一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法
阅读说明：本技术 一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法 (Preparation method of high-purity diglyceride phosphate ) 是由 王方华 王永华 闵雪珂 杨博 王卫飞 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶的基因工程技术领域,公开了一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法,以溶血磷脂为原料,以金属离子螯合剂处理的pfGDPD为催化剂,在水相体系中水解溶血磷脂,得到甘油磷酸二酯产物；所述pfGDPD的氨基酸序列为SEQID No:1。本发明从溶血磷脂出发,通过单一酶法水解一步可制备获得高纯度的甘油磷酸二酯(如GPC,GPE,GPI等),转化率接近100％。本发明为甘油磷酸二酯的生产提供了一种新的思路和方法。(The invention belongs to the technical field of enzyme genetic engineering, and discloses a preparation method of high-purity diglyceride phosphate, which takes lysophospholipid as a raw material and pfGDPD treated by a metal ion chelating agent as a catalyst to hydrolyze the lysophospholipid in a water phase system to obtain a diglyceride phosphate product; the amino acid sequence of the pfGDPD is SEQID No: 1. The invention starts from lysophospholipid, can prepare high-purity diglyceride phosphate (such as GPC, GPE, GPI and the like) by one-step single enzymatic hydrolysis, and has the conversion rate close to 100 percent. The invention provides a new idea and method for the production of diglyceride phosphate.)
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种利用酶法获得高纯度催化产物甘油磷酸二酯的方法。
背景技术
甘油磷酸二酯，是人体内正常存在的水溶性小分子物质。常见的有甘油磷脂酰胆碱(GPC)、甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酰肌醇(GPI)等。甘油磷酸二酯是磷脂代谢的产物并在人体内发挥重要的生理功能。以GPC为例，在体内，GPC最重要的生理功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂(PC)的合成提供必要的胆碱源。临床研究表明:GPC治疗脑缺血性中风、阿尔茨海默氏症、多发性脑梗死型痴呆疗效显著。临床用于改善中毒性肝损伤等保肝作用；同时，GPC还具有显著的防衰老、降血脂、健脑等多种功效，作为保健品及药物制剂的研究与应用正越来越受到重视，开发高纯度甘油磷酸二酯制备方法具有重要价值。
目前，甘油磷酸二酯的的制备方法主要有3种:①生物组织直接萃取法，该方法工艺复杂，得率低，成本高；②从卵磷脂水解制备:此方法工艺简单，成本低，但后处理相当繁琐，产品纯度低，尤为重要的是无法解决环保问题。③化学法合成:从基本化工原料制备，但步骤繁多，工艺复杂，且收率较低。以D-甘露糖醇为原料进行一系列反应制备甘油磷酸胆碱为例，其收率仅为38.6％(率以D-甘露醇计)。因此，急需开发新的制备方法，提高产物纯度，并降低生产成本，简化生产程序，从而促进甘油磷酸二酯的广泛应用。
甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD；EC 3.1.4.46)是一类催化甘油磷酸二酯的3′–5′磷酸二酯键水解的酶。发明人在前期研究(Wang FH,Lai LH,Liu YH,Yang B,Wang YH*.Expression and Characterization of a Novel GlycerophosphodiesterPhosphodiesterase from Pyrococcus furiosus DSM 3638 That PossessesLysophospholipase D Activity.Int.J.Mol.Sci.2016,17(6),831.)中成功构建了来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法，该酶除了水解甘油磷酸二酯底物外，还能水解溶血磷脂底物。但在水解溶血磷脂底物的实验中会产生甘油磷酸二酯(如GPC，GPE，GPI等)和溶血磷脂酸(LPA)两种产物，在甘油磷酸二酯的高纯度制备方面的应用仍不理想。
发明内容
本发明基于实验所发现的pfGDPD具有水解酯键的特性，提出一种全新的甘油磷酸二酯制备方法，从溶血磷脂出发，通过单一酶法水解一步可制备获得高纯度的甘油磷酸二酯(如GPC,GPE,GPI等)，转化率接近100％。
本发明的技术方案如下：
一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法，以溶血磷脂为原料，以金属离子螯合剂处理的来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)作为酶催化剂，在水相体系中水解溶血磷脂，得到甘油磷酸二酯产物；其中，pfGDPD的氨基酸序列为SEQID No:1，其核酸序列为SEQID No:2。具体方法是将溶血磷脂底物溶于pH8.0的缓冲溶液中，在温度为30-90℃的条件下，向反应体系中加入用金属离子螯合剂处理后的pfGDPD，进行酶解反应，制得高纯度甘油磷酸二酯。
优选地，缓冲溶液为硼酸缓冲液。
优选地，所述溶血磷脂为溶血磷脂酰胆碱(LPC)，溶血磷脂乙醇胺(LPE)，溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)，溶血磷脂酰肌醇(LPI)，溶血磷脂酰甘油(LPG)中的任意一种或两种以上。
优选地，所述金属离子螯合剂处理的温度为4℃-90℃，处理时间为1-12h，螯合剂的浓度为10-50mM。
优选地，所述螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氨基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)及其盐、柠檬酸(CA)及其盐、酒石酸(TA)及其盐、葡萄糖酸(GA)及其盐中的任意一种或两种以上。
