具体实施方式

本领域需要如下病毒疗法，其在中和抗体的存在下是有效的，能够重复全身性使用并且其复制仅限于患病细胞，从而最大化治疗功效，同时最大程度地减少对正常的非癌细胞的附带损害。本公开克服了这些障碍，并提供了具有复制能力的病毒基因组，所述多核苷酸可以包封在例如脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或外泌体的非免疫原性颗粒中。在一些实施方案中，颗粒还包封编码有效负载分子的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供了具有复制能力的病毒基因组，以及用于治疗和预防增生性疾病和病症(例如癌症)的方法。本公开使得能够全身递送适于治疗广泛的增生性疾病(例如癌症)的安全有效的重组多核苷酸载体。

本文所使用的章节标题仅出于组织性目的并且不应被解释为限制所描述的主题。本文引用的所有文献或文献的一部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，出于任何目的明确地以引入的方式整体并入本文中。如果一个或多个所并入的文献或文献的一些部分定义的术语与本申请中该术语的定义相矛盾，则以本申请中出现的定义为准。然而，本文所引用的任何参考文献、文章、公布、专利、专利公布和专利申请的提及，并不也不应被视为承认或任何形式的建议，它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

定义

在本描述中，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围均应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。应当理解，除非另外指示，否则本文所用的术语“一(a/an)”是指所列举的组分中的“一种或多种”。替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所用，术语“包括”和“包含”同义使用。如本文所用，“多个”可以指一种或多种组分(例如一种或多种miRNA靶序列)。在本申请中，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。

如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等同物使用。本申请中使用的带或不带约/大约的任何数字旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，除非另有说明或从上下文中另外明显看出(除非该数字超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向上(大于或小于)落入所说明的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围。

“降低”或“减少”是指与参考值相比，特定值降低或减少至少5％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。特定值的降低或减少也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值相比降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多倍。

“增加”是指与参考值相比，特定值增加至少5％，例如5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。特定值的增加也可以表示为与参考值相比值的倍数变化，例如与参考值的水平相比增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更多倍。

术语“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列之间相同且处于相对位置处的碱基或氨基酸的百分比。因此，一个多核苷酸或多肽序列与另一多核苷酸或多肽序列相比具有一定百分比的序列同一性。为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，测试序列将与之进行比较。术语“参考序列”是指测试序列进行比较的分子。

“互补”是指在两个包含天然或非天然存在的(例如，如上所述修饰的)碱基(核苷酸)或其类似物的序列之间通过碱基堆积和特定氢键合而配对的能力。例如，如果核酸的一个位置处的碱基能够与靶标的相应位置处的碱基氢键合，则认为所述碱基在该位置处彼此互补。核酸可包含通用碱，或惰性无碱基间隔子，它们对氢键合不提供正的或负的贡献。碱基配对可以包括规范的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)和非沃森-克里克碱基配对(例如，摆动碱基配对(Wo bble base pairing)和胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing))。应当理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且例如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚之类的通用碱基可以与任何A、C、U或T杂交并认为是互补的。Nichols等人,Nature,1994；369:492-493和Lo akes等人,Nucleic Acids Res.,1994；22:4039-4043。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基，并且被认为与任何A、C、U或T互补。参见Watkins和SantaLucia,Nucl.Acids Research,2005；33(19):6258-6267。

“表达盒”或“表达构建体”是指可操作地连接于启动子的多核苷酸序列。“可操作地连接”是指一种并置关系，其中所描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响多核苷酸序列的转录或表达，则将其可操作地连接于多核苷酸序列。

术语“受试者”包括动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者是牲畜，例如牛、绵羊、山羊、母牛、猪等；或驯养的动物，例如狗和猫。在一些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，例如近交系猪等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

“施用”在本文中是指将剂或组合物引入受试者中。

如本文所用，“治疗”是指将剂或组合物递送至受试者以影响生理结果。在一些实施方案中，治疗是指治疗哺乳动物，例如人的疾病，包括(a)抑制疾病，即阻止疾病的发展或预防疾病的进展；(b)减轻疾病，即引起疾病状态的消退；以及(c)治愈疾病。

术语“有效量”是指剂或组合物引起特定生理作用所需的最小量(例如，增加、激活和/或增强特定的生理效果所需的量)。特定剂的有效量可以根据剂的性质以多种方式表示，例如质量/体积、细胞数目/体积、颗粒/体积、(剂的质量)/(受试者的质量)、细胞数目/(受试者的质量)或颗粒/(受试者的质量)。特定剂的有效量也可以表示为半最大有效浓度(EC₅₀)，其是指引起特定生理反应幅度介于参考水平与最大反应水平中间的剂的浓度。

细胞“群体”是指大于1的任意细胞数目，但优选至少1×10³个细胞、至少1×10⁴个细胞、至少1×10⁵个细胞、至少1×10⁶个细胞、至少1×10⁷个细胞、至少1×10⁸个细胞、至少1×10⁹个细胞、至少1×10¹⁰个细胞或更多个细胞。细胞群体可以指体外群体(例如，培养中的细胞群体)或体内群体(例如，存在于特定组织中的细胞群体)。

“效应子功能”是指与针对靶细胞或靶抗原的免疫应答的产生、维持和/或增强相关的免疫细胞功能。

术语“微小RNA”、“miRNA”和“miR”在本文中可互换使用，是指长度约21-25个核苷酸的小型非编码内源RNA，其可以通过指导其靶信使RNA(mRNA)进行降解或翻译抑制来调节基因表达。

如本文所用，术语“组合物”是指本文所述的重组RNA分子或颗粒包封的重组RNA分子，其能够被施用或递送至受试者或细胞。

短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理的医学判断范围内，适合与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品药物管理局(the United States Food and Drug Administration)批准为可用于人和/或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂和/或乳化剂。

术语“具有复制能力的病毒基因组”是指编码病毒复制和感染性病毒颗粒产生所必需的所有病毒基因的病毒基因组。

术语“溶瘤病毒”是指已被修饰成或天然地优先感染癌细胞的病毒。

术语“载体”在本文中用以指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子。

分子和细胞生物化学中的通用方法可以在标准教科书中找到，例如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等人编辑,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift和Loewy编辑,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编辑,AcademicPress 1997)；以及Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology(Doyle和Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文中。

合成RNA病毒基因组

在一些实施方案中，本公开提供了一种重组RNA分子，所述重组RNA分子编码溶瘤病毒(例如RNA基因组)。此类重组RNA分子在本文中称为“合成病毒基因组”或“合成RNA病毒基因组”。在这类实施方案中，合成RNA病毒基因组在通过非病毒性递送媒介物引入细胞中时能够产生感染性的溶解病毒，并且不需要额外的外源基因或蛋白质存在于细胞中即可复制并产生感染性病毒。而是，宿主细胞中的内源翻译机制介导病毒蛋白自合成RNA病毒基因组的表达。然后所表达的病毒蛋白介导病毒复制和装配成包含RNA病毒基因组的感染性病毒颗粒(可能包含衣壳蛋白、包膜蛋白和/或膜蛋白)。这样，本文所述的RNA多核苷酸(即，合成RNA病毒基因组)在引入细胞中时产生能够感染另一宿主细胞的病毒。参见图33中的示意图。

在一些实施方案中，合成病毒基因组作为重组核糖核酸(RNA)(即，合成RNA病毒基因组)提供。在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含一种或多种核酸类似物。核酸类似物的实例包括2'-O-甲基取代的RNA、2'-O-甲氧基-乙基碱基、2'氟碱基、锁核酸(LNA)、非锁核酸(UNA)、桥接核酸(BNA)、吗啉核酸和肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组是复制子、编码转基因的RNA病毒基因组、mRNA分子或环状RNA分子(circRNA)。在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含单链RNA(ssRNA)病毒基因组。在一些实施方案中，单链基因组可以是正义或负义基因组。

在一些实施方案中，重组RNA分子是环状RNA分子(circRNA)。circRNA分子缺乏外切核酸酶介导的降解所需的游离末端，从而延长了RNA分子的半衰期，并随着时间的推移实现更稳定的蛋白质产生(参见例如Wesselhoeft等人,Engineering circular RNA forpotent and stable translation in eukaryotic cells.Nature Communications.(2018)9:2629)。为了从circRNA分子产生功能性RNA病毒，有必要在细胞内“打破”环状构建体，以便可以产生具有适当3'和5'天然末端的线性RNA基因组。因此，在一些实施方案中，编码溶瘤病毒的重组RNA分子作为circRNA分子提供并且还包含促进细胞内circRNA分子线性化的一个或多个额外的RNA序列。这种额外的RNA序列的实例包括siRNA靶位点、miRNA靶位点和向导RNA靶位点。相应的siRNA、miRNA或gRNA可以与circRNA分子一起配制。或者，可以基于同源miRNA在靶细胞中的表达来选择miRNA靶位点，使得circRNA分子的裂解和编码的溶瘤病毒的初始表达限于表达特定miRNA的靶细胞。

本文所述的合成RNA病毒基因组编码溶瘤病毒。溶瘤病毒的实例是本领域已知的，包括但不限于小核糖核酸病毒(例如柯萨奇病毒)、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、水疱性口腔炎病毒、正粘病毒和马拉巴病毒(maraba virus)。

在一些实施方案中，由合成RNA病毒基因组编码的溶瘤病毒是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)中的任何病毒，例如柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒(包括嵌合脊髓灰质炎病毒，例如PVS-RIPO和其它嵌合小核糖核酸病毒)或塞内加谷病毒，或来自各种小核糖核酸病毒的嵌合来源的任何病毒；沙粒病毒科(Arenaviridae)中的任何病毒，例如拉沙病毒(lassa virus)；反转录病毒科(Retroviridae)中的任何病毒，例如鼠白血病病毒；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的任何病毒，例如甲型流感病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)，例如新城疫病毒(Newcastle disease virus)或麻疹病毒；呼肠孤病毒科(Reoviridae)中的任何病毒，例如哺乳动物的正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)；披膜病毒科(Togaviridae)中的任何病毒，例如辛德毕斯病毒(sindbis virus)；或弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的任何病毒，例如水疱性口腔炎病毒(VSV)或马拉巴病毒。

正义单链RNA病毒

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码单链RNA(ssRNA)病毒基因组。在一些实施方案中，ssRNA病毒为正义ssRNA(+义ssRNA)病毒。示例性+义ssRNA病毒包括小核糖核酸病毒科(例如柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和塞内加谷病毒(SVV)，包括SVV-A)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如α冠状病毒属(Alphacoronavirus)，例如HCoV-229E和HCoV-NL63；β冠状病毒属(Betacoronoavirus)，例如HCoV-HKU1、HCoV-OC3和MERS-CoV)、反转录病毒科(例如鼠白血病病毒)和披膜病毒科(例如辛德毕斯病毒)的成员。正义ssRNA病毒的其它示例性属和种示于下表1中。

表1：正义ssRNA病毒

在一些实施方案中，本文所述的重组RNA分子编码选自柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和塞内加谷病毒SVV)的小核糖核酸病毒。在一些实施方案中，本文所述的重组RNA分子编码柯萨奇病毒。在这个实施方案的一些方面，重组RNA分子编码柯萨奇病毒并且包含SEQ IDNO:26的5'UTR序列(参见例如Brown等人,Complete Genomic Sequencing Shows thatPolioviruses and Members of Human Enterovirus Species C Are Closely Relatedin the Noncapsid Coding Region.Journal of Virology,(2003)77:16,第8973-8984页.GenBank登录号AF546702)。在这种实施方案中，与其它先前描述的5'UTR序列相比，SEQ IDNO:26的5'UTR序列出乎意料地增加功能性柯萨奇病毒的产生(参见例如Newcombe等人,Cellular receptor interactions of C-cluster human group A coxsackievirusesJournal of General Virology(2003),84,3041–3050.GenBank登录号AF465515)。在这个实施方案的一些方面，重组RNA分子编码柯萨奇病毒并且包含SEQ ID NO:27的序列。

