一个倍半萜类化合物的制备及其协同氟康唑抗耐药真菌应用
阅读说明：本技术 一个倍半萜类化合物的制备及其协同氟康唑抗耐药真菌应用 (Preparation of sesquiterpenoids and application of sesquiterpenoids in synergism of fluconazole in resisting drug-resistant fungi ) 是由 刘娜 孙钰琳 吴聪 宋美娜 杨凤英 葛迪 于 2021-01-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了本发明提供了一个倍半萜类化合物,该化合物从中药毛梗豨莶中提取：毛梗豨莶地上部位干粉先用95％乙醇浸提、浓缩得到粗浸膏,再用乙酸乙酯萃取,萃取物以甲醇-水体系过MCI树脂柱层析,其中组分分别以氯仿-甲醇、石油醚-乙酸乙酯体系过正相硅胶柱层析,最后通过高效液相色谱ODS柱和手性柱进行分离纯化后得到。评价白色念珠菌对这个化合物的体外敏感性,并观察与氟康唑合用对白色念珠菌耐药菌株(28A)的联合抗真菌作用。本发明为有效的控制真菌感染,研发新型的抗真菌药物奠定了物质基础,有利于毛梗豨莶药用价值的进一步的开发。(The invention provides a sesquiterpenoids compound, which is extracted from siegesbeckia pubescens Makino as a traditional Chinese medicine: extracting dry powder of the overground part of siegesbeckia Makino with 95% ethanol, concentrating to obtain a crude extract, extracting with ethyl acetate, performing MCI resin column chromatography on the extract with a methanol-water system, performing normal phase silica gel column chromatography on the components with chloroform-methanol and petroleum ether-ethyl acetate systems respectively, and finally performing separation and purification by using a high performance liquid chromatography (ODS) column and a chiral column. The in vitro sensitivity of Candida albicans to this compound was evaluated, and the combined antifungal effect on Candida albicans resistant strain (28A) in combination with fluconazole was observed. The invention lays a material foundation for effectively controlling fungal infection and developing novel antifungal drugs, and is beneficial to further development of the medicinal value of siegesbeckia pubescens Makino.)
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，涉及一个倍半萜类化合物的制备方法及其在协同氟康唑抗耐药真菌中的应用。
背景技术
植物药一直是天然药物的重要来源，也是人类防病治病的主要来源。真菌感染的发病率呈逐年上升趋势，并且临床上真菌耐药时有发生，促使人们将希望寄托于寻找新型的天然抗菌药物，以期发现疗效更好或具有新靶点的药物先导化合物。因此，开发安全高效的新类型抗耐药真菌药物的工作是当今药物研发领域的重要攻关方向之一。天然产物的结构多样性和易于与生物大分子结合的特点，决定了其在参与生命生理过程中所具有的无可比拟的优势，这些都赋予了天然产物在新药研发中不可替代的重要地位，是发现药物先导结构和候选药物的重要来源。中药豨莶作为一种重要的中药资源，其次级代谢产物已经被报道具有多种结构类型以及多样的生物活性。因此，从豨莶中挖掘的具有抗真菌活性的代谢产物对于有效的控制真菌感染具有重要意义。能为研发新型抗真菌药物奠定基础，并为今后临床上合理使用抗真菌药物和探索抗真菌药物未来的研究趋势提供策略指导和理论支持，鉴于此，我们提出一个倍半萜类化合物的制备及其协同氟康唑抗耐药真菌应用。
发明内容
为了进一步发掘毛梗豨莶的药用价值，本发明提供一个从毛梗豨莶中提取的倍半萜，具有协同氟康唑抗耐药真菌活性。
本发明的另一目的是提供一种上述倍半萜的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种上述倍半萜在抗真菌方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一个倍半萜类化合物，其结构如式(Ⅰ)所示：
所述倍半萜类化合物的结构类型为clovane-2β,9β-diol。
上述的一个倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎后用95％乙醇浸提，浸提液浓缩得到粗浸膏；
(2)粗浸膏悬浮于水中，然后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物过MCI树脂柱层析，用50％–85％v/v的甲醇-水洗脱得到主要洗脱成分；
(4)将上述MCI柱层析洗脱成分过正相硅胶柱层析，依次用100:1、50:1、20:1、8:1、1:1v/v的氯仿-甲醇洗脱，得到5个组分Fr.1–Fr.5：
(5)将组分Fr.4过正相硅胶柱层析，用8:1v/v的石油醚-乙酸乙酯洗脱得到组分Fr.4.1–Fr.4.3；
(6)将组分Fr.4.2经高效液相YMC-pack ODS-A色谱柱，用74％v/v的甲醇-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为12min的组分，得到上述倍半萜类化合物纯品。
