一种具有抗癌作用的生物发酵组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种具有抗癌作用的生物发酵组合物及其制备方法和应用 (Biological fermentation composition with anticancer effect and preparation method and application thereof ) 是由 李宝恒 李倩 舒威 于 2021-03-22 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种具有抗癌作用的生物发酵组合物及其制备方法和应用,属于生物工程技术领域。该具有抗癌作用的生物发酵组合物由以下的原料按重量份制备而成：富硒纳豆发酵提取物50-100份、人参皂苷Rg2 2-5份、人参皂苷Rg3 1-3份、三七皂苷R1 2-5份、虫草多糖4-10份。本发明制备方法简单、原料来源广,制得的组合物具有很好的抗肿瘤作用,特别对甲状腺癌具有很好的抑制和治疗作用,且安全无副作用,可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用,具有广阔的应用前景。(The invention provides a biological fermentation composition with an anticancer effect, a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of biological engineering. The biological fermentation composition with the anticancer effect is prepared from the following raw materials in parts by weight: 50-100 parts of selenium-enriched natto fermentation extract, 5-5 parts of ginsenoside Rg 22, 3-3 parts of ginsenoside Rg 31, 26-5 parts of notoginsenoside R12 and 4-10 parts of cordyceps polysaccharide. The preparation method is simple, the raw materials are wide in source, the prepared composition has a good anti-tumor effect, particularly has good inhibition and treatment effects on thyroid cancer, is safe and free of side effects, can be used as raw materials of food therapy products, health-care foods and medicines, and has a wide application prospect.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种具有抗癌作用的生物发酵组合物及其制备方法和应用。
背景技术
科技的进步给人们的生活带来了方便与快捷，并使人们的物质生活水平也得到了很大的改善，但也带来了一系列负面问题：生态环境的破坏及污染、水污染，农药化肥激素的伤害，各种添加剂在食品中的滥用、抗生素药物的滥用等。给人们生活的生态环境带了破坏，同时加上现代人们快节奏的生活、上网族低头族辐射伤害，流感病毒的侵害，工作压力的提高，使得大部分人的身体免疫力逐渐降低，长期处于亚健康状态，更令人担忧的是癌病糖尿病艾滋病及三高人群逐年上升，人类健康面临前所未有的挑战。
癌症泛指所有恶性肿瘤，肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物，新生物一旦形成，不因病因消除而停止生长，他的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官。目前市场上并没有预防和治疗癌症的药物，这就为人们的身体健康带来了危害。
纳豆由黄豆通过纳豆芽孢杆菌发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素K2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。
纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100％,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应，并能生成多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等。纳豆芽孢杆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的酵素纳豆激酶(Nattokinase，NK),具有神奇的药效,而且还能产生出氨基酸的美味。
发明内容
