具体实施方式

本发明旨在提供一种发酵周期短，烷烃添加量大，产酸高，转化率高的生物发酵生产长链二元酸的方法。

为了高产率的获得长链二元酸，微生物培养工艺中得到大的菌体量、强的菌体活力非常重要，本发明通过采用两级种子罐对微生物进行培养，并且控制一级种子罐培养后菌体生长密度(OD620)大于0.5，相对于现有技术，在菌体量和菌体活力方面取得了明显的改善。

本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，一级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m³；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。

在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)大于0.5，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。

二级种子罐经历如下过程：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时接种、培养。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。

在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、pH反弹，二级培养结束。

二级种子罐培养结束后将菌液接入到发酵罐中进行发酵。发酵过程中菌液的pH是菌体在一定环境条件下代谢活动的综合指标，对菌体生长和产品积累有很大的影响。现有发酵工艺中，在发酵过程中需要根据情况不断地调节pH，pH经历酸性-中性-碱性的变化，本发明人经过大量试验发现，为达到高生长速率和最佳产物形成，使pH在很窄的范围内保持恒定更有利于获得高产率的长链二元酸。本发明控制发酵期间pH恒定在6.8-7.1范围内，优选pH为6.9。

本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，在发酵过程中可以采用流加方式补加葡萄糖或蔗糖等二次碳源，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.8-7.1，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。

通过对发酵工艺的改进，烷烃添加量可以由目前的28t左右提升至36-37t，产酸率与转化率也均大幅提高。

为了更好地说明本发明，下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：

(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m³；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时采用热带假丝酵母接种、培养。

在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)为0.540，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。

(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。

在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、PH反弹，二级培养结束。

(3)发酵罐发酵：底料水和碳源连消，消后50±5t，氮源实消，消后压入发酵罐。

补料控制参数：需要添加二次碳源，二次碳源采用流加方式，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至7.1，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。

发酵周期158小时，产酸20.8％，烷烃添加量36.1t，烷烃对二元酸的重量转化率81.18％。

实施例2

本实施例的生物发酵生产长链二元酸的方法包括下述步骤：

(1)一级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟，实消后体积1.4-1.6m³；实消结束，迅速降温，待温度降至30℃±0.5℃时采用热带假丝酵母接种、培养。

在一级培养工序中，前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；当菌体生长密度(OD620)为0.817，菌液溶氧、pH反弹，一级培养结束。

(2)二级种子罐培养：碱水煮罐：pH≈12，120℃，4h；空消：130℃，1h；实消前定容17.5t，实消：消前适当调节pH，使种前pH在6.7～7.0范围内。温度121-123℃，保温30分钟；实消结束，迅速降温。其中，碳源为葡萄糖时则单消定容1.5t，二级种子罐定容16t，温度113-115℃，保温30分钟，接种前压入二级种子罐。

在二级培养工序如下控制：前期正常培养，当溶氧接近40％时，提高风量，确保溶氧保持在40％-50％，风量逐步提高；菌液溶氧、PH反弹，二级培养结束。

(3)发酵罐发酵：底料水和碳源连消，消后50±5t，氮源实消，消后压入发酵罐。

补料控制参数：需要添加二次碳源，二次碳源采用流加方式，二次碳源补加结束前，pH降至4.5后控制在4.5；补加二次碳源在补加烷烃原料前结束；补加二次碳源结束后，调节pH至6.9，补加烷烃原料：前三次间隔6h，每次补加烷烃原料3.5t，之后根据残烃，低于4％补加烷烃原料3t，补加至发酵过程控制溶氧在40％-50％。

发酵周期156小时，产酸24.2％，烷烃添加量36.6t，烷烃对二元酸的重量转化率91.96％。

对比例1

对比例1的生物发酵生产长链二元酸的方法中，仅采用一级种子罐对热带假丝酵母接种、培养，当菌体生长密度(OD620)为0.498，菌液溶氧、pH反弹，培养结束，进行发酵罐发酵；除此以外，与实施例1同样地制备长链二元酸。

发酵周期192小时，产酸17.2％，烷烃添加量27.2t，烷烃对二元酸的重量转化率68.39％。

对比例2

对比例2的生物发酵生产长链二元酸的方法中，发酵过程中，补加二次碳源结束后，调节pH至7.5；除此以外，与实施例2同样地制备长链二元酸。

发酵周期185小时，产酸18.5％，烷烃添加量27.6t，烷烃对二元酸的重量转化率73.64％。

下表示出实施例和对比例的各参数：

通过前述实施例1和2的二元酸制备方法，可以将发酵周期由现有的180-190小时缩短至150-160小时，极大地减少能耗，降低生产成本；产酸率由现有的10％左右提高到20％以上，烷烃对二元酸的重量转化率由现有的60-70％提高到80％以上，特别是实施例2的制备方法转化率高达91％，极大地增加了经济效益。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。