优选的，步骤(1)中，所述毛梗豨莶与95％乙醇的料液比为1:2–3(w/v)。
优选的，步骤(1)中，所述毛梗豨莶粉碎至粒度直径小于3mm。
优选的，步骤(1)中，所述浸提次数为3次，每次时间为7天。
优选的，步骤(1)中，浓缩为原体积的1/100–1/150。
优选的，步骤(2)中，所述粗浸膏与水的比例为1:3–4(w/v)。
优选的，步骤(2)中，所述乙酸乙酯与水的体积比为1:3–4；所述乙酸乙酯萃取次数为1–3次。
一个倍半萜类化合物在协同氟康唑抗耐药真菌的应用。
优选的，所述真菌28A为对氟康唑(FLC)有耐药性的人口腔分离得到的白色念珠菌，但不限于白色念珠菌。
本发明的有益效果是：本发明提供了从毛梗豨莶中提取的一个倍半萜类化合物及其制备方法和在抗真菌活性中的应用，该倍半萜为clovane-2β,9β-diol，上述倍半萜与氟康唑合用，对白色念珠菌(28A)表现出协同的抗真菌活性，并明显减少氟康唑的用量。
本发明提取的活性化合物为抗真菌药物的研发提供了物质基础，有利于毛梗豨莶药用价值的进一步开发。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：
一个倍半萜类化合物，其结构如式(Ⅰ)所示：
所述倍半萜类化合物的结构类型为clovane-2β,9β-diol。
上述的一个倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎后用95％乙醇浸提，浸提液浓缩得到粗浸膏；
(2)粗浸膏悬浮于水中，然后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩后得到乙酸乙酯萃取物；
(3)将乙酸乙酯萃取物过MCI树脂柱层析，用50％–85％v/v的甲醇-水洗脱得到主要洗脱成分；
(4)将上述MCI柱层析洗脱成分过正相硅胶柱层析，依次用100:1、50:1、20:1、8:1、1:1v/v的氯仿-甲醇洗脱，得到5个组分Fr.1–Fr.5：
(5)将组分Fr.4过正相硅胶柱层析，用8:1v/v的石油醚-乙酸乙酯洗脱得到组分Fr.4.1–Fr.4.3；
(6)将组分Fr.4.2经高效液相YMC-pack ODS-A色谱柱，用74％v/v的甲醇-水洗脱，检测波长为210nm，收集保留时间为12min的组分，得到上述倍半萜类化合物纯品。
优选的，步骤(1)中，所述毛梗豨莶与95％乙醇的料液比为1:2–3(w/v)。
优选的，步骤(1)中，所述毛梗豨莶粉碎至粒度直径小于3mm。
优选的，步骤(1)中，所述浸提次数为3次，每次时间为7天。
优选的，步骤(1)中，浓缩为原体积的1/100–1/150。
优选的，步骤(2)中，所述粗浸膏与水的比例为1:3–4(w/v)。
优选的，步骤(2)中，所述乙酸乙酯与水的体积比为1:3–4；所述乙酸乙酯萃取次数为1–3次。
一个倍半萜类化合物在协同氟康唑抗耐药真菌的应用。
优选的，所述真菌28A为对氟康唑(FLC)有耐药性的人口腔分离得到的白色念珠菌，但不限于白色念珠菌。
实施例1一个倍半萜类化合物的制备
5kg毛梗豨莶干燥地上部位，粉碎至粒度直径小于3mm，用95％的乙醇浸泡提取3次，每次10L，每次7天。将乙醇提取液合并，减压浓缩得到粗浸膏302g；
粗浸膏悬浮于1.0L水中，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次0.5L。合并乙酸乙酯萃取相，减压浓缩得到乙酸乙酯萃取物83g；
将该萃取物进行MCI树脂柱层析，用甲醇-水(v/v，50％–80％)梯度洗脱，薄层层析检测合并得到主要洗脱样品32g；
将该MCI柱层析洗脱样品过正相硅胶柱层析，用氯仿-甲醇体系(v/v，100:1、50:1、20:1、8:1、1:1)洗脱，根据薄层层析分析洗脱液成分，收集得到组分Fr.1–Fr.5；
组分Fr.4经正相硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯体系(v/v，8:1)等度洗脱，根据薄层层析分析洗脱液成分，收集得到组分Fr.4.1–Fr.4.3；
组分Fr.4.2经高效液相色谱纯化(色谱柱：YMC-pack ODS-A，10*250mm，流速3mL/min,检测波长210nm)，用甲醇-水(v/v,74％)等度洗脱，收集保留时间为12min的组分，得到clovane-2β,9β-diol。
实施例2一个倍半萜类化合物的抗真菌活性
按美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)推荐的M27-A方案，采用微量稀释法测定实验菌株对挥发油的敏感性，测定时每孔含菌量约为(1～5)×103cfu/mL，取无菌的96微孔板，每行12个孔，在第一个微孔加入1024μg/mL药品原液100μL,从第二个微孔一直到第十个微孔采用10级倍比稀释的方法填充，用液体培养基稀释成浓度分别为1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL，第十一号微孔不加药液，只加100μL菌液和100μL液体培养基做阳性对照，第十二号孔只加200μL液体培养基做阴性对照，于35℃保温箱中培养12h，用酶标仪测定MIC，即，白色念珠菌(28A)生长受到80％抑制时化合物或氟康唑的浓度为最小抑菌浓度。
采用棋盘微量稀释法测定二者联合应用时的最低抑菌浓度值，将系列倍比后的化合物以及氟康唑进行系列混合，挥发油与氟康唑联合应用的实验结果通过计算抑菌浓度分数指数FIC来评价，FIC＝(MIC化合物，联合应用)/(MIC化合物，单独应用)+(MIC氟康唑，联合应用)/(MIC氟康唑，单独应用)，评价标准：FIC≤0.5，表现为协同作用；0.5<FIC≤1，表现为相加作用；1<FIC<2，表现为不相关作用；FIC≥2，表现为拮抗作用，FIC指数越小表示两药协同作用越强。
实验结果显示，式(I)所示的倍半萜及氟康唑对28A的MIC为大于256μg/mL，当倍半萜与氟康唑联合应用时，倍半萜与氟康唑对耐药菌株28A的MIC值均显著降低，FIC值小于0.09375，显示出显著的协同抗真菌活性，如表1所示，因此本发明的如式(I)所示的倍半萜类化合物具有协同氟康唑抗耐药真菌的应用。
表1.倍半萜协同氟康唑抗耐药真菌28A活性(MIC,μM)
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种用乙醇从工业大麻中提取CBD的工艺