本发明的目的在于提出一种具有抗癌作用的生物发酵组合物及其制备方法和应用，制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的抗肿瘤作用，特别对甲状腺癌具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种富硒纳豆发酵提取物的制备方法，包括以下步骤：将红曲霉、菌种Bacillus natto 918、富硒酵母培养成种子液后，接种于液体培养基中进行培养后，得到复合发酵菌液，将经过脱毒的大豆熟化后置于复合发酵菌液中发酵，过滤干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.液体培养基的制备：将碳源、氮源、维生素和无机盐用无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为6.8-7.2，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将红曲霉、菌种Bacillus natto 918和富硒酵母分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，然后分别培养成菌种种子液，接种于步骤S1制得的液体培养基中，第二次有氧培养，将三个培养基等体积混合并稀释得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理2-4h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡20-24h 后，70-100℃蒸煮10-20min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将经过步骤S4处理后的大豆粉加入步骤 S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵24-48h，过滤，固体用无菌水洗涤，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
作为本发明的进一步改进，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的一种或几种混合；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯氨酸中的一种或几种混合；所述碳源、氮源、维生素、无机盐和无菌水的质量比为(5-15)： (3-7)：(0.1-0.2)：(0.5-1)：100。
作为本发明的进一步改进，所述红曲霉、菌种Bacillusnatto918和富硒酵母的质量比为(2-5)：(5-10)：(1-3)；所述第一次有氧培养条件为35-40℃，氧含量为20-30％，湿度为70-80％，培养时间为12-24h；所述第二次有氧培养条件为35-40℃，氧含量为20-30％，湿度为75-85％，培养时间为24-36h；所述菌种种子液的含菌量为107-108cfu/mL；所述红曲霉、菌种Bacillus natto 918和富硒酵母的接种量分别为1-3％、3-5％、0.5-1.5％；所述稀释倍数为100-200倍。
作为本发明的进一步改进，所述乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液中乙酸含量为10-20wt％，乙醇含量为25-40wt％，三乙胺含量为5-10wt％，余量为水；所述大豆粉和复合发酵菌液的固液比为1：(2-5)。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的富硒纳豆发酵提取物。
本发明进一步保护一种具有抗癌作用的生物发酵组合物，由以下的原料按重量份制备而成：上述富硒纳豆发酵提取物50-100份、人参皂苷Rg2 2-5份、人参皂苷Rg3 1-3份、三七皂苷R1 2-5份、虫草多糖4-10份。
本发明进一步保护一种上述的具有抗癌作用的生物发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：将富硒纳豆发酵提取物、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rg3、三七皂苷R1和虫草多糖，混合均匀后，得到具有抗癌作用的生物发酵组合物。
本发明进一步保护一种上述的具有抗癌作用的生物发酵组合物在制备抗癌食品、保健食品及药品中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述癌症为甲状腺癌。
本发明具有如下有益效果：本发明将红曲霉、纳豆芽孢杆菌中菌种Bacillusnatto 918以及富硒酵母进行混合培养后，得到的复合发酵菌液用于对脱毒熟化处理后的大豆进行发酵培养，其中，红曲霉在发酵过程中将产生聚酮类次级代谢产物红曲色素，包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等，以及Monacolin K等活性物质，具有很好的抗肿瘤的效果；同时，由于三种菌种的混合培养，还能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生，从而降低生物毒性；纳豆芽孢杆菌菌种Bacillus natto918在发酵过程中高产量产生抗癌物质大豆异黄酮，如染料木素、染料木苷和infrabin等，以及纳豆芽孢杆菌本身，可以抑制癌细胞的增殖、有效破坏或杀死癌细胞，并可以通过刺激免疫系统诱发产生干扰素起到抗癌的功效；还能提高机体巨噬细胞的活性，增强机体免疫力，并加强吞噬细胞的吞噬能力，而富硒酵母则能够在发酵过程中产生大量有机硒营养素，而硒元素可以通过吞噬细胞的功能能够影响癌细胞的能量代谢和干扰癌细胞的蛋白合成,从而抑制癌症,还能够影响化学致癌物的代谢,使它们失去致癌的活性，从而富硒纳豆发酵提取物能够起到很好的抗癌效果。
本发明添加了三七皂苷R1、虫草多糖，具有协同增效的作用，其中，三七皂苷R1通过对造血功能的调节而达到抗癌功效，虫草多糖具有抑制肿瘤细胞增殖，增强机体非特异性免疫功能及良好的免疫调节作用，与人参皂苷Rg2、人参皂苷 Rg3以及制备的富硒纳豆发酵提取物混合，人参皂苷Rg2能抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞异常分化、逆转肿瘤药物耐药性并通过提高免疫达到抗肿瘤目的，人参皂苷Rg3主要通过增强免疫功能，抑制癌细胞成长，抗肿瘤转移，起到很好的抗肿瘤效果，从而得到一种具有抗癌作用的生物发酵组合物，该组合物具有很好的抗癌效果，并针对甲状腺癌具有明显的治疗作用。
