具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种细菌纤维素的制法，其特征在于：包括以下步骤：

S01，制备细菌纤维素膜材：以大豆提取蛋白后的副产物残渣为基础原料，简称大豆残渣，利用大豆残渣制备大豆残渣生物发酵培养基，在大豆残渣生物发酵培养基中，加入15％木葡糖醋酸杆菌种子液和苦杏仁酶，每100mL大豆残渣生物发酵培养基中加入木葡糖醋酸杆菌种子液20mL，pH 5.5，培养温度30℃，培养时间15天，苦杏仁酶用量300U/mL，获得细菌纤维素膜材；

S02，取细菌纤维素膜材，采用蒸馏水多次(具体为3次)冲洗后浸入0.1mol/mL的NaOH溶液中，80℃水浴温浸，100rpm/min磁力搅拌2h，除去残存的菌体和培养基，取出后清洗，然后再浸入80℃去离子水中清洗2h，反复3次，直至细菌纤维素膜材呈白色半透明状，再用去离子水反复冲洗至中性，冷冻干燥24h，粉碎，获得细菌纤维素。

所述大豆提取蛋白的方法为：用含2％NaOH和8％尿素的混合溶液于80℃浸泡大豆粉60min，搅拌速度100rpm/min，清洗残渣，然后过200目筛，获得所述大豆残渣。

包含一种细菌纤维素的制法获得的细菌纤维素的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜，包括细菌纤维素粉末4重量份、壳聚糖2重量份、红花黄色素0.5重量份、人参皂苷0.5重量份，透皮吸收促进剂0.2重量份、NaOH 5重量份、尿素20重量份和纯化水75重量份。

所述透皮吸收促进剂包括氮酮、1,2-丙二醇和油酸，三者的重量比为1:1:1。

如图4所示，细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜的制法，包括以下步骤：每100mL反应溶液中纯化水占75％(质量百分比，w/w％)、NaOH 5％和尿素20％；每100mL反应溶液中加入细菌纤维素颗粒4克和壳聚糖2克，进行超声或微波反应，反应时间为30min，反应温度为50℃；使细菌纤维和壳聚糖完全溶解，再超声或磁力搅拌除去气泡，过80目筛得到均匀的膜材混合溶液，进行3次冻融循环，每次于-20℃冷冻12小时，室温条件下解冻6小时；前两次冻融循环解冻后，用纯化水洗涤膜材至pH 7.0，第三次冻融循环解冻后加入红花黄色素、人参皂苷各0.5克和透皮吸收促进剂0.2克，将混合均匀的溶液导入面膜模具中，进行冷冻干燥，预冻温度-55℃，预冻时间6小时，隔板温度45℃，干燥时间24小时，即得细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜。

除去气泡时超声功率为100W。

除去气泡时磁力搅拌的转速为100rpm/min。

所述超声或微波反应中，超声波功率300W，微波功率150W。

1.细菌纤维素含量测定方法：

精密称取细菌纤维素膜材100mg，采用蒸馏水多次冲洗后浸入0.1mol/mL的NaOH溶液中，80℃水浴温浸，100rpm/min磁力搅拌2h，除去残存的菌体和培养基，取出后清洗，然后再浸入80℃去离子水中清洗2h，反复3次，直至细菌纤维素膜呈白色半透明状，再用去离子水反复冲洗至中性，经冷冻干燥24h后再次称重。

细菌纤维素含量(g/L)＝细菌纤维素恒重(g)/培养基体积(L)

细菌纤维素结晶度测定：将纯化后的细菌纤维素颗粒干燥后，利用X-射线衍射仪测定衍射结晶图谱。实验条件：最大管压40kV，最大管流40mA，Cu靶Ka射线源，扫描范围5～60°；扫描步长0.013°/步。结晶度指数(Xc)按如下公式计算：

结晶指数＝I₀₂₀－I_am/I₀₂₀

其中，I₀₂₀代表(020)晶面的衍射强度；I_am代表2θ＝18.0°时的衍射强度。根据峰强度法可以计算出细菌纤维素的结晶度指数为72.97％，结晶度较高。

2.细菌纤维素纳米三维网状结构：

如图1～图2所示，扫描电镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)分析可见，本实施例获得的细菌纤维素具有超精细纳米级三维多孔网络结构。

3.细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜的力学性能检测(抗拉试验)：

将面膜切成20mm×20mm(长×宽)的尺寸。在室温下，使用WAW-2000D型万能试验机以5mm/min的拉伸速度进行拉伸试验。每组样品平行做3次实验。结果表明，该面膜因具有三维网状结构，冷冻干燥后膜内失去水分，使得拉伸性能增强，拉伸强度可达1.42MPa。

