梨PbrSTONE基因及其应用
阅读说明：本技术 梨PbrSTONE基因及其应用 (Pear PbrSTONE gene and application thereof ) 是由 吴俊� 薛程 薛雍松 张明月 李甲明 张绍铃 秦梦帆 赵渴姣 汪润泽 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了梨PbrSTONE基因及其应用。一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的PbrSTONE基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示,其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。通过在梨果实中瞬时过量表达以及基因沉默技术,证实了PbrSTONE可以改变果实石细胞和木质素的积累过程；过表达PbrSTONE的转基因拟南芥花序茎中,木质素含量及其G型单体显著增加,同时木质化束间纤维细胞层数增多,导管细胞的次生细胞壁显著加厚。由此证明PbrSTONE基因参与调控梨果实石细胞木质素的形成。(The invention discloses a pear PbrSTONE gene and application thereof. A PbrSTONE gene which is separated from a Dangshan pear and has the function of regulating and controlling the development of pear stone cells has the nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1, and the coded amino acid sequence is shown in a sequence table SEQ ID No. 2. The transient over-expression and gene silencing technology in pear fruits prove that PbrSTONE can change the accumulation process of stone cells and lignin of fruits; in the transgenic arabidopsis inflorescence stem over expressing PbrSTONE, the lignin content and G type monomers thereof are obviously increased, the number of the fibrous cell layers among lignification bundles is increased, and the secondary cell wall of ductal cells is obviously thickened. Thus, the PbrSTONE gene is proved to be involved in the regulation of the formation of the lignin of the stone cells of the pear fruits.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及梨PbrSTONE基因及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的PbrSTONE基因。
背景技术
梨是蔷薇科(Rosaceae)桃亚科(Amygdaloideae)梨属(Pyrus L.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，栽培历史悠久，种植面积广泛(滕元文,2017)。我国作为梨出口大国，近年来梨的栽培面积与产量居世界第一。但是，由于我国的一些传统的主栽品种，例如砀山酥梨，石细胞含量高，果实品质欠佳，市场竞争力弱。石细胞是梨果肉中特有的性状，也是影响果实品质的重要因素。因此，明确石细胞含量差异，解析石细胞形成机制，对改善梨果实品质显得尤为重要。
梨果实石细胞是一类短石细胞，在梨果实发育过程中，多个石细胞聚集为石细胞团(Nii et al.,2008；Zhang et al.,2017)。果肉中石细胞团的大小和数量会影响果实品质，进而影响食用口感和加工质量(Choi et al.,2007；Wu et al.,2013；Brahem et al.,2017；Zhang et al.,2017)。石细胞由薄壁细胞发育而来的厚壁组织细胞，主要包含纤维素和木质素，木质素沉积是致使石细胞细胞壁硬化的重要因素，因此石细胞合成与木质素代谢之间关系密切。石细胞的木质素主要以 G-木质素为主，并且含有少量的S-木质素，但不同梨品种的G-木质素和S-木质素含量会有所差异(Cai et al.,2010；Jin et al.,2013)。
木质素是一种多酚聚合物，沉积在维管植物的次生细胞壁中，其不仅为植物维管束提供了机械强度和疏水性，还具有阻止病原菌入侵的作用。在木质素缺陷的拟南芥突变体中，植株表现出细胞壁塌陷和倒伏，这充分体现了木质素在次生壁中的重要性(Zhong etal.,1998；Ruel et al.,2009)。然而，对造纸用的木材来说，木质素是影响纸张质量和造纸工艺的重要因素，需用大量的强酸和碱等化学物质来去除木质素,这不但增加生产成本，还会造成严重的环境污染。鉴于此，科研工作者一直期望通过改变木质素的合成途径来获取木质素含量较少，但不影响其主要功能的的植株(Vanholme et al.,2012；Zhao,2016)。