本发明制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的抗肿瘤作用，特别对甲状腺癌具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为测试例5中不同组肿瘤体积随时间变化图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
红曲霉为ACCC 30342红曲霉，由上海复祥生物科技有限公司提供；菌种 Bacillusnatto 918由朝鲜民主主义人民共和国国家科学院菌种保藏所提供；富硒酵母由安琪酵母股份有限公司提供。
人参皂苷Rg2，CAS号52286-74-5，人参皂苷Rg3，CAS号14197-60-5,由大连富生制药有限公司提供；三七皂苷R1，CAS号88122-52-5，由成都彼样生物科技有限公司提供；虫草多糖，CAS号73-03-0，由常德炎帝生物工程有限公司提供。
实施例1富硒纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1.液体培养基的制备：将5g果糖、1g氨水、1g苏氨酸、1g缬氨酸、0.1g 维生素E和0.2g氯化钙、0.1g硫酸镁、0.2g氯化铁用100mL无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为6.8，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将2g红曲霉、5g菌种Bacillus natto 918和1g富硒酵母分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为35℃，氧含量为20％，湿度为70％，培养时间为12h，然后分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为107cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，红曲霉、菌种Bacillus natto 918和富硒酵母的接种量分别为1％、3％、0.5％，第二次有氧培养，培养条件为35℃，氧含量为20％，湿度为75％，培养时间为24h，将三个培养基等体积混合并稀释100倍得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为10wt％，乙醇含量为25wt％，三乙胺含量为5wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 2-4h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡20h后， 70℃蒸煮1min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入 200g步骤S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵24h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
实施例2富硒纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1.液体培养基的制备：将15g葡萄糖、5g尿素、1g硝酸铵、1g谷氨酸、0.1g 维生素K、0.1g维生素B2和0.2gg氯化钾、0.2g氯化钙、0.2g硫酸镁、0.2g 氯化铁、0.2g硫酸锌用100mL无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基 pH值为7.2，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将5g红曲霉、10g菌种Bacillus natto 918和 3g富硒酵母分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为40℃，氧含量为30％，湿度为80％，培养时间为24h，然后分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，红曲霉、菌种Bacillus natto 918和富硒酵母的接种量分别为3％、5％、1.5％，第二次有氧培养，培养条件为40℃，氧含量为30％，湿度为85％，培养时间为36h，将三个培养基等体积混合并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为20wt％，乙醇含量为40wt％，三乙胺含量为10wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 4h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡24h后， 100℃蒸煮20min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入 500g步骤S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵48h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