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码柯萨奇病毒。在一些实施方案中，柯萨奇病毒选自CVB3、CVA21和CVA9。GenBank参考号M33854.1(CVB3)、GenBank参考号KT161266.1(CVA21)和GenBank参考号D00627.1(CVA9)中提供了示例性柯萨奇病毒的核酸序列。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码包含SEQ ID NO:27的修饰的CVA21病毒。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码塞内加谷病毒(SVV)。在一些实施方案中，SVV选自野生型SVV(例如SVV-A，SEQ ID NO:1，GenBank参考号MF893200.1)或突变体SVV(例如SVV-177A-SEQ ID NO:2、SVV-IR2-SEQ ID NO:3或SVV-S177A-IR2-SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码嵌合小核糖核酸病毒(例如编码包含一个源自于第一小核糖核酸病毒的部分(例如衣壳蛋白或IRES)和另一个源自于第一小核糖核酸病毒的部分和另一个源自于第二小核糖核酸病毒的部分(非结构性基因，例如蛋白酶或聚合酶)的病毒)。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码嵌合SVV。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组编码嵌合柯萨奇病毒。

在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含微小RNA(miRNA)靶序列(miR-TS)盒，其中所述miR-TS盒包含一种或多种miRNA靶序列，并且其中细胞中一种或多种对应miRNA的表达抑制编码的溶瘤病毒在细胞中的复制。在一些实施方案中，一种或多种miRNA选自miR-124、miR-1、miR-143、miR-128、miR-219、miR-219a、miR-122、miR-204、miR-217、miR-137和miR-126。在一些实施方案中，miR-TS盒包含miR-124靶序列的一个或多个拷贝、miR-1靶序列的一个或多个拷贝和miR-143靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-219a靶序列的一个或多个拷贝和miR-122靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-204靶序列的一个或多个拷贝和miR-219靶序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，miR-TS盒包含miR-217靶序列的一个或多个拷贝、miR-137靶序列的一个或多个拷贝和miR-126靶序列的一个或多个拷贝。

在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含一个或多个miR-TS盒，所述miR-TS盒被并入一种或多种必需病毒基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中。在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含一个或多个miR-TS盒，所述miR-TS盒被并入一种或多种非必需基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中。在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含一个或多个miR-TS盒，所述miR-TS盒被并入一种或多种必需病毒基因的5'或3'。

在一些实施方案中，合成RNA病毒基因组包含编码有效负载分子的异源多核苷酸。在这种实施方案中，合成RNA病毒基因组驱动感染性溶瘤病毒的产生以及有效负载分子的表达。在这种实施方案中，有效负载分子的表达可以增加溶瘤病毒的治疗功效。在一些实施方案中，有效负载分子选自IL-12(例如编码IL-12的SVV基因组，例如SEQ ID NO:8)、GM-CSF(例如编码GMCSF的SVV基因组，例如SEQ ID NO:7)、CXCL10(例如编码CXCL10的SVV基因组，例如SEQ ID NO:10)、IL-36γ(例如编码IL-36γ的SVV基因组，例如SEQ ID NO:11)、CCL21(例如编码CCL21的SVV基因组)、IL-18(例如编码IL-18的SVV基因组)、IL-2(例如编码IL-2的SVV基因组)、CCL4(例如编码CCL4的SVV基因组)、CCL5(例如编码CCL5的SVV基因组)、抗CD3-抗FAP BiTE(例如编码抗CD3-抗FAP BiTE的SVV基因组，例如SEQ ID NO:9)、结合DLL3的抗原结合分子或结合EpCAM的抗原结合分子。参见实施例23和24。以下提供了适用于这些实施方案的有效负载分子类型的进一步描述。

产生重组RNA病毒基因组的方法

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组是使用一种或多种包含编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸的DNA载体模板在体外产生的。术语“载体”在本文中用以指能够转移、编码或转运另一核酸分子的核酸分子。所转移的核酸一般被插入载体核酸分子中。载体可以包括引导细胞中的自主复制的序列和/或可以包括足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。在一些实施方案中，本文所述的编码溶瘤病毒的重组RNA分子是使用一种或多种病毒载体产生的。

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组是通过在体外将编码重组RNA分子的多核苷酸引入(例如借助于转染、转导、电穿孔等)至合适的宿主细胞中产生的。合适的宿主细胞包括昆虫和哺乳动物细胞系。将宿主细胞培养适当量的时间以允许多核苷酸的表达和合成RNA病毒基因组的产生。然后从宿主细胞分离合成RNA病毒基因组并且配制用于治疗用途(例如包封在颗粒中)。图34中展示了用3'和5'核酶在体外合成RNA病毒基因组的示意图。相同示意图适用于使用接合裂解序列的其它组合合成RNA病毒基因组。

在一些实施方案中，包含本文所述的合成RNA病毒基因组的重组RNA分子需要病毒天然的离散5'和3'末端。由T7 RNA聚合酶在体外或由哺乳动物RNA Pol II产生的RNA转录物含有哺乳动物5'和3'UTR，不含产生感染性RNA病毒所需的离散的天然末端。举例来说，T7RNA聚合酶需要模板多核苷酸的5'末端上的鸟苷残基以起始转录。然而，SVV从其5'末端上的尿苷残基开始。因此，必须去除SVV转录物的体外转录所需要的T7前导序列，以产生功能性感染性SVV产生所需的天然5'SVV端。因此，在一些实施方案中，适用于产生本文所述的合成RNA病毒基因组的多核苷酸需要能够产生病毒天然的离散5'和3'末端的另外的非病毒性5'和3'序列。这种序列在本文中称为接合裂解序列(JCS)。在一些实施方案中，接合裂解序列用于使T7 RNA聚合酶或Pol II编码的RNA转录物在病毒RNA与哺乳动物mRNA序列的接合点处裂解，以便从转录物除去非病毒RNA多核苷酸，从而维持病毒的内源5'和3'离散末端(参见图35中所示的示意图)。在一些实施方案中，接合裂解序列用以在编码合成病毒基因组的DNA质粒线性化期间产生适当的末端(例如在质粒模板线性化时和在合成RNA基因组在体外转录之前使用3'限制酶识别序列产生适当的3'末端)。

可以通过多种方法实现接合裂解序列的性质和从病毒基因组转录物中去除非病毒RNA。例如，在一些实施方案中，接合裂解序列是RNA干扰(RNAi)分子的靶标。如本文所用，“RNA干扰分子”是指通过内源基因沉默途径(例如切丁酶和RNA诱导沉默复合物(RISC))介导靶mRNA序列的降解的RNA多核苷酸。示例性RNA干扰剂包括微小RNA(miRNA)、人工miRNA(amiRNA)、短发夹RNA(shRNA)和小干扰RNA(siRNA)。此外，当前在本领域已知或将来定义的用于在特定位点裂解RNA转录物的任何系统均可用于产生病毒天然的离散末端。

在一些实施方案中，RNAi分子是miRNA。miRNA是指天然存在的长度为约18-25个核苷酸的小的非编码RNA分子，其与靶mRNA序列至少部分互补。在动物中，miRNA的基因被转录成初级miRNA(pri-miRNA)，后者是双链的，并形成茎环结构。然后，在核中通过包含2类RNase III Drosha和微处理亚基DCGR8的微处理复合物将Pri-miRNA裂解，形成70-100个核苷酸的前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA形成发夹结构，并被转运至细胞质，在这里被RNase III酶Dicer加工成约18-25个核苷酸的miRNA双链体。尽管双链体的任一链都可能充当功能性miRNA，但通常会降解miRNA的一条链，仅将一条链加载到Argonaute(AGO)核酸酶上，以产生效应子RNA诱导沉默复合物(RISC)，其中miRNA和其mRNA靶标相互作用(Wahid等人,1803:11,2010,1231-1243)。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是miRNA靶序列。

在一些实施方案中，RNAi分子是源自Pol II转录物中嵌入的合成miRNA的人工miRNA(amiRNA)。(参见例如Liu等人,Nucleic Acids Res(2008)36:9；2811-2834；Zeng等人,Molecular Cell(2002),9；1327-1333；Fellman等人,Cell Reports(2013)5；1704-1713)。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是amiRNA靶序列。

在一些实施方案中，RNAi分子是siRNA分子。siRNA是指长度通常约为21-23个核苷酸的双链RNA分子。双链体siRNA分子在细胞质中进行加工，与称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物缔合，在此过程中，从双链体中酶切“乘客”有义链。然后，通过序列互补性，激活的RISC中所含的反义“向导”链将RISC导向相应的mRNA，而AGO核酸酶切割靶mRNA，从而导致特定的基因沉默。在一些实施方案中，siRNA分子源自shRNA分子。shRNA是长度为约50-70个核苷酸的单链人工RNA分子，其形成茎环结构。通过用质粒或病毒载体引入编码shRNA的DNA多核苷酸来实现shRNA在细胞中的表达。然后将shRNA转录成模仿pre-miRNA茎环结构的产物，并在核输出后，发夹经Dicer加工形成双链体siRNA分子，然后被RISC进一步加工以介导靶基因沉默。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是siRNA靶序列。

在一些实施方案中，接合裂解序列是向导RNA(gRNA)靶序列。在这样的实施方案中，可以设计gRNA并将其与具有RNase活性的Cas核酸内切酶(例如，Cas13)一起引入，以在精确的接合位点介导病毒基因组转录物的裂解。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是gRNA靶序列。

在一些实施方案中，接合裂解序列是pri-miRNA编码序列。在编码病毒基因组(即，重组RNA分子)的多核苷酸转录后，这些序列形成pri-miRNA茎环结构，然后在细胞核中被Drosha裂解，以在精确的接合位点裂解转录物。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是pri-mRNA靶序列。

在一些实施方案中，接合裂解序列是促进通过核糖核酸内切酶RNAseH进行裂解的引物结合序列。在这种实施方案中，与5'和/或3'接合裂解序列退火的引物连同RNAseH酶一起被加入至体外反应。RNAseH特异性地使与DNA杂交的RNA的磷酸二酯键水解，因此使得合成RNA基因组中间体在精确的接合裂解序列处裂解，从而产生所需的5'和3'天然末端。

在一些实施方案中，接合裂解序列是限制酶识别位点并且引起在质粒模板线性化对比用T7 RNA聚合酶合成RNA期间产生病毒转录产物的离散末端。在一些实施方案中，接合裂解序列是IIS型限制酶识别位点。IIS型限制酶包含一组特定酶，其识别不对称的DNA序列并在其识别序列外界定的距离处，通常在1至20个核苷酸内裂解。示例性IIS型限制酶包括AcuI、AlwI、BaeI、BbsI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBi、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BstI、CaspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MbolI、MlyI、MmeI、MnlL、NmeAIII、PleI、SapI和SfaNI。本领域中已知这些IIS型限制酶的识别序列。参见位于neb.com/tools-and-resources/selection-charts/type-iis-restriction-enzymes的New England Biolabs网址。在一些实施方案中，接合裂解序列是SapI限制酶识别位点。

在一些实施方案中，接合裂解序列是核酶编码序列，并介导合成RNA基因组中间物的自裂解以产生最终合成病毒RNA基因组所需的天然离散5'和3'末端，以及后续病毒性RNA病毒的产生。示例性核酶包括锤头状核酶(例如图23中所示的锤头状核酶)、Varkud卫星(VS)核酶、发夹状核酶、GIR1分支核酶、glmS核酶、绕线核酶(twister ribozyme)、绕线姐妹核酶(twister sister ribozyme)、手枪状核酶(例如图24中所示的手枪1和手枪2)、斧状核酶和肝炎病毒核酶。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是核酶编码序列。

