑取重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs的单菌落分别接种至LB液体培养基中培养以活化菌体；分别吸取两种菌株的过夜培养物于M9液体培养基中，E.coliΔp-m-a-e培养以木糖为碳源，而P.putida-acs培养则以葡萄糖为碳源，分别获得E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs的种子液；
(2)将步骤(1)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e接种至发酵培养基进行发酵；接种12-24h后，将P.putida-acs接种至发酵培养基进行发酵用于生产mcl-PHA；重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs按照体积比0.5-2：1接种。
所述的步骤(2)的发酵培养基组分为(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NaCl0.5，MgSO4 0.24，NH4Cl，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0±0.1；碳源为葡萄糖和木糖混糖，其中总糖浓度为20g/L，葡萄糖和木糖质量比为1：1；氮源(氯化铵)浓度为1-4g/L。
所述的微量元素配方(g/L 1M HCl)：FeSO4·7H2O 2.78，MnCl2·4H2O 1.98，CoCl2·6H2O 2.38，CaCl2·2H2O 1.47，CuCl2·2H2O 0.17，ZnSO4·7H2O 0.29。
所述的步骤(2)发酵条件为：发酵温度30℃，经过滤除菌的空气以2vvm速率供给，通过自动控制转速将溶氧(DO)控制在25％以上；利用自动添加0.5M H2SO4和1M KOH控制pH在7.0±0.1。
利用本发明的人工双菌体系应用于纤维素水解液为含葡萄糖和木糖的混合溶液生产mcl-PHA。
利用本发明的人工双菌体系应用玉米秸秆酶解为纤维素水解液生产mcl-PHA方法，以经氨水预处理的玉米秸秆为底物进行酶解反应，将粉末置于含有柠檬酸缓冲溶液进行反应，纤维素酶和半纤维素酶按2：1比例加入；利用高效液相色谱对水解液中糖成分进行分析，水解液中糖成分主要为葡萄糖和木糖，二者比例为4.3：1。
所述的1M柠檬酸钠缓冲液：750mL水中加入210g水合柠檬酸，加入NaOH 50-60g至pH＝4.3，定容至1L；此缓冲液稀释至0.05M时pH＝4.8。
本发明所述步骤(1)和(2)中相应菌种的接种量均可以采用现有技术的通用技术，通常为1～5％。
本发明涉及的重组菌E.coliΔp-m-a-e是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为201810900753.6，发明名称为“一种提高大肠杆菌分泌乙酸和FFA能力并使其偏好利用木糖的方法”公开偏好利用木糖高效分泌乙酸和FFA的基因工程菌的构建方法构建的。
本发明涉及的重组菌P.putida-acs是按照天津大学于2018-8-9申请的中国专利申请号为201810900753.6，发明名称为“一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法”公开的提高乙酸同化能力的基因工程菌的构建方法构建的。
本发明涉及的培养基配方与溶液配方如下：
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，NaCl 10.0，酵母浸粉5.0，pH 7.0-7.2。
M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NH4Cl 2，NaCl 0.5，MgSO40.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。碳源为葡萄糖和木糖按需求量换算后加入。
葡萄糖和木糖母液：精确称取100g葡萄糖和木糖分别溶解于装有200mL蒸馏水的蓝盖瓶中(糖终浓度为500g/L)，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后置于4℃保存。
利用本发明的人工双菌体系在实际纤维素水解液中生产mcl-PHA的应用方法，其特征是本发明以经氨水预处理的玉米秸秆酶解水解液为具体纤维素水解液用于生产mcl-PHA，包括如下步骤：
(1)以经氨水预处理的玉米秸秆(含水量：7.57％；葡聚糖含量：65.34；木聚糖含量：17.26％；不溶性木质素：4.75％)为底物进行酶解反应，将粉末置于含有柠檬酸缓冲溶液(50mM，pH＝4.8)的500mL锥形瓶中，按10％(w/v)浓度比进行反应，纤维素酶和半纤维素酶按2：1比例加入，反应温度为50℃，转速为200rpm，酶解72h。酶解结束后将反应液置于沸水浴中10min进行灭酶，再进行抽滤获得水解液。利用高效液相色谱对水解液中糖成分进行分析，水解液中糖成分主要为葡萄糖和木糖，二者比例为4.3：1。