实施例3富硒纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将3.5g红曲霉、7g菌种Bacillus natto 918 和2g富硒酵母分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为 37℃，氧含量为25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，红曲霉、菌种Bacillus natto 918和富硒酵母的接种量分别为2％、4％、1％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入 350g步骤S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
对比例1
与实施例3相比，未添加富硒酵母，其他条件均不改变。
具体步骤如下：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将5.5g红曲霉、7g菌种Bacillus natto 918 分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为 25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，红曲霉、菌种Bacillus natto 918的接种量分别为3％、4％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将二个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入350g 步骤S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例2
与实施例3相比，未添加红曲霉，其他条件均不改变。
具体步骤如下：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.复合发酵菌液的培养：将7g菌种Bacillus natto 918和5.5g富硒酵母分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为 25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，菌种Bacillus natto 918和富硒酵母的接种量分别为4％、3％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将二个培养基等体积混合并稀释150 倍得到复合发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入 350g步骤S2得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
对比例3
与实施例3相比，仅添加了红曲霉，其他条件均不改变。
具体步骤如下：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.发酵菌液的培养：将12.5g红曲霉接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，红曲霉的接种量为7％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将培养基稀释150倍得到发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入350g 步骤S2得到的发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例4
与实施例3相比，仅添加了菌种Bacillus natto 918，其他条件均不改变。
具体步骤如下：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.发酵菌液的培养：将12.5g菌种Bacillus natto 918接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，菌种Bacillus natto 918的接种量为7％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将培养基稀释150倍得到发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入350g 步骤S2得到的发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例5
与实施例3相比，仅添加了富硒酵母，其他条件均不改变。
具体步骤如下：
S1.液体培养基的制备：将10g麦芽糖、3g尿素、1g亮氨酸、1g丙氨酸、0.1g 维生素C、0.05g维生素B1和0.2g硫酸锌、0.3g硫酸铜、0.2g硫酸锰用100mL 无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S2.发酵菌液的培养：将12.5g富硒酵母接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为75％，培养时间为18h，然后培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL，接种于步骤S1制得的液体培养基中，富硒酵母的接种量为7％，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25％，湿度为80％，培养时间为30h，将培养基稀释150倍得到发酵菌液；