在一些实施方案中，接合裂解序列是编码配体诱导的自裂解核酶的序列，称为“适体酶”。适体酶是含有对配体具有特异性的整合适体结构域的核酶序列。配体与适体结构域的结合触发了核酶的酶活性的激活，从而导致RNA转录物的裂解。示例性适体酶包括茶碱依赖性的适体酶(例如，与茶碱依赖性的适体连接的锤头状核酶，描述于Auslander等人,MolBioSyst.(2010)6,807-814)、四环素依赖性的适体酶(例如与Tet依赖性的适体连接的锤头状核酶，描述于Zhong等人,eLife 2016；5:e18858 DOI:10.7554/eLife.18858；Win和Smolke,PNAS(2007)104；14283-14288；Whittmann和Suess,Mol Biosyt(2011)7；2419-2427；Xiao等人,Chem&Biol(2008)15；125-1137；以及Beilstein等人,ACS Syn Biol(2015)4；526-534)、鸟嘌呤依赖性的适体酶(例如，与鸟嘌呤依赖性的适体连接的锤头状核酶，描述于Nomura等人,Chem Commun.,(2012)48(57)；7215-7217)。在一些实施方案中，5'和/或3'接合裂解序列是适体酶编码序列。

在一些实施方案中，接合裂解序列是RNAi分子(例如siRNA分子、shRNA分子、miRNA分子或amiRNA分子)、gRNA分子或RNAseH引物的靶序列。在这样的实施方案中，接合裂解序列与RNAi分子、gRNA分子或引物分子的序列至少部分互补。用于比较和确定序列同一性百分比和互补性百分比的序列比对方法是本领域众所周知的。可以通过例如以下来进行序列的最佳比对以进行比较：Needleman和Wunsch的同源性比对算法,(1970)J.Mol.Biol.48:443；通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)；手动比对和目视检查(参见例如Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)；使用本领域已知的算法，包括BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。可通过国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information)公开获得进行BLAST分析的软件。

在一些实施方案中，5'接合裂解序列和3'接合裂解序列来自同一组(例如，均为RNAi靶序列，均为核酶编码序列等)。例如，在一些实施方案中，接合裂解序列是RNAi靶序列(例如，siRNA、shRNA、amiRNA或miRNA靶序列)，并掺入编码病毒基因组(例如重组RNA分子)的多核苷酸的5'和3'末端。在这样的实施方案中，5'和3'RNAi靶序列可以相同(即，相同siRNA、amiRNA或miRNA的靶标)或不同(即，5'序列是一种siRNA、shmiRNA或miRNA的靶标，而3'序列是另一种siRNA、amiRNA或miRNA的靶标)。在一些实施方案中，接合裂解序列是向导RNA靶序列，并掺入编码病毒基因组(例如重组RNA分子)的多核苷酸的5'和3'末端。在这样的实施方案中，5'和3'gRNA靶序列可以相同(即，相同gRNA的靶标)或不同(即，5'序列是一种gRNA的靶标，而3'序列是另一种gRNA的靶标)。在一些实施方案中，接合裂解序列是pri-mRNA编码序列，并掺入编码病毒基因组(例如重组RNA分子)的多核苷酸的5'和3'末端。在一些实施方案中，接合裂解序列是核酶编码序列，并掺入编码病毒基因组(例如重组RNA分子)的多核苷酸的5'和3'末端临近处。

在一些实施方案中，5'接头裂解序列和3'接头裂解序列来自相同组，但是是不同的变体或类型。例如，在一些实施方案中，5'和3'接合裂解序列可以是RNAi分子的靶序列，其中5'接合裂解序列是siRNA靶序列，而3'接合裂解序列是miRNA靶序列(或反之亦然)。在一些实施方案中，5'和3'接合裂解序列可以是核酶编码序列，其中5'接合裂解序列是锤头状核酶编码序列，而3'接合裂解序列是肝炎δ病毒核酶编码序列。

在一些实施方案中，5'接合裂解序列和3'接合裂解序列是不同类型。举例来说，在一些实施方案中，5'接合裂解序列是RNAi靶序列(例如siRNA、amiRNA或miRNA靶序列)，而3'接合裂解序列是核酶序列、适体酶序列、pri-miRNA序列或gRNA靶序列。在一些实施方案中，5'接合裂解序列是核酶序列，而3'接合裂解序列是RNAi靶序列(例如siRNA、amiRNA或miRNA靶序列)、适体酶序列、pri-miRNA编码序列或gRNA靶序列。在一些实施方案中，5'接合裂解序列是适体酶序列，而3'接合裂解序列是RNAi靶序列(例如siRNA、amiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、pri-miRNA序列或gRNA靶序列。在一些实施方案中，5'接合裂解序列是pri-miRNA序列，而3'接合裂解序列是RNAi靶序列(例如siRNA、amiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、适体酶序列或gRNA靶序列。在一些实施方案中，5'接合裂解序列是gRNA靶序列，而3'接合裂解序列是RNAi靶序列(例如siRNA、amiRNA或miRNA靶序列)、核酶序列、pri-miRNA序列或适体酶序列。

接合裂解序列相对于编码合成病毒基因组的多核苷酸的示例性排列在下表A和B中示出。

表A：对称接合裂解序列(JSC)排列

表B：不对称JCS排列

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组通过体外RNA转录在体外产生(参见图35中的示意图)。然后纯化合成RNA病毒基因组并且配制用于治疗用途(例如包封至脂质纳米颗粒中)。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'核酶序列；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'核酶序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'肝炎δ病毒核酶序列。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码野生型SVV-A基因组的多核苷酸；以及(iv)3'肝炎δ病毒核酶序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:12至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQ ID NO:12或由其组成。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-S177A基因组的多核苷酸；以及(iv)3'肝炎δ病毒核酶序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQID NO:13或由其组成。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-IR2基因组的多核苷酸；以及(iv)3'肝炎δ病毒核酶序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-IR2-S77A基因组的多核苷酸；以及(iv)3'肝炎δ病毒核酶序列。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'核酶序列；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码野生型SVVA基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:18至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQ ID NO:18或由其组成。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-S177A基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-IR2基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'锤头状核酶序列(例如野生型HHR或修饰的HHR，例如图23中所提供)；(iii)编码SVVA-S177A-IR2基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'手枪状核酶序列(例如图24中所示的手枪1或手枪2核酶序列)；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'手枪1核酶序列；(iii)编码野生型SVV基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:14至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQ ID NO:14或由其组成。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)a 5'手枪2核酶序列；(iii)编码野生型SVV基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:15至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQ ID NO:15或由其组成。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'手枪1核酶序列；(iii)编码的多核苷酸SVV-S177A基因组；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'手枪1核酶序列；(iii)编码的多核苷酸SVV-IR2基因组；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:16至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQ ID NO:16或由其组成。在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'手枪1核酶序列；(iii)编码的多核苷酸SVV-IR2-S177A基因组；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含与SEQ ID NO:17至少95％、96％、97％、98％或99％同一的核酸序列。在一些实施方案中，DNA多核苷酸包含SEQID NO:17或由其组成。

在一些实施方案中，DNA多核苷酸从5'至3'包含：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'RNAseH引物结合位点；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'限制酶识别位点。在一些实施方案中，DNA载体包含从5'至3'包含以下的多核苷酸：(i)启动子序列(例如T7聚合酶启动子)；(ii)5'RNAseH引物结合位点；(iii)编码合成RNA病毒基因组的多核苷酸；以及(iv)3'SapI限制酶识别位点。

包含合成RNA基因组的颗粒

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA基因组被包封在“颗粒”中。如本文所用，颗粒是指物质的非组织来源的组合物，例如脂质体、脂质体复合物、纳米颗粒、纳米胶囊、微粒、微球体、脂质颗粒、外泌体、囊泡等。在某些实施方案中，颗粒是非蛋白质的和非免疫原性的。在这样的实施方案中，本文所述的合成RNA基因组的包封允许在不诱发全身性的抗病毒免疫应答下递送病毒基因组并且减轻中和抗病毒抗体的作用。此外，本文所述的合成RNA基因组的包封保护基因组避免降解，并促进其引入至靶宿主细胞中。在这样的实施方案中，本公开提供了一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包含本文所述的合成RNA基因组。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒还包含编码有效负载分子的第二RNA分子。

在一些实施方案中，颗粒在受试者中是生物可降解的。在这样的实施方案中，可以向受试者施用多剂颗粒，颗粒不会在受试者中累积。合适颗粒的实例包括聚苯乙烯颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA颗粒、基于多肽的阳离子聚合物颗粒、环糊精颗粒、壳聚糖颗粒、基于脂质的颗粒、聚(β-氨基酯)颗粒、低分子量聚乙烯亚胺颗粒、聚磷酸酯颗粒、二硫化物交联的聚合物颗粒、聚酰胺胺颗粒、聚乙烯亚胺(PEI)颗粒和PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒。

在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包封在无机颗粒中。在一些实施方案中，无机颗粒是金纳米颗粒(GNP)、金纳米棒(GNR)、磁性纳米颗粒(MNP)、磁性纳米管(MNT)、碳纳米角(CNH)、碳富勒烯、碳纳米管(CNT)、磷酸钙纳米颗粒(CPNP)、介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)、二氧化硅纳米管(SNT)或星形中空二氧化硅纳米颗粒(SHNP)。

优选地，本文所述的颗粒是纳米尺寸的，以提高溶解度，避免由体内聚集引起的可能的并发症并促进胞饮作用。在一些实施方案中，颗粒的平均直径约小于约1000nm。在一些实施方案中，颗粒的平均直径小于约500nm。在一些实施方案中，颗粒的平均直径介于约30nm与约100nm之间、介于约50nm与约100nm之间或介于约75nm与约100nm之间。在一些实施方案中，颗粒的平均直径介于约30nm与约75nm之间或约30nm与约50nm之间。在一些实施方案中，颗粒的平均直径介于约100nm与约500nm之间。在一些实施方案中，颗粒的平均直径介于约200nm与400nm之间。在一些实施方案中，颗粒的平均尺为约350nm。

外泌体

在一些实施方案中，本文所述的合成RNA基因组包封在外泌体中。外泌体是内吞起源的小膜囊泡，在多囊泡体与亲本细胞(例如，释放外泌体的细胞，在本文中也称为供体细胞)的质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体的表面包含源自亲本细胞的细胞膜的脂质双层，并且还可包含在亲本细胞表面表达的膜蛋白。在一些实施方案中，外泌体还可含有来自亲本细胞的胞液。外泌体由许多不同的细胞类型产生，包括上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)和树突状细胞(DC)，并已在血浆、尿液、支气管肺泡灌洗液、肠上皮细胞和肿瘤组织中鉴定出。由于外泌体的组成取决于其源自的亲本细胞类型，因此不存在“外泌体特异性”蛋白。但是，许多外泌体包含与亲本细胞中外泌体源自于的胞内囊泡相关的蛋白质(例如，与内体和溶酶体相关和/或由内体和溶酶体表达)。例如，外泌体可以富含抗原呈递分子，例如主要组织相容性复合物I和II(MHC-I和MHC-II)、四跨膜蛋白(例如CD63)、几种热休克蛋白、细胞骨架成分(例如肌动蛋白和微管蛋白)、参与细胞内膜融合的蛋白质、细胞间相互作用(例如CD54)、信号转导蛋白和胞浆酶。

外泌体可以通过外泌体膜与靶细胞的质膜融合来介导细胞蛋白从一个细胞(例如，亲本细胞)转移到靶细胞或受体细胞。这样，修饰被外泌体包封的物质提供了一种机制，通过该机制可以将外源性剂(例如本文所述的多核苷酸)引入靶细胞。已经被修饰成含有一种或多种外源剂的外泌体(例如，本文所述的多核苷酸)在本文中称为“修饰的外泌体”。在一些实施方案中，通过将外源剂(例如，本文所述的多核苷酸)引入亲本细胞中来产生修饰的外泌体。在这样的实施方案中，将外源核酸引入产生外泌体的亲本细胞中，从而将外源核酸本身或外源核酸的转录物掺入由亲本细胞产生的修饰的外泌体中。可以通过本领域已知的方法，例如转导、转染、转化和/或显微注射外源核酸，将外源核酸引入亲本细胞。