发明内容
本发明的目的是提供一个调控梨果实石细胞发育的PbrSTONE基因。
本发明的另一目的是提供该基因的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种分离自‘砀山酥梨’具有促进石细胞中木质素合成的PbrSTONE基因，其核苷酸序列为 SEQ ID No.1所示，包含819bp的开放阅读框；编码272个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2所示。
含有本发明所述PbrSTONE基因的重组表达载体。
所述的重组表达载体，以pCAMBIA1301为出发载体，所述PbrSTONE基因的插入位点为 Xba I和BamH I之间。
含有本发明所述PbrSTONE基因的宿主菌。
克隆本发明所述PbrSTONE基因cDNA序列的引物对，上游引物PbrSTONE-F1序列如SEQ ID No.3所示，下游引物PbrSTONE-R1序列如SEQ ID No.4所示。
本发明所述PbrSTONE基因在促进石细胞中木质素合成中的应用。
本发明所述的重组表达载体在促进石细胞中木质素合成的应用。
有益效果
结合全基因关联分析数据，本发明发现了一个新基因(PbrSTONE)。通过在梨果实中瞬时过量表达以及基因沉默技术，证实了PbrSTONE可以改变果实石细胞和木质素的积累过程；过表达PbrSTONE的转基因拟南芥花序茎中，木质素含量及其G型单体显著增加，同时木质化束间纤维细胞层数增多，导管细胞的次生细胞壁显著加厚。由此证明PbrSTONE基因参与调控梨果实石细胞的形成。该基因的发现补充完善了梨果实中石细胞木质素代谢调控机制，为改良梨果实石细胞含量提供理论基础，并为造纸业和生物能源产业通过基因编辑降低木质素含量提供基因资源。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1.PbrSTONE基因的发现，为减少生物体木质素合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。
2.通过农杆菌介导的转化方法，将PbrSTONE基因在梨幼果及拟南芥中进行功能验证，结果表明PbrSTONE基因具有同时调控多个木质素合成通路酶基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。
附图说明
图1为本发明实施例1的载体示意图。
图2为本发明PbrSTONE基因瞬时注射梨幼果的功能分析。
其中：a，砀山酥梨’不同组织及不同发育时期中PbrSTONE基因的相对表达量。b，瞬时表达 PbrSTONE基因的梨果实切片经间苯三酚染色。c和d，梨果肉木质素含量。e和f，梨果实木质素合成相关基因的表达量。
图3为本发明PbrSTONE基因在转基因拟南芥植株中功能分析。其中：WT：野生型；其余编号：转基因株系。a，PbrSTONE基因超表达影响木质素合成酶相关基因的表达。b-d，生长八周后野生型及转基因拟南芥植株花序茎的木质素含量(b)，木质素单体组成(c)以及束间木质化细胞层数(d)。(e-p)生长八周后野生型及转基因拟南芥植株花序茎的组织学分析，左图为野生型，右图为转基因拟南芥：e-f，甲苯胺蓝染色指示细胞形态结构；g-l，Wiesner，以及UV光检测木质素沉积空间分布；m-p，透射电镜检测次生细胞壁厚度。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1 PbrSTONE基因分离克隆与超表达载体的构建
取3μg‘砀山酥梨’早期果肉RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesiskit (Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。根据pCAMBIA-1301载体的多克隆位点和 PbrSTONE基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择Xba I和BamH I作为内切酶。按照一般设计引物的原则用Snapgene软件设计出带有酶切位点的引物SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4。 50μL的反应体系中包括200ng cDNA，1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer)，10mM dNTP， 1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS 公司)，500nM上述引物。PCR反应在eppendorf扩增仪上按以下程序完成：95℃，预变性2 分钟，95℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸1分钟，35个热循环，72℃延伸10分钟， 4℃保存。产生一条单一PCR条带产物。
PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，用小量胶回收试剂盒(购自康为世纪，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)回收DNA片段。pCAMBIA1301载体的双酶切体系总体积为 50μL，其中含有经过质粒提取获得的pCAMBIA1301载体质粒10μL，10×Buffer(购自NEB公司)5μL，Xba I 1μL，BamH I 1μL及水33μL。于37℃酶切3小时后回收。经过限制性内切酶消化过的表达载体pCAMBIA1301与PbrSTONE基因使用重组酶Exnase II(购自Vazyme 公司)于37℃连接30分钟。反应总体积20μL，其中含有5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，PbrSTONE基因的PCR回收产物2μL，pCAMBIA1301载体的双酶切回收产物6μL及水6μL。取连接产物10μL转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选出阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，重组质粒样品送生物公司测序。测序结果表明，PbrSTONE基因全长为819bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，能编码272个氨基酸残基的蛋白，序列为SEQ ID NO.2所示。系统发育进化树分析表明，PbrSTONE在其他物种中存在同源基因，但并未见相关文献报道这些基因的功能。我们将重组载体命名为 35S-PbrSTONE-GFP，构建完成的载体图谱见图1所示。应用冻融法将重组载体导入到农杆菌 GV3101中。
实施例2 PbrSTONE基因时空表达模式分析
‘砀山酥梨’不同组织样品采自江苏省高邮果园(2015年)。总RNA的提取采用CTAB法 (Porebski et al.,1997)，并通过分光光度计和琼脂糖胶检测提取样品的质量。取3μg提取的总 RNA，用one-step gDNA removal and cDNA synthesis kit(Transgen,China)进行反转录，方法参照说明书。荧光定量PCR所用引物为基因特异引物对：SEQ ID No.5和SEQID No.6；以 GAPDH为内参基因，荧光定量试剂盒购自Roche公司。Real-timePCR所用仪器为Roche 480 定量PCR仪，反应体系为：2×SYBR GreenI Master Mix 10μL，上下游引物(10μM)0.4μL， 2μLcDNA，7.2μLPCR级别的水。反应条件为95℃变性5min；95℃预变性5s，60℃退火5s， 72℃延伸10s重复45个循环；熔解曲线分析65℃到95℃，每5s升高1℃。
有研究表明梨果实发育的早期阶段和维管组织中有大量木质素的合成(Xue etal.,2019)。不同梨组织的qRT–PCR结果表明，PbrSTONE在果实发育前期的表达量显著高于后期；茎和花药中的表达量也明显高于叶片(图2a)。总之，PbrSTONE在花后21至49天的果实，茎和花药中高表达，这表明，PbrSTONE的表达与木质素沉积的时间和空间一致，很有可能参与茎杆和果肉石细胞中木质素的合成，也可能参与花药的开裂。
实施例3梨果实瞬时转化及木质素含量和基因表达量检测
(1)梨果实瞬时转化
用含有PbrSTONE过量表达载体的农杆菌，通过农杆菌介导法注射到花后35天左右的‘砀山酥梨’，方法如下：
1、将含有正确质粒的农杆菌于固体培养基上活化，在温度为28℃的培养箱中生长48小时；
2、在100mL锥形瓶中加入30mL含有R+与K+的液体LB培养基，用枪头挑入活化的农杆菌，在28℃、200rpm的摇床中生长12小时；
3、将菌液倒入50mL离心管6000rpm离心15分钟收集全部菌体；
4、用适量的诱导介质(10mM MgCl2、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH 5.6)重悬沉淀，调整OD值在0.8-1.2，室温中用脱色摇床诱导4个小时；
5、将侵染液注入到花后35天左右的梨果实中，每次至少注射10个果实，试验进行三次生物学重复；
6、暗培养24小时，再放到光周期为16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，温度保持22℃，培养7-10天；
(2)组织学分析
用刀片切开果实，间苯三酚-盐酸染色，具体步骤如下：
1、首先用30％盐酸溶液(V/V)处理1分钟；
2、10％间苯三酚溶于80％乙醇(W/V)；
3、再滴到已经过盐酸处理的切片上，染色5分钟；
4、最后用足量的水清洗终止反应。
间苯三酚-盐酸染色发现，过量表达PbrSTONE的部位木质素染色效果明显增强，注射 pCAMBIA1301载体的部位与未注射的部分无明显差异(图2b)。
(3)注射部位木质素含量检测
石细胞木质素含量参照溴乙酰法，木质素含量用测定值/所用样品重量的百分数表示(Acker et al.,2013)。注射pCAMBIA1301载体的部位与未注射的部分木质素含量无明显差异，而过量表达PbrSTONE的部位木质素含量显著升高(图2c-d)。
(4)注射部位PbrSTONE与木质素合成相关基因相对表达量检测
RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例2。过量表达PbrSTONE的部位，不仅PbrSTONE的表达量上升，同时会引起Pbr4CL1，Pbr4CL2，PbrC3H1，PbrCAD，PbrCSE，PbrLAC2，PbrLAC15及PbrLAC18表达量显著上升(图2e-f)。总之，以上这些结果表明过量表达PbrSTONE会促进梨果实石细胞中木质素合成。
表1梨实时荧光定量引物
实施例4拟南芥的遗传转化及转化植株分子鉴定
用含有PbrSTONE过量表达载体的农杆菌，通过沾花法侵染Col-0拟南芥(Clough&Bent, 1998)。具体方法如下：