S3.大豆的脱毒：将经过抛光处理后的大豆洗净，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液(乙酸含量为15wt％，乙醇含量为32wt％，三乙胺含量为7wt％，余量为水)置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理 3h后，冷却至常温后，得到脱毒的大豆；
S4.脱毒大豆的处理：将经过步骤S3脱毒的大豆洗净，无菌水浸泡22h后， 85℃蒸煮15min，干燥，粉碎并研细，得到大豆粉，备用；
S5.富硒纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S4处理后的大豆粉加入 350g步骤S2得到的发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL 无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到富硒纳豆发酵提取物。
实施例4具有抗癌作用的生物发酵组合物
原料组成(重量份)：实施例1制得的富硒纳豆发酵提取物70份、人参皂苷 Rg2 3.5份、人参皂苷Rg3 2份、三七皂苷R1 3.5份、虫草多糖7份。
制备方法包括以下步骤：
将富硒纳豆发酵提取物、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rg3、三七皂苷R1和虫草多糖，混合均匀后，得到具有抗癌作用的生物发酵组合物。
实施例5
与实施例4相比，富硒纳豆发酵提取物由实施例2制得，其他条件均不改变。
实施例6
与实施例4相比，富硒纳豆发酵提取物由实施例3制得，其他条件均不改变。
对比例6
与实施例6相比，富硒纳豆发酵提取物由对比例1制得，其他条件均不改变。
对比例7
与实施例6相比，富硒纳豆发酵提取物由对比例2制得，其他条件均不改变。
对比例8
与实施例6相比，富硒纳豆发酵提取物由对比例3制得，其他条件均不改变。
对比例9
与实施例6相比，富硒纳豆发酵提取物由对比例4制得，其他条件均不改变。
对比例10
与实施例6相比，富硒纳豆发酵提取物由对比例5制得，其他条件均不改变。
对比例11
与实施例6相比，未添加富硒纳豆发酵提取物，其他条件均不改变。
原料组成(重量份)：人参皂苷Rg2 3.5份、人参皂苷Rg3 2份、三七皂苷 R1 3.5份、虫草多糖7份。
对比例12
与实施例6相比，未添加人参皂苷Rg2，其他条件均不改变。
原料组成(重量份)：实施例3制得的富硒纳豆发酵提取物70份、人参皂苷 Rg3 5.5份、三七皂苷R1 3.5份、虫草多糖7份。
对比例13
与实施例6相比，未添加人参皂苷Rg3，其他条件均不改变。
原料组成(重量份)：实施例3制得的富硒纳豆发酵提取物70份、人参皂苷Rg2 5.5份、三七皂苷R1 3.5份、虫草多糖7份。
对比例14
与实施例6相比，未添加三七皂苷R1，其他条件均不改变。
原料组成(重量份)：实施例3制得的富硒纳豆发酵提取物70份、人参皂苷 Rg2 3.5份、人参皂苷Rg3 2份、虫草多糖10.5份。
对比例15
与实施例6相比，未添加虫草多糖，其他条件均不改变。
原料组成(重量份)：实施例3制得的富硒纳豆发酵提取物70份、人参皂苷 Rg2 3.5份、人参皂苷Rg3 2份、三七皂苷R1 10.5份。
测试例1
将本发明实施例1-3和对比例1-5制得的富硒纳豆发酵提取物进行成分测定，结果见表1。
表1
由上表可知，本发明实施例制得的富硒纳豆发酵提取物含有丰富的营养元素。
测试例2提升免疫力测试：
选取650名志愿者，这些志愿者有一定程度的失眠、精神不振、身体疲劳等症状，将实施例1-3和对比例6-15制得的产品分别给50位上述志愿者服用，每天服用一次，每隔5天进行观察，观察1个月，观察结果如下表1(其中A表示轻微缓解、B表示缓解、C表示恢复正常，字母后的数字表示志愿者个数)：
表2：免疫力指标评价表
从上表中数据可以看出，实施例4-6制得的产品对失眠、精神不振和身体疲劳具有明显的改善作用，其中实施例6效果最优。实施例4-6的产品在第10天时志愿者症状均得到一定缓解，在第30天时，服用实施例4-6的产品的志愿者完全恢复比例超过超过94％；可以看出，本发明产品对上述症状具有明显的改善作用。服用上述产品的志愿者，改善了睡眠质量、身体疲劳完全缓解、精神好，免疫力得到了明显的提升。
测试例3辅助抗癌作用测试
取140个肿瘤切片，每10个肿瘤切片分为一组，其中第1组至第13组分别用实施例1-3和对比例6-15制得的组合物进行培养，第14组利用LB培养基进行培养，观察并计算肿瘤细胞的增殖率，结果如下表3。
表3：辅助抗癌作用评价表
组别
第1天
第2天
第5天
第10天
实施例4
75％
62％
42％
27％
实施例5
74％
60％
38％
24％
实施例6
72％
57％
35％
21％
对比例6
78％
72％
56％
42％
对比例7
77％
70％
54％
40％
对比例8
79％
75％
61％
51％
对比例9
79％
74％
63％
52％
对比例10
78％
73％
60％
48％
对比例11
80％
78％
75％
72％
对比例12
76％
65％
46％
33％
对比例13
75％
64％
47％
32％
对比例14
75％
63％
44％
29％
对比例15
76％
63％
45％
30％
LB培养基
80％
80％
80％
80％
从上表中数据可以看出，本发明的产品对癌细胞的增殖具有一定的抑制作用，其中实施例6效果最优。
测试例4人甲状腺癌细胞的抑制作用
1、细胞株和培养方法
人甲状腺乳头状癌细胞(K1)、人甲状腺髓样癌细胞(TT)、人甲状腺鳞癌细胞(SW579)购于上海赛百慷生物科技公司，人甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)购于广州北纳创联生物科技公司。K1细胞培养于含10％澳洲胎牛血清RPMI-1640培养液中；TT细胞培养于含10％澳洲胎牛血清F-12K培养液中；FTC-133细胞培养于含10％澳洲胎牛血清DMEM培养液中，以上3种细胞在相对湿度为 95％，37℃含5％CO2的环境中单层生长。SW579细胞培养于含10％澳洲胎牛血清L-15培养液中，培养条件为相对湿度95％，37℃含100％空气。实验均取对数生长期细胞。