在一些实施方案中，通过直接将本文所述的合成RNA基因组引入外泌体中来产生修饰的外泌体。在一些实施方案中，本文所述的合成RNA基因组引入完整外泌体中。“完整外泌体”是指包含源自产生外泌体的亲本细胞的蛋白质和/或遗传物质的外泌体。获得完整外泌体的方法是本领域已知的(参见例如Alvarez-Erviti L.等人,Nat Biotechnol.2011年4月；29(4):34-5；Ohno S等人,Mol Ther 2013年1月；21(l):185-91；以及EP专利公布No.2010663)。

在特定实施方案中，将合成RNA基因组引入空外泌体中。“空外泌体”是指缺乏源自亲本细胞的蛋白质和/或遗传物质(例如DNA或RNA)的外泌体。产生空外泌体(例如，缺乏亲本细胞来源的遗传物质)的方法是本领域已知的，包括紫外线暴露、介导核酸负载到外泌体中的内源蛋白质的突变/缺失，以及对外泌体膜中的开孔进行电穿孔和化学处理，以使内源遗传物质通过开孔从外泌体中出来。在一些实施方案中，通过用pH为约9至约14的水溶液处理来打开外泌体以获得外泌体膜，除去囊泡内组分(例如，囊泡内蛋白质和/或核酸)，并重新装配外泌体膜以形成空外泌体，从而产生空外泌体。在一些实施方案中，囊泡内组分(例如，囊泡内蛋白质和/或核酸)通过超速离心或密度梯度超速离心来除去。在一些实施方案中，通过超声处理、机械振动、通过多孔膜的挤出、电流或这些技术中的一种或多种的组合来重新装配膜。在特定实施方案中，通过超声处理将膜重新装配。

在一些实施方案中，可以使用常规的分子生物学技术，如体外转化、转染和/或显微注射，实现完整或空外泌体负载本文所述的合成RNA基因组以产生修饰的外泌体。在一些实施方案中，外源剂(例如本文所述的多核苷酸)通过电穿孔直接引入至完整或空外泌体中。在一些实施方案中，外源剂(例如本文所述的多核苷酸)通过脂质体转染(例如转染)直接引入至完整或空外泌体中。适用于产生根据本公开的外泌体的脂质体转染试剂盒在本领域中是已知的并且是可商购(例如，来自Roche的HD转染试剂，和来自Invitrogen的LIPOFECTAMINE^TM 2000)。在一些实施方案中，外源剂(例如本文所述的多核苷酸)通过使用热休克进行转化直接引入至完整或空外泌体中。在这样的实施方案中，从亲本细胞分离的外泌体在二价阳离子如Ca²⁺(CaCl₂中)的存在下冷却以透化外泌体膜。然后可以将外泌体与外源核酸一起孵育并短暂加热休克(例如，在42℃孵育30-120秒)。在特定实施方案中，通过在除去囊泡内组分后将剂与外泌体膜混合或共孵育，可以实现空外泌体负载外源剂(例如本文所述的多核苷酸)。从外泌体膜重新装配的修饰的外泌体将因此将外源剂掺入囊泡内空间。产生外泌体包封的核酸的其它方法是本领域已知的(参见例如美国专利号9,889,210；9,629,929；以及9,085,778；国际PCT公布No.WO 2017/161010和WO 2018/039119)。

可以从许多不同的亲本细胞，包括细胞系、骨髓来源的细胞和源自初代患者样品的细胞中获得外泌体。可以通过本领域已知的方法从亲本细胞培养物的上清液中分离出从亲本细胞释放的外泌体。例如，外泌体的物理性质可用于将它们与介质或其它原材料分离，包括基于电荷(例如电泳分离)、尺寸(例如过滤、分子筛等)、密度(例如常规或梯度离心)和斯韦德贝里常数(Svedberg constant)(例如，在有或没有外力作用下的沉降等)分离。替代地或另外地，分离可以基于一种或多种生物学特性，并且包括可以采用表面标记的方法(例如，用于沉淀、与固相的可逆结合、FACS分离、特异性配体结合、非特异性配体结合等)。外泌体表面蛋白的分析可以通过流式细胞术，使用针对外泌体相关蛋白(例如CD63)的荧光标记的抗体来确定。用于表征外泌体的其它标记在国际PCT公布No.WO 2017/161010中进行了描述。在进一步预期的方法中，外泌体也可以使用化学方法和/或物理方法融合，包括PEG诱导的融合和/或超声融合。

在一些实施方案中，可以使用尺寸排阻色谱法分离外泌体。在一些实施方案中，如本领域通常已知的，外泌体可以在色谱法分离之后，通过离心技术分离(一种或多种色谱分离级分)进一步分离。在一些实施方案中，外泌体的分离可涉及方法的组合，所述方法包括但不限于如先前所述的差速离心(参见Raposo,G.等人,J.Exp.Med.183,1161-1172(1996))、超速离心、基于尺寸的膜过滤、浓缩和/或速率区带离心。

在一些实施方案中，外泌体膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、固醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸中的一种或多种。另外，膜可包含一种或多种多肽和一种或多种多糖，例如聚糖。示例性的外泌体膜组合物和用于改变一种或多种膜组分的相对量的方法描述于国际PCT公布No.WO 2018/039119。

在一些实施方案中，颗粒是外泌体并且具有介于约30nm与约100nm之间、介于约30nm与约200nm之间或介于约30nm与约500nm之间的直径。在一些实施方案中，颗粒是外泌体并且具有介于约10nm与约100nm之间、介于约20nm与约100nm之间、介于约30nm与约100nm之间、介于约40nm与约100nm之间、介于约50nm与约100nm之间、介于约60nm与约100nm之间、介于约70nm与约100nm之间、介于约80nm与约100nm之间、介于约90nm与约100nm之间、介于约100nm与约200nm之间、介于约100nm与约150nm之间、介于约150nm与约200nm之间、介于约100nm与约250nm之间、介于约250nm与约500nm之间或介于约10nm与约1000nm之间的直径。在一些实施方案中，颗粒是外泌体并且具有介于约20nm与300nm之间、介于约40nm与200nm之间、介于约20nm与250nm之间、介于约30nm与150nm之间或介于约30nm与100nm之间的直径。

脂质纳米颗粒

在某些实施方案中，本文所述的合成RNA病毒基因组包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。在某些实施方案中，LNP包含一种或多种脂质，例如甘油三酯(例如三硬脂酸甘油酯)、甘油二酯(例如山嵛酸甘油酯)、甘油单酯(例如单硬脂酸甘油酯)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡(例如棕榈酸十六烷酯)。在一些实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质。在一些实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子型脂质、胆固醇和一种或多种中性脂质。

阳离子型脂质是指在选定的pH值(例如生理pH值)下带有净正电荷的多种脂质中的任何一种。这类脂质包括但不限于1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、二-十八烷基二甲基铵(DODMA)、二硬脂基二甲基铵(DSDMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。例如，在低于生理pH值的条件下具有正电荷的阳离子型脂质包括但不限于DODAP、DODMA和DMDMA。在一些实施方案中，阳离子型脂质包含C₁₈烷基链、头基与烷基链之间的醚键以及0至3个双键。这样的脂质包括例如DSDMA、DLinDMA、DLenDMA和DODMA。阳离子型脂质可以包含醚键和pH可滴定的头基。这样的脂质包括例如DODMA。另外的阳离子型脂质描述于以引用的方式并入本文中的美国专利No.7,745,651、5,208,036、5,264,618、5,279,833、5,283,185、5,753,613和5,785,992中。

在一些实施方案中，阳离子型脂质包含可质子化的叔胺头基。这样的脂质在本文中称为可电离的脂质。可电离的脂质是指包含可电离的胺头基且典型地包含小于约7的pKa的脂质种类。因此，在酸性pH的环境中，可电离的胺头基被质子化，使得可电离的脂质优先与带负电荷的分子(例如核酸，例如本文所述的重组多核苷酸)相互作用，从而促进纳米颗粒的装配和包封。因此，在一些实施方案中，可电离的脂质可以增加核酸在脂质纳米颗粒中的负载。在pH值大于约7(例如约7.4的生理pH值)的环境中，可电离的脂质包含中性电荷。当包含可离子的脂质的颗粒被吸收到内体的低pH环境(例如pH<7)时，可电离的脂质再次质子化并与阴离子内体膜缔合，从而促进了被颗粒包封的内容物的释放。在一些实施方案中，LNP包含可电离的脂质，例如7.SS可裂解的和pH响应性脂质样物质(例如SS系列)。适用于本公开内容的制剂和方法的阳离子型或可电离的脂质的另外的实例描述于例如WO2018089540A1、WO2017049245A2、US20150174261、US2014308304、US2015376115、WO201/199952和WO2016/176330中。

在一些实施方案中，阳离子型脂质是选自阳离子型脂质选自DLinDMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA(MC3)、SS-LC(原名：SS-18/4PE-13)、SS-EC(原名：SS-33/4PE-15)、SS-OC、SS-OP、9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L-319)或N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)的可电离的脂质。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是DLin-MC3-DMA(MC3)。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是SS-LC。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是SS-EC。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是SS-OC。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是SS-OP。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是L-319。在一些实施方案中，阳离子型可电离的脂质是DOTAP。

在一些实施方案中，LNP包含一种或多种非阳离子型辅助脂质(中性脂质)。示例性的中性辅助脂质包括(1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)(DLPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DiPPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(l'-rac-甘油)(DOPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、神经酰胺、鞘磷脂和胆固醇。在一些实施方案中，一种或多种辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；和胆固醇。在一些实施方案中，LNP包含DSPC。在一些实施方案中，LNP包含DOPC。在一些实施方案中，LNP包含DLPE。在一些实施方案中，LNP包含DOPE。

还考虑本文所述的脂质体和药物组合物中聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生的脂质，例如衍生的神经酰胺(PEG-CER)的使用和包括，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺)，优选与本文公开的一种或多种化合物和脂质组合。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还可包含一种或多种PEG修饰的脂质，所述脂质包含共价连接至包含一个或多个C6-C20烷基的脂质的长度高达5kDa的聚(乙)二醇链。在一些实施方案中，LNP还包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-胺)。在一些实施方案中，LNP还包含选自以下的PEG修饰的脂质：1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG5K)；1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(DPG-PEG2K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DSG-PEG5K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DSG-PEG2K)；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DMG-PEG5K)；和1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DMG-PEG2K)。在一些实施方案中，LNP还包含DSPE-PEG5K。在一些实施方案中，LNP还包含DPG-PEG2K。在一些实施方案中，LNP还包含DSG-PEG2K。在一些实施方案中，LNP还包含DMG-PEG2K。在一些实施方案中，LNP还包含DSG-PEG5K。在一些实施方案中，LNP还包含DMG-PEG5K。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质含量的约0.1％至约1％。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质含量的约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％或约3.0％。

在一些实施方案中，脂质用可裂解的PEG脂质修饰。具有可裂解键的PEG衍生物的实例包括用肽键修饰的那些(Kulkarni等人(2014).Mmp-9responsive PEG cleavablenanovesicles for efficient delivery of chemotherapeutics to pancreaticcancer.Mol Pharmaceutics11:2390-9；Lin等人(2015).Drug/dye-loaded,multifunctional peg-chitosan-iron oxide nanocomposites for methotraxatesynergistically self-targeted cancer therapy and dual model imaging.ACS ApplMater Interfaces 7:11908-20.)、二硫键(Yan等人(2014).A method to accelerate thegelation of disulfide-crosslinked hydrogels.Chin J Polym Sci33:118–27；Wu和Yan(2015).Copper nanopowder catalyzed cross-coupling of diaryl disulfides witharyl iodides in PEG-400.Synlett26:537-42)、乙烯醚键、腙键(Kelly等人(2016).Polymeric prodrug combination to exploit the therapeutic potential ofantimicrobial peptides against cancer cells.Org Biomol Chem 14:9278-86.)以及酯键(Xu等人(2008).Esterase-catalyzed dePEGylation of pH-sensitive vesiclesmodified with cleavable PEG-lipid derivatives.J Control Release130:238-45)。亦参见Fang等人,(2017)Cleaveable PEGylation:a strategy for overcoming the“PEGdilemma”in efficient drug delivery.Drug Delivery 24:2,22-32。