1、用含有50mg/L K+和100mg/L R+的固体LB培养基划线活化农杆菌，在 28℃的培养箱中培养36小时；
2、用灭菌的牙签或枪头挑取线上的单克隆，放入100mL锥形瓶中，加入30 mL含有50mg/L K+和100mg/L R+的液体LB培养基，在28℃的摇床中200rpm 培养12小时；
3、用50mL离心管5000rpm离心20分钟收集菌体；
4、将菌体重悬在同等体积的转化介质【1/2MS；5％蔗糖(W/V)；10μg/L 6-BA；用KOH调pH到5.7；0.025％表面活性剂(V/V)】中；
5、将待转化的拟南芥剪去角果和已开放的花；
6、把拟南芥花序浸泡在含有菌体的转化介质中，用真空抽滤泵抽真空到380 mm汞柱，浸泡5分钟；
7、放置在22℃的培养室中避光24小时，之后放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。
取潮霉素抗性两周大的拟南芥T1代阳性植株，取花序茎杆提取RNA后，用荧光定量PCR 检测PbrSTONE表达量，引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。其中有3个株系(OE-3、OE-6、 OE-8)存在较高的表达量，它们的纯合子用于后续实验。T3代纯合子种子与野生型种子经过消毒一起播到了发芽培养基【MS；3％蔗糖(W/V)；0.75％琼脂(W/V)】上。种子发芽后将幼苗移到营养土中，放在22℃、长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下培养。
实施例5转基因植株木质素相关生理指标测定
(1)转基因拟南芥花序茎木质素合成相关基因相对表达量检测
取野生型和转基因系4周大的植株初生花序茎，RNA的提取、cDNA的合成、荧光定量PCR的体系及步骤参照实施例2。
过量表达PbrSTONE拟南芥植株中，木质素合成基因AtC3H1和AtLAC17的表达量都极显著上升(图3a)，表明PbrSTONE通过激活木质素合成相关基因的表达，引起茎杆中过度积累木质素。
表2拟南芥实时荧光定量引物
(2)转基因拟南芥木质素含量及单体含量的测定
取野生型和T3代转基因系各5株，收集花序茎下部10cm长的茎，切成2mm长度，并混合样品烘干至恒重。取5mg干燥过后的样品提取CWR用于木质素分析，步骤如下：样品放在2mL离心管中，每步处理各30分钟，经过水(98℃)、乙醇(76℃)、氯仿(59℃)、丙酮(54℃)，最后干燥至恒重。溴乙酰可溶木质素含量测定，参照(Acker et al.,2013)。木质素组成成分用thioacidolysis法测定，方法参照(Lapierre et al.,1995)。木质素经过thioacidolysis 作用形成的派生物用三甲基硅烷衍生化后，用GC-MS检测。试验重复四次，每次都用相同量的样品。
经测定转基因系花序茎中的木质素含量显著上升(图3b)；并且转基因系G型单体的含量显著上升，而S型单体的含量无显著差异(图3c)；同时，转基因系束间细胞层数显著增多(图 3d)。
(3)转基因拟南芥花序茎组织结构观察
1组织切片染色
取生长发育八周后的野生型及转基因拟南芥植物的花序茎底部1cm，用5％琼脂糖凝胶包埋，使用莱卡VT1000S振动切片机切出100μm厚度的切片。
甲苯胺蓝染色：将切片置于0.3％甲苯胺蓝试剂中染色30s，用去离子水洗净后观察；
Wiesner染色：将切片置于Wiesner试剂【37％HCl:3％间苯三酚酒精溶液＝1：2(v：v)】中染色1min，用去离子水洗净后观察；
染色：将切片置于0.5％高锰酸钾水溶液中2min，用去离子水洗净后加入3.7％HCl 清洗两次，吸取上清后加入浓氨水1min后，直接取出制片观察。
染色切片的观察使用尼康Ni-U正置显微镜。
2木质素自发荧光观察
未染色的切片用尼康Ti-E倒置荧光显微镜观察，二极管激光器发射355/25nm激光，不同样品间激光强度、放大倍数、光电倍增管的增益设置保持一致。
3透射电镜
与石蜡切片相同的样品用2.5％戊二醛固定液4℃固定12小时，取材后要迅速投入到新鲜的2.5％戊二醛固定液中；取材应在0-4℃低温下操作，取材的器械和固定液也要遇冷；由于固定液的渗透性较差，戊二醛渗透深度为0.5mm，锇酸的渗透深度为0.25mm，所以样品大小约为1.5mm×3mm，厚度不超过2mm；对于漂浮在固定液上面的材料，需要抽气使其完全浸渍于固定液下面，充分固定。方法参照(Whitehill et al.,2016)。用ImageJ软件测量木质部细胞次生细胞壁的厚度。
通过石蜡切片、木质素自发荧光检测、透射电镜检测发现，转基因拟南芥茎杆木质部细胞形态正常，但木质素显著积累、自发荧光较强且次生细胞壁更厚(图3e-p)。
主要参考文献
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序列表
<110> 南京农业大学
<120> 梨PbrSTONE基因及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> ‘砀山酥梨’(Dangshan Pirum)
<400> 1
atggcgcgtg gtctcctcgc ttgctttgga tcaaaaggag gatcccgcac gtcccatgaa 60
aagcatgctg cgggggcaac agcgcatgtc tccgctgagg agcagcagcg gagcgggccg 120
gtgctggtgg agctgttctc gtcgcagggc tgcagcacct cgccggtggc agagctgctg 180