(2)将步骤(1)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs种子液按照0.5-2：1的比例先后接种至发酵培养基进行发酵；
(3)步骤(2)中P.putida-acs在E.coliΔp-m-a-e接种后12-24h接种至发酵培养基进行发酵用于生产mcl-PHA。
所述步骤(2)和(3)中发酵培养基具体组分为(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO43，NaCl 0.5，MgSO4 0.24，NH4Cl，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。碳源为步骤(1)酶解获取的纤维素水解液，其中总糖浓度为20g/L，氮源(氯化铵)浓度为4g/L；同时利用试剂糖以相同比例进行配比并进行对照实验。
所述步骤(2)和(3)采用发酵罐进行发酵，控制发酵温度30℃，经过滤除菌的空气以2vvm速率供给，通过自动控制转速将溶氧(DO)控制在25％以上；利用自动添加0.5M H2SO4和1M KOH控制pH在7.0±0.1。
所述步骤(1)和(2)中相应菌种的接种量均为现有技术的通用技术。
发酵48h后测定发酵液中mcl-PHA的含量为0.434g/L，说明所构建的人工双菌体系具有利用木质纤维素资源的能力。
本发明的优点：
本发明提出了一种用于生产mcl-PHA的人工双菌体系及其应用，利用工程P.putida-acs和E.coliΔp-m-a-e构建人工双菌体系，将底物利用与PHA合成等任务分配到不同菌株中执行，对不同菌株进行有目标的设计、改造乃至重新构建，双菌形成了基于“营养供给”和“解毒”的互利共生关系，提高了体系代谢功能，同时避免了单菌代谢负荷过重，能够利用葡萄糖和木糖混合碳源合成mcl-PHA，如图2所示，双菌共培养得到mcl-PHA产量为0.541g/L，产量是单菌纯培养的3.9倍，此外，双菌体系能够实现对复杂底物的利用，进而降低底物成本，所述人工双菌体系利用经氨水预处理的玉米秸秆的水解液可有效合成mcl-PHA，表明该双菌体系具有应用木质纤维素资源的潜力。同时，与其他利用可再生资源合成PHA的研究相比具有竞争优势。
附图说明
图1双菌关系示意图
图2 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs在纯培养和共培养时mcl-PHA产量对比
在总糖浓度为20g/L，葡萄糖和木糖各10g/L下，双菌共培养在最优培养条件下得到mcl-PHA产量为0.541g/L，与单菌纯培养相比产量明显提高。
图3 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs在纯培养和共培养时最大生物量
图4 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs在纯培养和共培养时乙酸和FFA浓度变化
与纯培养相比，双菌体系中乙酸和FFA几乎未积累，均被P.putida-acs用作碳源合成mcl-PHA，乙酸的利用解除了乙酸对E.coliΔp-m-a-e生长的抑制。
图5 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs在纯培养和共培养时葡萄糖浓度变化
在E.coliΔp-m-a-e纯培养情况下，唯一碳源葡萄糖在24h即被消耗光，在P.putida-acs纯培养情况下，唯一碳源葡萄糖在36h即被消耗光，而在共培养情况下，由于P.putida-acs还可利用E.coliΔp-m-a-e分泌的乙酸和FFA生长及合成mcl-PHA，因此，葡萄糖在60h时仍然能检测到。
图6E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs在纯培养和共培养时木糖浓度变化
在纯培养情况下，P.putida-acs完全不能利用木糖，在共培养情况下，双菌体系中木糖消耗更快，双菌体系的构建促进了E.coliΔp-m-a-e对木糖的利用。
具体实施方式
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业购买获得。双菌关系的设计如图1所示，双菌体系由重组菌E.coliΔp-m-a-e与重组菌P.putida-acs组成。双菌体系以葡萄糖、木糖混糖作为碳源，重组菌E.coliΔp-m-a-e偏好利用木糖可分泌胞外长链自由脂肪酸(FFA)和乙酸，重组菌P.putida-acs利用葡萄糖作为生长碳源，同时利用乙酸和FFA合成mcl-PHA。双菌体系利用中间代谢物乙酸构建双菌解毒共生关系，即重组菌P.putida-acs利用重组菌E.coliΔp-m-a-e分泌的乙酸作为碳源，同时解除乙酸对重组菌E.coliΔp-m-a-e的抑制。