在一些实施方案中，PEG脂质是活化PEG脂质。示例性活化PEG脂质包括PEG-NH2、PEG-MAL、PEG-NHS和PEG-ALD。这种官能化PEG脂质可用于将靶向部分缀合至脂质纳米颗粒以将颗粒引导至特定的靶细胞或组织(例如通过连接抗原结合分子、肽、聚糖等)。

在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是DOTAP。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是DLin-MC3-DMA(MC3)。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是SS-EC。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是SS-LC。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是SS-OC。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是SS-OP。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中阳离子型脂质是L-319。

在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中一种或多种辅助脂质包含胆固醇。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中一种或多种辅助脂质包含DLPE。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中一种或多种辅助脂质包含DSPC。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中一种或多种辅助脂质包含DOPE。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和一种或多种辅助脂质，其中一种或多种辅助脂质包含DOPC。

在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和至少两种辅助脂质，其中阳离子型脂质是DOTAP，并且至少两种辅助脂质包括胆固醇和DLPE。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和至少两种辅助脂质，其中阳离子型脂质是MC3，并且至少两种辅助脂质包含胆固醇和DSPC。在一些实施方案中，至少两种辅助脂质包括胆固醇和DOPE。在一些实施方案中，至少两种辅助脂质包含胆固醇和DSPC。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和至少三种辅助脂质，其中阳离子型脂质是DOTAP，并且至少三种辅助脂质包含胆固醇、DLPE和DSPE。在一些实施方案中，LNP包含阳离子型脂质和至少三种辅助脂质，其中阳离子型脂质是MC3，并且至少三种辅助脂质包含胆固醇、DSPC和DMG。在一些实施方案中，至少三种辅助脂质包含胆固醇、DOPE和DSPE。在一些实施方案中，至少三种辅助脂质包含胆固醇、DSPC和DMG。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇和DLPE。在一些实施方案中，LNP包含MC3、胆固醇和DSPC。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇和DOPE。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇、DLPE和DSPE。在一些实施方案中，LNP包含MC3、胆固醇、DSPC和DMG。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇、DLPE和DSPE-PEG。在一些实施方案中，LNP包含MC3、胆固醇、DSPC和DMG-PEG。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇、DOPE和DSPE。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇、DOPE和DSPE-PEG。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇和DPG-PEG(例如DPG-PEG2K)。

在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇(Chol)和DLPE，其中DOTAP:Chol:DLPE的比率(占总脂质含量的百分比)约为50:35:15。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇(Chol)和DLPE，其中DOTAP:Chol:DOPE的比率(占总脂质含量的百分比)约为50:35:15。在一些实施方案中，LNP包含DOTAP、胆固醇(Chol)、DLPE、DSPE-PEG，其中DOTP:Chol:DLPE的比率(占总脂质含量的百分比)约为50:35:15并且其中颗粒包含约0.2％DSPE-PEG。在一些实施方案中，LNP包含MC3、胆固醇(Chol)、DSPC和DMG-PEG，其中MC3:Chol:DSPC:DMG-PEG的比率(占总脂质含量的百分比)约为49:38.5:11:1.5。

在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K)，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-25％，C＝20％-30％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝20％-25％，C＝25％-30％，和D＝0％-1％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。

在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝25％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-55％，B＝10％-20％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝10％-15％，C＝35％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约49:11:38.5:1.5。

在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-65％，B＝5％-20％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝50％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-10％，C＝30％-35％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。在一些实施方案中，LNP包含SS-OC、DSPC、胆固醇(Chol)和DPG-PEG2K，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约58:7:33.5:1.5。

在一些实施方案中，纳米颗粒用糖胺聚糖(GAG)包被，以调节或促进靶细胞对纳米颗粒的吸收(图2)。GAG可以是肝素/硫酸肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、硫酸角蛋白或透明质酸(HA)。在一个特定的实施方案中，纳米颗粒的表面用HA包被并且靶向该等颗粒以供肿瘤细胞吸收。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒被精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD肽)包被(参见Ruoslahti,Advanced Materials,24,2012,3747-3756；及Bellis等人,Biomaterials,32(18),2011,4205-4210)。

在一些实施方案中，LNP的平均尺寸为约50nm至约500nm。举例来说，在一些实施方案中，LNP的平均尺寸为约50nm至约200nm、约100nm至约200nm、约150nm至约200nm、约50nm至约150nm、约100nm至约150nm、约150nm至约500nm、约200nm至约500nm、约300nm至约500nm、约350nm至约500nm、约400nm至约500nm、约425nm至约500nm、约450nm至约500nm或约475nm至约500nm。在一些实施方案中，多个LNP的平均尺寸为约50nm至约120nm。在一些实施方案中，多个LNP的平均尺寸为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或约120nm。在一些实施方案中，多个LNP的平均尺寸为约100nm。

在一些实施方案中，LNP具有中性电荷(例如平均ζ-电位介于约0mV与1mV之间)。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约40mV与约-40mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约40mV与约0mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约35mV与约0mV、约30mV与约0mV、约25mV至约0mV、约20mV至约0mV、约15mV至约0mV、约10mV至约0mV或约5mV至约0mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约20mV与约-40mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约20mV与约-20mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约10mV与约-20mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位介于约10mV与约-10mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ-电位为约10mV、约9mV、约8mV、约7mV、约6mV、约5mV、约4mV、约3mV、约2mV、约1mV、约0mV、约-1mV、约-2mV、约-3mV、约-4mV、约-5mV、约-6mV、约-7mV、约-8mV、约-9mV、约-9mV或约-10mV。

在一些实施方案中，LNP的平均ζ电位介于约0mV与-20mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ电位小于约-20mV。举例来说，在一些实施方案中，LNP的平均ζ电位少于约少于约-30mV、少于约35mV或少于约-40mV。在一些实施方案中，LNP的平均ζ电位介于约-50mV至约-20mV、约-40mV至约-20mV或约-30mV至约-20mV之间。在一些实施方案中，LNP的平均ζ电位为约0mV、约-1mV、约-2mV、约-3mV、约-4mV、约-5mV、约-6mV、约-7mV、约-8mV、约-9mV、约-10mV、约-11mV、约-12mV、约-13mV、约-14mV、约-15mV、约-16mV、约-17mV、约-18mV、约-19mV、约-20mV、约-21mV、约-22mV、约-23mV、约-24mV、约-25mV、约-26mV、约-27mV、约-28mV、约-29mV、约-30mV、约-31mV、约-32mV、约-33mV、约-34mV、约-35mV、约-36mV、约-37mV、约-38mV、约-39mV或约-40mV。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子，并且脂质(L)与核酸(N)的比率为约3:1(L:N)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子并且包含约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1的L:N比率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子并且包含约7:1的L:N比率。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子并且包含约4.5:1、约4.6:1、约4.7:1、约4.8:1、约4.9:1、约5:1、约5.1:1、约5.2:1、约5.3:1、约5.4:1或约5.5:1的L:N比率。.在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本文所述的重组核酸分子并且包含约6.5:1、6.6:1、6.7:1、6.8:1、6.9:1、7:1、7.1:1、7.2:1、7.3:1、7.4:1和7.5:1的L:N比率。

在一些实施方案中，LNP包含选自表5中列出的制剂之一的脂质制剂。

在一些实施方案中，LNP包含编码溶瘤病毒的合成RNA病毒基因组，其中所编码的溶瘤病毒能够减小远离LNP施用至受试者的部位的肿瘤的尺寸。举例来说，如本文提供的实施例中所证明，本文所述的LNP的静脉内施用引起肿瘤组织中的病毒复制和肿瘤尺寸的减小。这些数据表明本公开的LNP能够定位至远离LNP施用部位的肿瘤或癌组织。这种作用使得本文所述的LNP包封的溶瘤病毒能够用于治疗不容易接近，因此不宜肿瘤内递送治疗的肿瘤。

有效负载分子

在一些实施方案中，颗粒包含合成RNA病毒基因组并且还包含编码有效负载分子的重组RNA多核苷酸。在一些实施方案中，颗粒是脂质纳米颗粒并且包含合成RNA病毒基因组并且还包含编码有效负载分子的重组RNA多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种miRNA靶序列掺入编码有效负载分子的RNA多核苷酸的3'或5'UTR中。在一些实施方案中，一种或多种miRNA靶序列插入编码有效负载分子的多核苷酸中。在这样的实施方案中，有效负载的翻译和随后的表达在表达相应miRNA的细胞中不发生或基本上不减少。在一些实施方案中，编码有效负载分子的重组RNA多核苷酸是复制子。

在一些实施方案中，有效负载是细胞毒性肽。如本文所用，“细胞毒性肽”是指当在宿主细胞中表达时能够诱导细胞死亡，和/或当宿主细胞分泌时，能够诱导邻近细胞的细胞死亡的蛋白质。在一些实施方案中，细胞毒性肽是胱天蛋白酶、p53、白喉毒素(DT)、假单胞菌外毒素A(PEA)、I型核酶失活蛋白(RIP)(例如肥皂草素(saporin)和白树毒素(gelonin))、II型RIP(例如蓖麻毒素)、志贺样毒素1(Slt1)、光敏活性氧(例如杀手红)。在某些实施方案中，细胞毒性肽由通过细胞凋亡引起细胞死亡的自杀基因，例如胱天蛋白酶基因编码。

在一些实施方案中，有效负载是免疫调节肽。如本文所用，“免疫调节肽”是能够调节(例如，激活或抑制)特定免疫受体和/或通路的肽。在一些实施方案中，免疫调节肽可作用于任何哺乳动物细胞，包括免疫细胞、组织细胞和基质细胞。在一个优选的实施方案中，免疫调节肽作用于免疫细胞，例如T细胞、NK细胞、NKT T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞或嗜酸性粒细胞。示例性免疫调节肽包括抗原结合分子如抗体或其抗原结合片段、细胞因子、趋化因子、可溶性受体、细胞表面受体配体、二分肽和酶。

在一些实施方案中，有效负载是细胞因子，例如IL-1、IL-12、IL-15、IL-18、IL-36γ、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ或TNFSF14。在一些实施方案中，有效负载是趋化因子，如CXCL10、CXCL9、CCL21、CCL4或CCL5。在一些实施方案中，有效负载是细胞表面受体的配体，例如NKG2D配体、神经纤毛蛋白配体、Flt3配体、CD47配体(例如SIRP1α)。在一些实施方案中，有效负载是可溶性受体，例如可溶性细胞因子受体(例如IL-13R、TGFβR1、TGFβR2、IL-35R、IL-15R、IL-2R、IL-12R和干扰素受体)或可溶性先天免疫受体(例如Toll样受体、补体受体等)。在一些实施方案中，有效负载是参与细胞内RNA和/或DNA感应的蛋白质的显性激动剂突变体(例如STING、RIG-1或MDA-5的显性激动剂突变体)。

在一些实施方案中，有效负载是抗原结合分子，例如抗体或其抗原结合片段(例如单链可变片段(scFv)、F(ab)等)。在一些实施方案中，抗原结合分子特异性结合细胞表面受体，例如免疫检查点受体(例如PD-1、PD-L1和CTLA4)或参与细胞生长和活化的其它细胞表面受体(例如OX40、CD200R、CD47、CSF1R、41BB、CD40和NKG2D)。