4.细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜的抑菌实验：

①供试菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母菌。

②细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜溶液的灭菌处理：

将细菌纤维素4克、壳聚糖2克于80℃溶解于100mL纯化水中，200目筛过滤，分别配制成10mg/mL、20mg/mL和30mg/mL的膜材溶液，置于高压蒸汽灭菌锅中，在105℃下灭菌10min。

③抑菌效果的测定

供试菌液的配制：将供试菌用适宜的斜面培养基活化后，分别挑取少量菌苔，用无菌水制成含菌量为10⁶～10⁷cfu/mL的菌悬液备用。

在无菌条件下，用已灭菌的培养基制成平板，待冷却凝固后，分别加入0.5mL供试菌液，用无菌涂布器涂布均匀。用无菌镊子夹取烘干并含有细菌纤维素和壳聚糖的滤纸片放入培养基表面，每个表面皿放3片，其中2片为样品，1片为无菌水作对照。每一菌种作3个平行组。置于恒温培养箱中培养(细菌37℃，24h，真菌28℃，48h)，取出后测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。

表1滤纸片法测定细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜抑菌活性

结果表明，本发明的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜对细菌、真菌均有一定的抑制作用。

5.细菌纤维素的生物相容性实验：

细胞平台：L929小鼠成纤维细胞。

膜材浸提液的制备方法：精密称取细菌纤维素膜材100mg，采用蒸馏水多次冲洗后浸入0.1mol/mL的NaOH溶液中，80℃水浴温浸，100rpm/min磁力搅拌2h，除去残存的菌体和培养基，取出后清洗，然后再于80℃溶解于100mL纯化水中，200目筛过滤，分别配制成0.001mol/L、0.01mol/L、0.1mol/L和1mol/L的膜材溶液，备用。

DMEM高糖培养基为市售产品。

实验分组：实验组，给予细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜浸提液；空白组，给予DMEM高糖培养基溶液；对照组，给予高密度聚乙烯浸提液。

实验组、空白组和对照组的浓度，均按照0.001、0.01、0.1、1mol/L，由低到高配制。

执行标准：GB/T16886.5。

试验步骤：取对数生长期的L929小鼠成纤维细胞加入DMEM细胞培养液，调节细胞密度为1×10⁴个细胞/mL。将配制好的细胞悬液接种96孔培养板，每组各设6孔，每孔接种100μL细胞悬浮液。置于5％CO₂中，在37℃下培养过夜，更换培养基继续培养。24小时后，再次更换培养基，然后添加500mL0.5mg/mL MTT培养基进行培养。4小时后，终止培养，并吸出孔中的培养基。然后，向每个孔中加入600μL二甲基亚砜，并在振荡器上低速振荡10分钟，以至于晶体完全溶解。最后使用全波长酶标仪(OD＝570)进行检测，图像显示模式为Mean±SD。细胞存活率计算公式为：

细胞存活率＝D/D_OD×100％

其中，D_OD是对照组的吸光度值，D是实验组的吸光度值。

如图3所示，结果显示，细菌纤维素膜材在浓度为1mol/L时，细胞存活率仍在90.6％，按照细胞毒性分级标准为Ⅰ，符合国家规定的标准。说明本实施例的细菌纤维素生物相容性好，细胞毒性很小。

实施例2：

一种细菌纤维素的制法，包括以下步骤：

S01，制备细菌纤维素膜材：以大豆提取蛋白后的副产物残渣为基础原料，简称大豆残渣，利用大豆残渣制备大豆残渣生物发酵培养基，在大豆残渣生物发酵培养基中，加入10％木葡糖醋酸杆菌种子液和苦杏仁酶，每100mL大豆残渣生物发酵培养基中加入木葡糖醋酸杆菌种子液12mL，pH 4.8，培养温度28℃，培养时间12天，苦杏仁酶用量150U/mL，获得细菌纤维素膜材；

S02，取细菌纤维素膜材，采用蒸馏水多次冲洗后浸入1mol/mL的NaOH溶液中，70℃水浴温浸，90rpm/min磁力搅拌3h，除去残存的菌体和培养基，取出后清洗，然后再浸入60℃去离子水中清洗2.5h，反复3次，直至细菌纤维素膜材呈白色半透明状，再用去离子水反复冲洗至中性，冷冻干燥24h，粉碎，获得细菌纤维素。

所述大豆提取蛋白的方法为：用含6％NaOH和15％尿素的混合溶液于100℃浸泡大豆粉120min，搅拌速度120rpm/min，清洗残渣，然后过300目筛，获得所述大豆残渣。

包含一种细菌纤维素的制法获得的细菌纤维素的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜，包括细菌纤维素粉末2重量份、壳聚糖4重量份、红花黄色素1.5重量份、人参皂苷1.5重量份，透皮吸收促进剂0.3重量份、氢氧化钾5重量份、尿素5重量份、氨水5重量份和纯化水85重量份。