优选地，所述酶解反应的条件为温度30-50℃，时间4～48h，300±200r/min搅拌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明使用金属离子螯合剂处理过后的来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)作为酶催化剂，从溶血磷脂出发，通过单一酶法水解一步可制备获得高纯度的甘油磷酸二酯(如GPC,GPE,GPI等)，不含有杂质LPA，转化率接近100％。
附图说明
图1为实施例1未经处理的野生型pfGDPD水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
图2为实施例2野生型pfGDPD金属离子螯合剂处理后水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
图3为实施例2野生型pfGDPD金属离子螯合剂处理后水解溶血磷脂的质谱图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：经处理的纯化pfGDPD水解溶血磷脂
(1)金属离子螯合剂处理pfGDPD：向纯化过的pfGDPD中加入终浓度为20mM的EDTA-2Na，于4℃下静置处理2h。
(2)EDTA-2Na处理后的pfGDPD水解溶血磷脂：用硼酸盐缓冲液(pH 8.0)溶解溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)，加入步骤(1)处理后的pfGDPD，于恒温振荡仪中30℃，300r/min反应4h。
取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明(图2)金属离子螯合剂处理后的野生型pfGDPD催化水解溶血磷脂底物能力明显增强，反应体系中只含有GPC，未检测到LPA(16:0)的生成及LPC(16:0)的残留，生成甘油磷酸二酯(GPC)的纯度较高。
将本实施例的反应样品进行质谱检测，结果表明(图3)只检测到GPC的存在，证实反应过程生成甘油磷酸二酯(GPC)的转化率达到100％。
实施例2
不同金属离子螯合剂处理pfGDPD后水解溶血磷脂生成GPC情况检测：分别向纯化过的pfGDPD中加入终浓度为20mM的乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其钠盐、柠檬酸及其钠盐、酒石酸及其钠盐、葡萄糖酸及其钠盐中，于4℃下静置处理2h后，分别取处理后的pfGDPD水解溶血磷脂，反应体系与反应条件同实施例1。取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明，不同金属离子螯合剂处理效果上没有显著差异，反应过程生成甘油磷酸二酯(GPC)的转化率均可达到100％。
对比实施例：未经处理的纯化pfGDPD水解溶血磷脂
所用原料为溶血磷脂酰胆碱(16:0LPC)
用硼酸盐缓冲液(pH 8.0)溶解溶血磷脂酰胆碱LPC(16:0)，加入纯化的pfGDPD，于恒温振荡仪中30℃，300r/min反应4h。取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明(图1)未经处理的野生型pfGDPD催化水解溶血磷脂底物能力较差，反应体系中除了含有GPC外，还有LPA以及未反应完的底物LPC(16:0)，生成甘油磷酸二酯GPC的转化率仅为5％以内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Gly Asn Pro Met Trp Glu Arg Asp Lys Ile Ile Val Leu Gly
1 5 10 15
His Arg Gly Tyr Met Ala Lys Tyr Pro Glu Asn Ser Leu Leu Ser Ile
20 25 30
Arg Lys Ala Ile Glu Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile Asp Val Trp
35 40 45
Leu Ser Lys Asp Asn Lys Val Ile Leu Met His Asp Glu Thr Ile Asp
50 55 60
Arg Thr Ser Asn Leu Lys Gly Arg Gln Lys Glu Met Thr Leu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Lys Lys Ala Asn Ile Gly Met Gly Glu Arg Ile Pro Thr Leu Glu
85 90 95
Glu Val Phe Glu Ile Leu Pro Lys Asp Ala Leu Leu Asn Ile Glu Ile
100 105 110
Lys Asp Arg Asp Ala Ala Lys Glu Val Ala Arg Ile Val Ser Glu Asn
115 120 125
Asn Pro Glu Arg Val Met Ile Ser Ser Phe Asp Ile Glu Ala Leu Arg
130 135 140
Glu Tyr Arg Lys Tyr Asp Asp Thr Thr Ile Met Gly Leu Leu Val Asp
145 150 155 160
Lys Glu Glu Thr Val Pro Leu Ile Pro Lys Leu Lys Glu Lys Leu Asn
165 170 175
Leu Trp Ser Val Asn Val Pro Met Glu Ala Ile Pro Ile Ile Gly Phe
180 185 190
Glu Lys Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Trp Val Arg Ser Leu Gly Leu Lys
195 200 205
Ile Val Leu Trp Thr Glu Asp Asp Lys Leu Phe Tyr Val Asp Glu Asn
210 215 220
Leu Lys Arg Leu Leu Gly Met Phe Glu Val Val Ile Ala Asn Asp Val
225 230 235 240
Glu Arg Met Val Ser Tyr Leu Ser Ser Leu Gly Ile Arg
245 250
<210> 2
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtaggta acccaatgtg ggagcgtgat aagatcatcg tcctgggtca tcgtggttac 60
atggcaaagt acccggagaa cagcctgctg tctatccgta aagctattga agcaggtgca 120
gatggtgttg aaatcgatgt atggctgtct aaagacaaca aagtgatcct gatgcacgac 180
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