在一些实施方案中，有效负载分子是蝎多肽，例如氯毒素(chlorotoxin)、BmKn-2、新普拉丁(neopladine)1、新普拉丁2和莫瑞泊林(mauriporin)。在一些实施方案中，有效负载分子是蛇多肽，例如蛇毒解聚素(contortrostatin)、载脂蛋白-I(apoxin-I)、矛头蝮蛇毒素(bothropstoxin)-I、BJcuL、OHAP-1、蛇毒蛋白(rhodostomin)、drCT-1、CTX-III、B1L和ACTX-6。在一些实施方案中，有效负载分子是蜘蛛多肽，例如拉塔蛋白(latarcin)和透明质酸酶。在一些实施方案中，有效负载分子是蜜蜂多肽，例如蜂毒素(melittin)和蜂毒明肽(apamin)。在一些实施方案中，有效负载分子是蛙多肽，例如PsT-1、PdT-1和PdT-2。

在一些实施方案中，有效负载分子是酶。在一些实施方案中，酶能够通过改变细胞外基质来调节肿瘤微环境。在这样的实施方案中，酶可以包括但不限于基质金属蛋白酶(例如MMP9)、胶原酶、透明质酸酶、明胶酶或弹性蛋白酶。在一些实施方案中，酶是基因导向性酶前药疗法(GDEPT)系统的一部分，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧肽酶G2、嘌呤核苷磷酸化酶或细胞色素P450。在一些实施方案中，酶能够诱导或激活靶细胞(例如，胱天蛋白酶)中的细胞死亡通路。在一些实施方案中，酶能够降解细胞外代谢物或信息(例如精氨酸酶或15-羟前列腺素脱氢酶)。

在一些实施方案中，有效负载分子是二分肽。如本文所用，“二分肽”是指由能够结合在非癌性效应细胞上表达的细胞表面抗原的第一结构域和能够结合由靶细胞(例如癌细胞、肿瘤细胞或不同类型的效应细胞)表达的细胞表面抗原的第二结构域构成的多聚体蛋白。在一些实施方案中，二分多肽的单个多肽结构域可包含抗体或其结合片段(例如单链可变片段(scFv)或的F(ab))、纳米抗体、双功能抗体、柔性抗体、DOCK-AND-LOCK^TM抗体或单克隆抗独特型抗体(mAb2)。在一些实施方案中，二分多肽的结构可以是双重可变结构域抗体(DVD-Ig^TM)、双特异性T细胞衔接蛋白(BiTE^TM)、或双重亲和力重靶向(DART)多肽。在一些实施方案中，二分多肽是BiTE，并且包含特异性结合于表3和/或4中所示的抗原的结构域。下表2中示出示例性BiTE。

表2：临床前和临床研究中使用的经过验证的BiTE

在一些实施方案中，在效应细胞上表达的细胞表面抗原选自下表3。在一些实施方案中，在肿瘤细胞或效应细胞上表达的细胞表面抗原选自下表4。在一些实施方案中，在肿瘤细胞上表达的细胞表面抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自CD19、EpCAM、CEA、PSMA、CD33、EGFR、Her2、EphA2、MCSP、ADAM17、PSCA、17-A1、NKGD2配体、CSF1R、FAP、GD2、DLL3或神经纤毛蛋白(neuropilin)。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自表4中列出的那些。

表3：示例性效应细胞靶抗原

表4：示例性靶细胞抗原

治疗性组合物和使用方法

本公开的一个方面涉及包含本文所述的重组RNA的治疗性组合物或包含本文所述的重组RNA的颗粒，以及治疗癌症的方法。可以以适合所需递送途径的任何方式配制本文所述的组合物。通常，制剂包括所有生理上可接受的组合物，包括其衍生物或前药、溶剂化物、立体异构体、外消旋体或互变异构体，以及任何药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

如本文所用，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品药物管理局批准为可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动植物脂肪、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的任何其它相容物质。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基一起形成)，并用无机酸形成，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；并且用有机酸形成，例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基磺酸、乙-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡萄糖庚酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下胺的盐：伯胺、仲胺和叔胺；取代胺，包括天然存在的取代胺；环胺和碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿诺(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本公开提供了杀死癌细胞或靶细胞的方法，该方法包括在足以将组合物经细胞内递送至癌细胞的条件下，将细胞暴露于本文所述的RNA多核苷酸或颗粒或其组合物。如本文所用，“癌细胞”或“靶细胞”是指被选择用本文所述的多核苷酸或颗粒或本文所述的组合物治疗或施用的哺乳动物细胞。如本文所用，“杀死癌细胞”具体是指通过细胞凋亡或坏死引起的癌细胞死亡。癌细胞的杀死可以通过本领域已知的方法来确定，所述方法包括但不限于肿瘤尺寸测量、细胞计数和流式细胞术，以检测细胞死亡标志物如膜联蛋白V和掺入碘化丙啶。

本公开还提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其中将有效量的本文所述的治疗性组合物施用于该受试者。施用途径自然会随所治疗疾病的位置和性质而变化，并且可以包括例如皮内、透皮、皮下、肠胃外、经鼻、静脉内、肌内、鼻内、皮下、经皮、经气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注、灌洗、直接注射和口服。包封的本文所述的多核苷酸组合物特别适用于治疗转移癌，其中可能需要全身性施用以递送组合物至多个器官和/或细胞类型。因此，在特定的实施方案中，本文所述的组合物是全身施用的。

本文可互换使用的“有效量”或“有效剂量”是指本文所述的组合物改善或补救疾病或病症的症状的量和/或剂量。改善是疾病或病症或者疾病或病症的症状的任何改善或补救。所述改善是可观察到的或可测量的改善，或者可以是受试者的总体幸福感的改善。因此，本领域技术人员意识到治疗可以改善疾病状况，但是可能不能完全治愈该疾病。受试者的改善可能包括但不限于减少肿瘤负担、减少肿瘤细胞增殖、增加肿瘤细胞死亡、激活免疫通路、增加肿瘤进展时间、减少癌症疼痛、增加生存率或改善生活质量。

在一些实施方案中，可以通过施用单剂量本文所述的组合物来实现有效剂量的施用。如本文所用，“剂量”是指一次递送的组合物的量。在一些实施方案中，重组RNA分子的剂量作为50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)来测量。在一些实施方案中，TCID₅₀为至少约10³-10⁹TCID₅₀/mL，例如至少约10³TCID₅₀/mL、约10⁴TCID₅₀/mL、约10⁵TCID₅₀/mL、约10⁶TCID₅₀/mL、约10⁷TCID₅₀/mL、约10⁸TCID₅₀/mL或约10⁹TCID₅₀/mL。在一些实施方案中，可以通过给定体积中的颗粒数目(例如，颗粒/毫升)来测量剂量。在一些实施方案中，可以通过每个颗粒中存在的本文所述的RNA多核苷酸的基因组拷贝数进一步细化剂量(例如，颗粒数目/毫升，其中每个颗粒包含多核苷酸的至少一个基因组拷贝)。在一些实施方案中，有效剂量的递送可能需要施用多剂本文所述的组合物。这样，有效剂量的施用可能需要施用至少2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂、10剂、20剂、30剂、40剂、50剂或更多剂的本文所述的组合物。

在施用多剂本文所述的组合物的实施方案中，每剂无需由相同的参与者施用和/或在相同的地理位置施用。此外，可以根据预定时间表来给药。例如，预定的给药方案可以包含每天、每隔一天、每周、每两周、每月、每两个月、每年、每半年一次等施用本文所述的组合物的剂量。可以根据给定患者的需要调整预定的给药方案(例如，可以增加或减少组合物的施用量)和/或可以增加或减少剂量的频率，和/或可以增加或减少总施用剂量次数)。

如本文所用，“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”是指完全预防疾病症状、延迟疾病症状发作或减轻随后发展的疾病症状的严重性。

本文所用的术语“受试者”或“患者”是指根据本文所述的方法施用本文所述的组合物的任何哺乳动物受试者。在一个具体的实施方案中，本公开的方法用于治疗人类受试者。本公开的方法还可用于治疗非人灵长类动物(例如猴子、狒狒和黑猩猩)、小鼠、大鼠、牛、马、猫、狗、猪、兔子、山羊、鹿、绵羊、雪貂、沙鼠、豚鼠、仓鼠、蝙蝠、鸟类(例如鸡、火鸡和鸭)、鱼类和爬行动物。

本文中的“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受调控为特征的生理疾患。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤、成骨肉瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、平滑肌肉肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜上皮肉瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤和软骨肉瘤)、神经内分泌瘤、间皮瘤、滑膜瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴样恶性病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌、小细胞肺癌瘤；腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯瘤(Wilms’tumor)、睾丸肿瘤、肺癌瘤、膀胱癌瘤、上皮癌瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、骨髓增生异常疾病、重链病、神经内分泌肿瘤、神经鞘瘤和其它癌以及头颈癌。在一些实施方案中，癌症是神经内分泌癌症。此外，良性(即非癌性)过度增生性疾病、病症和疾患，包括良性前列腺肥大(BPH)、脑膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维瘤病、瘢痕、肌瘤和子宫肌瘤等也可以使用本文公开的公开内容进行治疗。

其它编号实施方案

本发明的其它编号实施方案如下：

实施方案1：一种脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包含编码溶瘤病毒的合成RNA病毒基因组。

实施方案2：实施方案1的LNP，其中所述溶瘤病毒是单链RNA(ssRNA)病毒。

实施方案3：实施方案1的LNP，其中所述溶瘤病毒是正义((+)-义)ssRNA病毒。

实施方案4：实施方案3的LNP，其中所述(+)-义ssRNA病毒是小核糖核酸病毒。

实施方案5：实施方案4的LNP，其中所述小核糖核酸病毒是塞内加谷病毒(SVV)或柯萨奇病毒。

实施方案6：实施方案5的LNP，其中所述SVV是选自野生型SVV-A(SEQ ID NO:1)、S177A-SVVA突变体(SEQ ID NO:2)、SVV-IR2突变体(SEQ ID NO:3)和SVV-IR2-S177A突变体(SEQ ID NO:4)的SVV-A。

实施方案7：实施方案5的LNP，其中所述柯萨奇病毒选自CVB3、CVA21和CVA9。

实施方案8：实施方案5的LNP，其中所述柯萨奇病毒是包含SEQ ID NO:27的修饰的CVA21病毒。

实施方案9：实施方案1-8中的任一项的LNP，其中使所述LNP与细胞接触引起所述细胞产生病毒颗粒，并且其中所述病毒颗粒是感染性的和溶解性的。

实施方案10：实施方案1-9中的任一项的LNP，其中所述合成RNA病毒基因组还包含编码外源有效负载蛋白的异源多核苷酸。

实施方案11：实施方案1-9中的任一项的LNP，所述LNP还包含编码外源有效负载蛋白的重组RNA分子。

实施方案12：实施方案10或11的LNP，其中所述外源有效负载蛋白是荧光蛋白、酶蛋白、细胞因子、趋化因子、能够结合于细胞表面受体的抗原结合分子或细胞表面受体的配体。

实施方案13：实施方案12的LNP，其中所述细胞因子选自IL-12、GM-CSF、IL-18、IL-2和IL-36γ。

实施方案14：实施方案12的LNP，其中所述细胞表面受体的配体是Flt3配体或TNFSF14。

实施方案15：实施方案12的LNP，其中所述趋化因子选自CXCL10、CCL4、CCL21和CCL5。

实施方案16：实施方案12的LNP，其中所述抗原结合分子能够结合于并且抑制免疫检查点受体。

实施方案17：实施方案16的LNP，其中所述免疫检查点受体是PD-1。

实施方案18：实施方案12的LNP，其中所述抗原结合分子能够结合于肿瘤抗原。

实施方案19：实施方案18的LNP，其中所述抗原结合分子是双特异性T细胞衔接分子(BiTE)或双特异性轻T细胞衔接分子(LiTE)。

实施方案20：实施方案18或19的LNP，其中所述肿瘤抗原是DLL3或EpCAM。

实施方案21：实施方案1-20中的任一项的LNP，其中所述合成RNA病毒基因组和/或所述重组RNA分子包含微小RNA(miRNA)靶序列(miR-TS)盒，其中所述miR-TS盒包含一种或多种miRNA靶序列。