gtgtcgaggc ttgggagagg ggattttgat gggacggatc tgcctcctgt ggtggtgctg 240
gcgttccacg tggactactg ggactacatg ggctggaagg acccatatgg gtcaagccag 300
tggactgtac ggcagaaggc ctatgtcgag gccttgggtc tggacaccat gttcaccccc 360
cagattgtcc ttcaaggtag ggcccaatgt gttggcaatg atgagagtgc cttgctaacg 420
tcgatcaagg atgcacctag atatcctgca cccgcattcc aggcaacatt ccaaaggcca 480
tcgccggact ccctgcaagt atccctaaca gggtcattga ggtcaaaggt ggacaactac 540
ggtgtcaatg tgatggtggc gctgtacgag aacgggctga tcaccgactg ccccaaggga 600
gagaaccaag gacgtgtcct gtccaacgac tttgtcgtcc gacgacttga aaagctctgc 660
actgtcaaag acattgctgc aaagaagacc atttctggaa ccatcaactt ctccttgtgg 720
gaaggtttca atccagccaa atgtggcatg gccctcttcg ttcagaaccc ttcccatcaa 780
atttttggtt tgcagaactt tcagctgccg gacaattag 819
<210> 2
<211> 272
<212> PRT
<213> ‘砀山酥梨’(Dangshan Pirum)
<400> 2
Met Ala Arg Gly Leu Leu Ala Cys Phe Gly Ser Lys Gly Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Ser His Glu Lys His Ala Ala Gly Ala Thr Ala His Val Ser Ala
20 25 30
Glu Glu Gln Gln Arg Ser Gly Pro Val Leu Val Glu Leu Phe Ser Ser
35 40 45
Gln Gly Cys Ser Thr Ser Pro Val Ala Glu Leu Leu Val Ser Arg Leu
50 55 60
Gly Arg Gly Asp Phe Asp Gly Thr Asp Leu Pro Pro Val Val Val Leu
65 70 75 80
Ala Phe His Val Asp Tyr Trp Asp Tyr Met Gly Trp Lys Asp Pro Tyr
85 90 95
Gly Ser Ser Gln Trp Thr Val Arg Gln Lys Ala Tyr Val Glu Ala Leu
100 105 110
Gly Leu Asp Thr Met Phe Thr Pro Gln Ile Val Leu Gln Gly Arg Ala
115 120 125
Gln Cys Val Gly Asn Asp Glu Ser Ala Leu Leu Thr Ser Ile Lys Asp
130 135 140
Ala Pro Arg Tyr Pro Ala Pro Ala Phe Gln Ala Thr Phe Gln Arg Pro
145 150 155 160
Ser Pro Asp Ser Leu Gln Val Ser Leu Thr Gly Ser Leu Arg Ser Lys
165 170 175
Val Asp Asn Tyr Gly Val Asn Val Met Val Ala Leu Tyr Glu Asn Gly
180 185 190
Leu Ile Thr Asp Cys Pro Lys Gly Glu Asn Gln Gly Arg Val Leu Ser
195 200 205
Asn Asp Phe Val Val Arg Arg Leu Glu Lys Leu Cys Thr Val Lys Asp
210 215 220
Ile Ala Ala Lys Lys Thr Ile Ser Gly Thr Ile Asn Phe Ser Leu Trp
225 230 235 240
Glu Gly Phe Asn Pro Ala Lys Cys Gly Met Ala Leu Phe Val Gln Asn
245 250 255
Pro Ser His Gln Ile Phe Gly Leu Gln Asn Phe Gln Leu Pro Asp Asn
260 265 270
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacggggga ctctagaatg gcgcgtggtc 30
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgctcacca tggatccatt gtccggcagc tga 33
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagattgtc cttcaaggta gg 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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