下面结合附图和具体实施例，对本发明做进一步详细说明:
1.培养基配方与溶液配方
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，NaCl 10.0，酵母浸粉5.0，pH 7.0-7.2。
M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NH4Cl 2，NaCl 0.5，MgSO4，0.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。碳源为葡萄糖和木糖按需求量换算后加入。
微量元素配方(g/L 1M HCl)：FeSO4·7H2O 2.78，MnCl2·4H2O 1.98，CoCl2·6H2O2.38，CaCl2·2H2O 1.47，CuCl2·2H2O 0.17，ZnSO4·7H2O 0.29。
葡萄糖和木糖母液：精确称取100g葡萄糖和木糖分别溶解于装有200mL蒸馏水的蓝盖瓶中(糖终浓度为500g/L)，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后置于4℃保存。
1M柠檬酸钠缓冲液：750mL水中加入210g水合柠檬酸，加入NaOH 50-60g至pH＝4.3，定容至1L。此缓冲液稀释至0.05M时pH＝4.8。
实施例1 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs人工双菌体系“营养供给-解毒”的互利共生关系
(1)挑取重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs的单菌落分别接种至5ml LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床，220rpm条件下过夜培养以活化菌体。分别吸取两种菌株的过夜培养物1mL于100mL M9液体培养基中，E.coliΔp-m-a-e培养以木糖为碳源而P.putida-acs培养则以葡萄糖为碳源。
(2)将步骤(1)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs种子液按照0.5：1的比例先后接种入发酵培养基，P.putida-acs在E.coliΔp-m-a-e接种后12h接种。
发酵培养基为M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NaCl 0.5，MgSO4 0.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。其中总糖浓度为20g/L，葡萄糖为和木糖比例为1：1。氮源(氯化铵)浓度为1g/L。
步骤(2)采用5L发酵罐进行发酵，载液量2L，控制发酵温度30℃，经过滤除菌的空气以2vvm速率供给，通过自动控制转速将溶氧(DO)控制在25％以上，利用自动添加0.5MH2SO4和1M KOH控制pH在7.0±0.1。发酵罐培养实验进行2次平行实验，mcl-PHA产量为0.522g/L，说明所构建人工双菌体系能够有效利用实验室葡萄糖木糖混糖作为碳源生产mcl-PHA。
对培养过程中糖浓度变化和生物量进行分析，如图3所示，发酵48h后，E.coliΔp-m-a-e OD600达6.27，P.putida-acs OD600达8.56，通过比较最大OD600可知，在双菌体系中，P.putida-acs和E.coliΔp-m-a-e的生物量均高于各自单独培养时的生物量。E.coliΔp-m-a-e生物量的增高可能主要是由于P.putida-acs通过代谢消耗乙酸解除了乙酸对其生长的抑制，如图4所示，与纯培养相比，双菌体系中乙酸几乎未积累，而从图6中可知，双菌体系中木糖消耗更快，且没有残留的情况也可推断E.coliΔp-m-a-e生长的更好。而P.putida-acs生物量的升高则是由于共培养体系中可利用碳源的增加，如图5所示，纯培养情况下，唯一碳源葡萄糖在24h即被消耗光，使得生物量难以继续提高，而在共培养体系中，P.putida-acs还可利用E.coliΔp-m-a-e分泌的乙酸和FFA生长以及合成mcl-PHA。这些结果证明了双菌利用中间代谢物乙酸形成了基于“营养供给-解毒”的互利共生关系。
实施例2 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs人工双菌体系利用实验室混糖产mcl-PHA
(1)挑取重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs的单菌落分别接种至5ml LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床，220rpm条件下过夜培养以活化菌体。分别吸取两种菌株的过夜培养物1mL于100mL M9液体培养基中，E.coliΔp-m-a-e培养以木糖为碳源而P.putida-acs培养则以葡萄糖为碳源。