实施方案22：实施方案21的LNP，其中所述一种或多种miRNA选自miR-124、miR-1、miR-143、miR-128、miR-219、miR-219a、miR-122、miR-204、miR-217、miR-137和miR-126。

实施方案23：实施方案22的LNP，其中所述miR-TS盒包含miR-124靶序列的一个或多个拷贝、miR-1靶序列的一个或多个拷贝和miR-143靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案24：实施方案22的LNP，其中所述miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-219a靶序列的一个或多个拷贝和miR-122靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案25：实施方案22的LNP，其中所述miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-204靶序列的一个或多个拷贝和miR-219靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案26：实施方案22的LNP，其中所述miR-TS盒包含miR-217靶序列的一个或多个拷贝、miR-137靶序列的一个或多个拷贝和miR-126靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案27：实施方案1-26中的任一项的LNP，其中所述LNP包含阳离子型脂质、一种或多种辅助脂质和磷脂-聚合物缀合物。

实施方案28：实施方案27的LNP，其中所述阳离子型脂质选自DLinDMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA(MC3)、SS-LC(原名：SS-18/4PE-13)、SS-EC(原名：SS-33/4PE-15)、SS-OC、SS-OP、9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L-319)或N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)。

实施方案29：实施方案27或28的LNP，其中所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；和胆固醇。

实施方案30：实施方案27的LNP，其中所述阳离子型脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)，并且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

实施方案31：实施方案27-30中的任一项的LNP，其中所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG)；1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DSG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DSG-PEG)；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DMG-PEG)；和1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DMG-PEG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-胺)。

实施方案32：实施方案27-31中的任一项的LNP，其中所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG5K)；1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(DPG-PEG2K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DSG-PEG5K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DSG-PEG2K)；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DMG-PEG5K)；和1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DMG-PEG2K)。

实施方案33：实施方案27的LNP，其中所述阳离子型脂质包含SS-OC，其中所述一种或多种辅助脂质包含胆固醇(Chol)和DSPC，并且其中所述磷脂-聚合物缀合物包含DPG-PEG2000。

实施方案34：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-25％，C＝20％-30％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案35：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝20％-25％，C＝25％-30％，和D＝0％-1％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案36：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。

实施方案37：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案37A：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝25％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案37B：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-55％，B＝10％-20％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案38：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝10％-15％，C＝35％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案39：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是49:11:38.5:1.5。

实施方案39A：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-65％，B＝5％-20％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案39B：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝50％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案39C：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案39D：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-10％，C＝30％-35％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案39E：实施方案33的LNP，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是58:7:33.5:1.5。

实施方案40：实施方案1-39E中的任一项的LNP，其中所述LNP包含选自表5的脂质制剂。

实施方案41：实施方案1-40中的任一项的LNP，其中透明质酸缀合于所述LNP的表面。

实施方案42：一种治疗性组合物，所述治疗性组合物包含多个根据权利要求1-41中的任一项的脂质纳米颗粒。

实施方案43：实施方案42的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm至约500nm、约150nm至约500nm、约200nm至约500nm、约300nm至约500nm、约350nm至约500nm、约400nm至约500nm、约425nm至约500nm、约450nm至约500nm或约475nm至约500nm。

实施方案43A：实施方案42的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm至约120nm。

实施方案43B：实施方案42的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或约120nm。

实施方案43C：实施方案42的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约100nm。

实施方案44：实施方案42-43C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位介于约40mV至约-40mV、20mV至约-20mV、约10mV至约-10mV、约5mV至约-5mV或约20mV至约-40mV之间。

实施方案45：实施方案42-43C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位小于约-20mV、小于约-30mV、小于约-35mV或小于约-40mV。

实施方案46：实施方案45的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位介于约-50mV至约-20mV、约-40mV至约-20mV或约-30mV至约-20mV之间。

实施方案47：实施方案45或46的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位为约-30mV、约-31mV、约-32mV、约-33mV、约-34mV、约-35mV、约-36mV、约-37mV、约-38mV、约-39mV或约-40mV。

实施方案48：实施方案42-47中的任一项的治疗性组合物，其中向受试者施用所述治疗性组合物将所述重组RNA多核苷酸递送至所述受试者的靶细胞，并且其中所述重组RNA多核苷酸产生能够溶解所述受试者的所述靶细胞的感染性溶瘤病毒。

实施方案49：实施方案48的治疗性组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内或肿瘤内递送。

实施方案50：实施方案48的治疗性组合物，其中所述靶细胞是癌细胞。

实施方案51：一种抑制有需要的受试者中癌性肿瘤的生长的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用根据权利要求42-50中的任一项的治疗性组合物，其中所述组合物的施用抑制所述肿瘤的生长。

实施方案52：实施方案51的方法，其中所述施用是肿瘤内或静脉内的。

实施方案53：实施方案51或52的方法，其中所述癌症是肺癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤或膀胱癌。

实施方案53A：实施方案51-53中的任一项的方法，其中所述癌症是神经内分泌癌症。

实施方案54：一种重组RNA分子，所述重组RNA分子包含编码溶瘤病毒的合成RNA病毒基因组。

实施方案55：实施方案54的重组RNA分子，其中所编码的溶瘤病毒是单链RNA(ssRNA)病毒

实施方案56：实施方案55的重组RNA分子，其中所述ssRNA病毒是正义((+)-义)或负义((-)-义)ssRNA病毒。

实施方案57：实施方案56的重组RNA分子，其中所述(+)-义ssRNA病毒是小核糖核酸病毒。

实施方案58：实施方案57的重组RNA分子，其中所述小核糖核酸病毒是塞内加谷病毒(SVV)或柯萨奇病毒。

实施方案59：实施方案58的重组RNA分子，其中所述SVV是选自野生型SVV-A(SEQID NO:1)、S177A-SVVA突变体(SEQ ID NO:2)、SVV-IR2突变体(SEQ ID NO:3)或SVV-IR2-S177A(SEQ ID NO:4)的SVV-A。

实施方案60：实施方案58的重组RNA分子，其中所述柯萨奇病毒选自CVB3、CVA21和CVA9。

实施方案61：实施方案58的重组RNA分子，其中所述柯萨奇病毒是包含SEQ ID NO:27的修饰的CVA21病毒。

实施方案62：实施方案54-61中的任一项的重组RNA分子，其中所述重组RNA分子在通过非病毒性递送媒介物引入细胞中时能够产生感染性溶解病毒。

实施方案63：实施方案54-62中的任一项的重组RNA分子，所述重组RNA分子还包含被插入编码所述溶瘤病毒的所述多核苷酸序列中的微小RNA(miRNA)靶序列(miR-TS)盒，其中所述miR-TS盒包含一种或多种miRNA靶序列，并且其中细胞中一种或多种相应miRNA的表达抑制所述细胞中所编码的病毒的复制。

实施方案64：实施方案63的重组RNA分子，其中所述一种或多种miRNA选自miR-124、miR-1、miR-143、miR-128、miR-219、miR-219a、miR-122、miR-204、miR-217、miR-137和miR-126。

实施方案65：实施方案64的重组RNA分子，其中所述miR-TS盒包含miR-124靶序列的一个或多个拷贝、miR-1靶序列的一个或多个拷贝和miR-143靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案66：实施方案64的重组RNA分子，其中所述miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-219a靶序列的一个或多个拷贝和miR-122靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案67：实施方案64的重组RNA分子，其中所述miR-TS盒包含miR-128靶序列的一个或多个拷贝、miR-204靶序列的一个或多个拷贝和miR-219靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案68：实施方案64的重组RNA分子，其中所述miR-TS盒包含miR-217靶序列的一个或多个拷贝、miR-137靶序列的一个或多个拷贝和miR-126靶序列的一个或多个拷贝。

实施方案69：实施方案54-68中的任一项的重组RNA分子，其中所述重组RNA分子在通过非病毒性递送媒介物引入细胞中时能够产生具有复制能力的溶瘤病毒。

实施方案70：实施方案69的重组RNA分子，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

实施方案71：实施方案70的重组RNA分子，其中所述细胞是哺乳动物受试者中存在的哺乳动物细胞。

实施方案72：实施方案54-71中的任一项的重组RNA分子，其中所述具有复制能力的病毒选自由以下组成的组：柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、塞内加谷病毒、拉沙病毒、鼠白血病病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、新城疫病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒和马拉巴病毒。

实施方案72A：实施方案54-71中的任一项的重组RNA分子，其中所述具有复制能力的病毒选自表1中所列出的那些病毒。

实施方案73：实施方案63的重组RNA分子，其中所述一个或多个miR-TS盒被并入一种或多种必需病毒基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中。

实施方案74：实施方案63的重组RNA分子，其中所述一个或多个miR-TS盒被并入一种或多种非必需基因的5'非翻译区(UTR)或3'UTR中。

实施方案74A：实施方案63的重组RNA分子，其中所述一个或多个miR-TS盒被并入一种或多种必需病毒基因的5'或3'。

实施方案75：实施方案54-74A中的任一项的重组RNA分子，其中所述重组RNA分子被插入核酸载体中。

实施方案76：实施方案75的重组RNA分子，其中所述核酸载体是复制子。

实施方案77：实施方案54-76中的任一项的重组RNA分子，其中所述合成RNA病毒基因组还包含编码外源有效负载蛋白的异源多核苷酸。

实施方案78：实施方案77的重组RNA分子，其中所述外源有效负载蛋白是荧光蛋白、酶蛋白、细胞因子、趋化因子、能够结合于细胞表面受体的抗原结合分子或能够结合于细胞表面受体的配体。

实施方案79：实施方案78的重组RNA分子，其中所述细胞因子选自IL-12、GM-CSF、IL-18、IL-2和IL-36γ。

实施方案80：实施方案78的重组RNA分子，其中所述细胞表面受体的配体是Flt3配体或TNFSF14。

实施方案81：实施方案78的重组RNA分子，其中所述趋化因子选自CXCL10、CCL4、CCL21和CCL5。

实施方案82：实施方案78的重组RNA分子，其中所述抗原结合分子能够结合于并且抑制免疫检查点受体。

实施方案83：实施方案82的重组RNA分子，其中所述免疫检查点受体是PD-1。

实施方案84：实施方案78的重组RNA分子，其中所述抗原结合分子能够结合于肿瘤抗原。

实施方案85：实施方案84的重组RNA分子，其中所述抗原结合分子是双特异性T细胞衔接分子(BiTE)或双特异性轻T细胞衔接分子(LiTE)。

实施方案86：实施方案84或85的重组RNA分子，其中所述肿瘤抗原是DLL3或EpCAM。

实施方案87：一种重组DNA分子，所述重组DNA分子从5'至3'包含启动子序列、5'接合裂解序列、编码实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子的多核苷酸序列和3'接合裂解序列。

实施方案88：实施方案87的重组DNA分子，其中所述启动子序列是T7启动子序列。

实施方案89：实施方案87或88的重组DNA分子，其中所述5'接合裂解序列是核酶序列并且所述3'接合裂解序列是核酶序列。

实施方案90：实施方案89的重组DNA分子，其中所述5'核酶序列是锤头状核酶序列并且其中所述3'核酶序列是肝炎δ病毒核酶序列。

实施方案91：实施方案87或88的重组DNA分子，其中所述5'接合裂解序列是核酶序列并且所述3'接合裂解序列是限制酶识别序列。

实施方案92：实施方案91的重组DNA分子，其中所述5'核酶序列是锤头状核酶序列、手枪状核酶序列或修饰的手枪状核酶序列。

实施方案93：实施方案91或92的重组DNA分子，其中3'限制酶识别序列是IIS型限制酶识别序列。

实施方案94：实施方案93的重组DNA分子，其中所述IIS型识别序列是SapI识别序列。

实施方案95：实施方案87或88的重组DNA分子，其中所述5'接合裂解序列是RNAseH引物结合序列并且所述3'接合裂解序列是限制酶识别序列。

实施方案96：一种产生实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子的方法，所述方法包括体外转录实施方案87-95中的任一项的DNA分子以及纯化所得到的重组RNA分子。