2、细胞增殖测定
采用MTT法，取对数生长期细胞，胰酶消化，计数，调整细胞密度至1×105 /mL，每孔100μL铺于96孔板中；待细胞贴壁后每孔加入以完全培养液配制的100μL不同浓度的实施例4-6和对比例6-15制得的产品用无菌水培植的溶液 (0.001、0.01、0.1、1、10、100、500、1000μg/mL)，对照组仅加入100μL的完全培养液，每浓度组设6个平行孔。根据预实验结果，选择24h作为药物作用时间。细胞继续培养24h后实验组和对照组每孔均加入10μL PBS溶解的浓度5mg/mL的MTT，在37℃，5％CO2的环境中继续培养(SW579在100％空气环境中培养)，4h后弃上清，每孔加入100μL DMSO溶解结晶颗粒，摇床震荡10min后，于酶标仪490nm波长处测吸光值，再计算细胞抑制率，并计算IC50。
3、结果
见表4。
表4对不同肿瘤细胞株增殖抑制IC50
测试例5对甲状腺癌荷瘤小鼠的影响
1、主要材料与试剂
甲状腺癌TT细胞株购于上海赛百慷生物科技公司；SPF级BALB/c小鼠140 只，雌雄各半购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号： cxk(京)2019-0015；胎牛血清购于Hyelone；DMEM培养基购于北京鼎国；RIPA裂解液购于北京鼎国；荧光定量PCR仪购于ABI公司(970型)。
2、动物分组与处理
SPF级BALB/c小鼠140只，随机分成14组，每组10只，实验分组为：荷瘤对照组，实施例4-6组和对比例6-15组,小鼠均于背部注射甲状腺癌TT细胞悬液0.1mL(约2×106个),4w后成瘤开始用药。荷瘤对照组予生理盐水灌胃,0.5mL/只，一日2次；实施例4-6组和对比例6-15组将实施例4-6和对比例 6-15制得的组合物配置成1g/mL,分别给予该组小鼠灌胃，0.5mL/只，一日2次；小鼠成瘤后，1周2次观察接种肿瘤的生长并用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径 a和最短径b，根据公式计算肿瘤体积：V(mm3)＝1/6π(ab2)。用药3周后，处死小鼠，剥离实体瘤，称量湿重，根据公式计算抑瘤率：肿瘤抑瘤率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均对照组瘤重)]×100％。
3、结果
各组小鼠肿瘤体积随时间的变化见图1，肿瘤抑瘤率结果见表5。
表5
组别
肿瘤抑瘤率(％)
实施例4
34.7
实施例5
38.2
实施例6
40.9
对比例6
20
对比例7
20.4
对比例8
17.4
对比例9
16.9
对比例10
17.8
对比例11
2.6
对比例12
31.7
对比例13
31.0
对比例14
32.2
对比例15
32.2
与同期未治疗的荷瘤对照组小鼠比较，实施例4-6组小鼠出现肿瘤生长减缓现象(见图1)。取材后称取瘤重可知，荷瘤对照组小鼠瘤重为(2.25±0.57)g, 实施例4-6组小鼠瘤重分别为(1.47±0.47)g、(1.39±0.59)g、(1.33±0.62) g，抑瘤率分别为34.7％、38.2％和40.9％。
与现有技术相比，本发明将红曲霉、纳豆芽孢杆菌中菌种Bacillus natto 918 以及富硒酵母进行混合培养后，得到的复合发酵菌液用于对脱毒熟化处理后的大豆进行发酵培养，其中，红曲霉在发酵过程中将产生聚酮类次级代谢产物红曲色素，包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等，以及Monacolin K等活性物质，具有很好的抗肿瘤的效果；同时，由于三种菌种的混合培养，还能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生，从而降低生物毒性；纳豆芽孢杆菌菌种Bacillus natto 918在发酵过程中高产量产生抗癌物质大豆异黄酮，如染料木素、染料木苷和infrabin等，以及纳豆芽孢杆菌本身，可以抑制癌细胞的增殖、有效破坏或杀死癌细胞，并可以通过刺激免疫系统诱发产生干扰素起到抗癌的功效；还能提高机体巨噬细胞的活性，增强机体免疫力，并加强吞噬细胞的吞噬能力，而富硒酵母则能够在发酵过程中产生大量有机硒营养素，而硒元素可以通过吞噬细胞的功能能够影响癌细胞的能量代谢和干扰癌细胞的蛋白合成,从而抑制癌症,还能够影响化学致癌物的代谢,使它们失去致癌的活性，从而富硒纳豆发酵提取物能够起到很好的抗癌效果。
本发明添加了三七皂苷R1、虫草多糖，具有协同增效的作用，其中，三七皂苷R1通过对造血功能的调节而达到抗癌功效，虫草多糖具有抑制肿瘤细胞增殖，增强机体非特异性免疫功能及良好的免疫调节作用，与人参皂苷Rg2、人参皂苷 Rg3以及制备的富硒纳豆发酵提取物混合，人参皂苷Rg2能抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞异常分化、逆转肿瘤药物耐药性并通过提高免疫达到抗肿瘤目的，人参皂苷Rg3主要通过增强免疫功能，抑制癌细胞成长，抗肿瘤转移，起到很好的抗肿瘤效果，从而得到一种具有抗癌作用的生物发酵组合物，该组合物具有很好的抗癌效果，并针对甲状腺癌具有明显的治疗作用。
本发明制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的抗肿瘤作用，特别对甲状腺癌具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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