(2)将步骤(1)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs种子液按照2：1的比例先后接种入发酵培养基，P.putida-acs在E.coliΔp-m-a-e接种后15h接种。
步骤(2)中发酵培养基为M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NaCl 0.5，MgSO4 0.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。其中总糖浓度为20g/L，葡萄糖为和木糖比例为1：1。氮源(氯化铵)浓度为3g/L。
步骤(2)中发酵罐参数控制与实施例1中相同。发酵48h后，mcl-PHA产量为0.492g/L，与其他混合菌群生产mcl-PHA相比，产量得到显著提升。
实施例3.E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs人工双菌体系利用实验室混糖产mcl-PHA
(1)挑取重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs的单菌落分别接种至5ml LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床，220rpm条件下过夜培养以活化菌体。分别吸取两种菌株的过夜培养物1mL于100mL M9液体培养基中，E.coliΔp-m-a-e培养以木糖为碳源而P.putida-acs培养则以葡萄糖为碳源。
(2)将步骤(1)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs种子液按照1：1的比例先后接种入发酵培养基，P.putida-acs在E.coliΔp-m-a-e接种后12h接种。
步骤(2)中发酵培养基为M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NaCl 0.5，MgSO4 0.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0。其中总糖浓度为20g/L，葡萄糖为和木糖比例为1：1。氮源(氯化铵)浓度为2g/L。
步骤(2)中发酵罐参数控制与实施例1中相同。如图2所示，发酵48h后，双菌共培养mcl-PHA产量为0.541g/L，与单菌纯培养相比产量明显提高。
实施例4 E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs人工双菌体系利用纤维素水解液混合发酵产mcl-PHA
(1)以经氨水预处理的玉米秸秆(含水量：7.57％；葡聚糖含量：65.34；木聚糖含量：17.26％；不溶性木质素：4.75％)为底物进行酶解反应，将粉末置于含有柠檬酸缓冲溶液(50mM，pH＝4.8)的500mL锥形瓶中，按10％(w/v)浓度比进行反应，纤维素酶和半纤维素酶按2：1比例加入，反应温度为50℃，转速为200rpm，酶解72h。酶解结束后将反应液置于沸水浴中10min进行灭酶，再进行抽滤获得水解液。利用高效液相色谱对水解液中糖成分进行分析，水解液中糖成分主要为葡萄糖和木糖，二者比例为4.3：1。
(2)挑取重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs的单菌落分别接种至5ml LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床，220rpm条件下过夜培养以活化菌体。分别吸取两种菌株的过夜培养物1mL于100mL M9液体培养基中，E.coliΔp-m-a-e培养以木糖为碳源而P.putida-acs培养则以葡萄糖为碳源。
(3)将步骤(2)获得的重组菌株E.coliΔp-m-a-e和重组菌株P.putida-acs种子液按照1：1的比例先后接种入发酵培养基，P.putida-acs在E.coliΔp-m-a-e接种后24h接种。
步骤(3)中发酵培养基为M9无机盐培养基(g/L)：Na2HPO4·7H2O 12.8，KH2PO4 3，NaCl 0.5，MgSO4 0.24，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0，氮源(氯化铵)浓度为4g/L，以酶解获取的纤维素水解液为碳源进行发酵，总糖浓度为20g/L，同时利用试剂糖以相同比例进行配比并进行对照实验。
发酵罐参数控制与实施例1中相同。发酵48h后，以水解液为碳源发酵生产mcl-PHA的产量为0.434g/L，说明所构建的人工双菌体系具有利用木质纤维素资源的能力。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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