所述透皮吸收促进剂包括油茶树枝挥发油、聚乙二醇、薄荷脑、鸵鸟油和冰片，五者的重量比为1:1:1:1:2。

细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜的制法，包括以下步骤：每100mL反应溶液中纯化水占85％、氢氧化钾5％、尿素5％和氨水5％；每100mL反应溶液中加入细菌纤维素颗粒2克和壳聚糖4克，进行超声或微波反应，反应时间为60min，反应温度为80℃；使细菌纤维和壳聚糖完全溶解，再超声或磁力搅拌除去气泡，过100目筛得到均匀的膜材混合溶液，进行3次冻融循环，每次于-20℃冷冻24小时，室温条件下解冻10小时；前两次冻融循环解冻后，用纯化水洗涤膜材至pH 7.0，第三次冻融循环解冻后加入红花黄色素、人参皂苷各1.5克和透皮吸收促进剂0.3克，将混合均匀的溶液导入面膜模具中，进行冷冻干燥，预冻温度-65℃，预冻时间10小时，隔板温度60℃，干燥时间48小时，即得细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜。

除去气泡时超声功率为150W。

除去气泡时磁力搅拌的转速为150rpm/min。

所述超声或微波反应中，超声波功率400W，微波功率250W。

经检测，本实施例制备的细菌纤维素的结晶度指数为70.15％，结晶度较高。本实施例制备的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜拉伸强度可达1.54MPa，对细菌、真菌均有一定的抑制作用，并且生物相容性良好。

实施例3：

一种细菌纤维素的制法，包括以下步骤：

S01，制备细菌纤维素膜材：以大豆提取蛋白后的副产物残渣为基础原料，简称大豆残渣，利用大豆残渣制备大豆残渣生物发酵培养基，在大豆残渣生物发酵培养基中，加入18％木葡糖醋酸杆菌种子液和苦杏仁酶，每100mL大豆残渣生物发酵培养基中加入木葡糖醋酸杆菌种子液25mL，pH 6.0，培养温度35℃，培养时间18天，苦杏仁酶用量450U/mL，获得细菌纤维素膜材；

S02，取细菌纤维素膜材，采用蒸馏水多次冲洗后浸入0.5mol/mL的NaOH溶液中，90℃水浴温浸，120rpm/min磁力搅拌2h，除去残存的菌体和培养基，取出后清洗，然后再浸入90℃去离子水中清洗2h，反复4次，直至细菌纤维素膜材呈白色半透明状，再用去离子水反复冲洗至中性，冷冻干燥36h，粉碎，获得细菌纤维素。

所述大豆提取蛋白的方法为：用含4％NaOH和10％尿素的混合溶液于90℃浸泡大豆粉100min，搅拌速度110rpm/min，清洗残渣，然后过250目筛，获得所述大豆残渣。

包含一种细菌纤维素的制法获得的细菌纤维素的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜，包括细菌纤维素粉末3重量份、壳聚糖4重量份、红花黄色素1重量份、人参皂苷1重量份，透皮吸收促进剂0.2重量份、碳酸钠10重量份、碳酸氢钠10重量份和纯化水80重量份。

所述透皮吸收促进剂为N-甲基-2-吡咯烷酮NMP。

细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜的制法，包括以下步骤：每100mL反应溶液中纯化水占80％、碳酸钠10％和碳酸氢钠10％；每100mL反应溶液中加入细菌纤维素颗粒3克和壳聚糖4克，进行超声或微波反应，反应时间为40min，反应温度为70℃；使细菌纤维和壳聚糖完全溶解，再超声或磁力搅拌除去气泡，过100目筛得到均匀的膜材混合溶液，进行3次冻融循环，每次于-20℃冷冻18小时，室温条件下解冻8小时；前两次冻融循环解冻后，用纯化水洗涤膜材至pH 7.0，第三次冻融循环解冻后加入红花黄色素、人参皂苷各1克和透皮吸收促进剂0.2克，将混合均匀的溶液导入面膜模具中，进行冷冻干燥，预冻温度-60℃，预冻时间8小时，隔板温度50℃，干燥时间36小时，即得细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜。

除去气泡时超声功率为120W。

除去气泡时磁力搅拌的转速为120rpm/min。

所述超声或微波反应中，超声波功率350W，微波功率200W。

经检测，本实施例制备的细菌纤维素的结晶度指数为78.23％，结晶度较高。本实施例制备的细菌纤维素-壳聚糖复合凝胶护肤面膜拉伸强度可达1.48MPa，对细菌、真菌均有一定的抑制作用，并且生物相容性良好。

实施例4：

本实施例与实施例1的区别仅在于：

所述透皮吸收促进剂为甘油和甘露醇，二者的重量比为1:1。

所述碱性为碳酸钾。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。