实施方案98：实施方案96的方法，其中所述重组RNA分子包含由合成RNA病毒基因组编码的溶瘤病毒天然的5'末端和3'末端。

实施方案99：一种组合物，所述组合物包含有效量的实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子和适合于施用至哺乳动物受试者的载体。

实施方案100：一种颗粒，所述颗粒包含实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子。

实施方案101：实施方案100的颗粒，其中所述颗粒是生物可降解的。

实施方案102：实施方案101的颗粒，其中所述颗粒选自由纳米颗粒、外泌体、脂质体和脂质体复合物组成的组。

实施方案103：实施方案102的颗粒，其中所述外泌体是源自于完整外泌体或空外泌体的修饰外泌体。

实施方案104：实施方案102的颗粒，其中所述纳米颗粒是包含阳离子型脂质、一种或多种辅助脂质和磷脂-聚合物缀合物的脂质纳米颗粒(LNP)。

实施方案105：实施方案104的颗粒，其中所述阳离子型脂质选自DLinDMA、DLin-KC2-DMA、DLin-MC3-DMA(MC3)、SS-LC(原名：SS-18/4PE-13)、SS-EC(原名：SS-33/4PE-15)、SS-OC、SS-OP、9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L-319)或N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)。

实施方案106：实施方案104或105的颗粒，其中所述辅助脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；和胆固醇。

实施方案107：实施方案104的颗粒，其中所述阳离子型脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)，并且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

实施方案108：实施方案104-106中的任一项的颗粒，其中所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG)；1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇(DPG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DSG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DSG-PEG)；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DMG-PEG)；和1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯(DMG-PEG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-胺)。

实施方案109：实施方案104-108中的任一项的颗粒，其中所述磷脂-聚合物缀合物选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG5K)；1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(DPG-PEG2K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DSG-PEG5K)；1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DSG-PEG2K)；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-5000(DMG-PEG5K)；和1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DMG-PEG2K)。

实施方案110：实施方案104的颗粒，其中所述阳离子型脂质包含SS-OC，其中所述一种或多种辅助脂质包含胆固醇(Chol)和DSPC，并且其中所述磷脂-聚合物缀合物包含DPG-PEG2000。

实施方案111：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-25％，C＝20％-30％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案112：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝20％-25％，C＝25％-30％，和D＝0％-1％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案113：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约49:22:28.5:0.5。

实施方案114：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案114A：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝40％-60％，B＝10％-30％，C＝25％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案114B：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-55％，B＝10％-20％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案115：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是A:B:C:D，其中A＝45％-50％，B＝10％-15％，C＝35％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案116：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是49:11:38.5:1.5。

实施方案116A：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝45％-65％，B＝5％-20％，C＝20％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案116B：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝50％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-45％，和D＝0％-3％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案116C：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-15％，C＝30％-40％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案116D：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是约A:B:C:D，其中A＝55％-60％，B＝5％-10％，C＝30％-35％，和D＝1％-2％并且其中A+B+C+D＝100％。

实施方案116E：实施方案110的颗粒，其中SS-OC:DSPC:Chol:DPG-PEG2K(占总脂质含量的百分比)的比率是58:7:33.5:1.5。

实施方案117：实施方案100-116E中的任一项的颗粒，其中所述LNP包含选自表5的脂质制剂。

实施方案118：实施方案104的颗粒，其中所述阳离子型脂质是1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)，并且其中所述中性脂质是1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

实施方案119：实施方案104或118的颗粒，所述颗粒还包含磷脂-聚合物缀合物，其中所述磷脂-聚合物缀合物是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(DSPE-PEG)或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](DSPE-PEG-胺)。

实施方案120：实施方案104-119中的任一项的颗粒，其中透明质酸缀合于所述LNP的表面。

实施方案121：实施方案104-119中的任一项的颗粒，所述颗粒还包含编码有效负载分子的第二重组RNA分子。

实施方案122：实施方案121的颗粒，其中所述第二重组RNA分子是复制子。

实施方案123：实施方案122的颗粒，其中所述第二重组RNA分子是α病毒复制子。

实施方案124：一种治疗性组合物，所述治疗性组合物包含多个根据权利要求104-123中的任一项的脂质纳米颗粒。

实施方案125：实施方案124的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm至约500nm、约150nm至约500nm、约200nm至约500nm、约300nm至约500nm、约350nm至约500nm、约400nm至约500nm、约425nm至约500nm、约450nm至约500nm或约475nm至约500nm。

实施方案125A：实施方案124的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm至约120nm。

实施方案125B：实施方案124的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或约120nm。

实施方案125C：实施方案124的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均尺寸为约100nm。

实施方案126：实施方案124-125C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位介于约40mV至约-40mV、约20mV至约-20mV、约10mV至约-10mV、约5mV至约-5mV或约20mV至约-40mV之间。

实施方案127：实施方案124-125C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位小于约-20mV、小于约-30mV、小于约-35mV或小于约-40mV。

实施方案128：实施方案124-125C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位介于约-50mV至约-20mV、约-40mV至约-20mV或约-30mV至约-20mV之间。

实施方案129：实施方案124-125C中的任一项的治疗性组合物，其中所述多个LNP的平均ζ-电位为约-30mV、约-31mV、约-32mV、约-33mV、约-34mV、约-35mV、约-36mV、约-37mV、约-38mV、约-39mV或约-40mV。

实施方案130：实施方案124-129中的任一项的治疗性组合物，其中向受试者递送所述组合物将所包封的重组RNA分子递送至靶细胞，并且其中所包封的重组RNA分子产生能够溶解所述靶细胞的感染性病毒。

实施方案131：实施方案130的治疗性组合物，其中所述组合物被配制用于静脉内或肿瘤内递送。

实施方案132：实施方案131的治疗性组合物，其中所述靶细胞是癌细胞。

实施方案133：一种无机颗粒，所述无机颗粒包含实施方案54-86中的任一项的重组多核苷酸。

实施方案134：实施方案133的无机颗粒，其中所述无机颗粒选自由以下组成的组：金纳米颗粒(GNP)、金纳米棒(GNR)、磁性纳米颗粒(MNP)、磁性纳米管(MNT)、碳纳米角(CNH)、碳富勒烯、碳纳米管(CNT)、磷酸钙纳米颗粒(CPNP)、介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)、二氧化硅纳米管(SNT)或星形中空二氧化硅纳米颗粒(SHNP)。

实施方案135：实施方案133的无机颗粒，所述无机颗粒还包含编码有效负载分子的第二重组RNA分子。

实施方案136：实施方案135的颗粒，其中所述第二重组RNA分子是复制子。

实施方案137：一种组合物，所述组合物包含实施方案133-136中的任一项的无机颗粒，其中所述颗粒的平均直径小于约500nm，介于约50nm与约500nm之间，介于约250nm与约500nm之间，或为约350nm。

实施方案138：一种杀死癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞暴露于实施方案1-41、100-123或133-136中的任一项的颗粒、实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子或其组合物，所述暴露在足以将所述颗粒经细胞内递送至所述癌细胞的条件下，其中由所包封的多核苷酸产生的具有复制能力的病毒导致所述癌细胞的杀死。

实施方案139：实施方案138的方法，其中所述具有复制能力的病毒不在非癌细胞中产生。

实施方案140：实施方案138或139的方法，其中所述方法在体内、体外或离体进行。

实施方案141：一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向罹患所述癌症的受试者施用有效量的实施方案1-41、100-123或133-136中的任一项的颗粒、实施方案54-86中的任一项的重组RNA分子或其组合物。

实施方案142：实施方案141的方法，其中所述颗粒或其组合物经静脉内、鼻内、呈吸入剂施用，或直接注射至肿瘤中。

实施方案143：实施方案141或142的方法，其中所述颗粒或其组合物重复施用至所述受试者。

实施方案144：实施方案141-143中的任一项的方法，其中所述受试者是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、马、非人灵长类动物或人。

实施方案145：实施方案141-144中的任一项的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠直肠癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、甲状腺癌、恶性胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤、膀胱癌和边缘区淋巴瘤(MZL)。

实施方案146：实施方案145的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌或非小细胞肺癌。

实施方案147：实施方案145的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)。

实施方案148：实施方案145的方法，其中所述前列腺癌是治疗突发性神经内分泌前列腺癌。

实施方案148A：实施方案141-148中的任一项的方法，其中所述癌症是神经内分泌癌症。

实施例

给出以下实施例是为了说明本公开的各种实施方案，并不意味着以任何方式限制本公开。本发明的实施例；目前与本文所述的方法一起代表了优选的实施方案；是示例性的；并且不意图限制本公开的范围。本领域技术人员将想到其中的改变和包含在由权利要求书的范围所限定的本公开的精神内的其它用途。

实施例1：从重组RNA分子产生感染性小核糖核酸病毒

进行实验以评估从重组RNA分子产生感染性SVV病毒的能力。简单地说，包含SVV病毒基因组的RNA多核苷酸是通过体外T7转录产生的，并将293T细胞用1μg SVV RNA构建体在Lipofectamine RNAiMax中转染4小时，洗涤细胞，并将完全培养基添加到每个孔中。72小时后从转染的293T收集上清液，用0.45μM过滤器进行针筒式过滤并在NCI-H1299细胞上连续稀释。48小时后，从NCI-H1299培养物中去除上清液，并用结晶紫染色细胞以评估病毒感染性。如图1B所示，包含SVV-WT基因组的RNA分子产生活性溶解病毒。

此外，72小时后收集用1μg SVV-WT RNA脂质、SVV-WT质粒DNA或SVV阴性pDNA对照物处理的NCI-H1299细胞的上清液，并在未感染的NCI-H1299细胞上连续稀释。根据标准方案进行细胞活力测定。如图2所示，SVV-WT RNA/LNP能够产生感染性病毒，引起体外肿瘤细胞溶解。

实施例2：用于静脉内递送编码SVV的RNA的脂质纳米颗粒的配制

包含SVV基因组的重组RNA分子被配制在脂质纳米颗粒中，用于体内递送RNA。

脂质纳米颗粒产生：以下脂质用于脂质纳米颗粒的配制：

(a)D-Lin-MC3-DMA(MC3)；

(b)N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；

(c)SS-LC(原名：SS-18/4PE-13)；

(d)SS-EC(原名：SS-33/4PE-15)；

(e)SS-OC；

(f)SS-OP；

(g)二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L-319)

(h)胆固醇；

(i)1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；

(j)1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；

(k)1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；

(l)1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；

(m)1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-5000](DSPE-PEG5K)；

(n)1,2-二棕榈酰基-rac-甘油甲氧基聚乙二醇-2000(DPG-PEG2K)；

(o)1,2-二硬脂酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DSG-PEG2K)；以及

(p)1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲基聚氧乙烯-2000(DMG-PEG2K)。

在乙醇中以下表5所示的各种比率制备脂质。然后使用微流体微混合物(Precision NanoSystems,Vancouver,BC)以2mL/min(乙醇、脂质混合物为0.5mL/min，并且水性缓冲液、RNA为1.5mL/min)的组合流速产生RNA脂质纳米颗粒。用含有Ca和Mg的PBS通过切向流过滤来洗涤得到的颗粒。示例性SVV LNP制剂提供于表5中。除非另有指示，否则每个包装的RNA基因组均从包含5'锤头状核酶和3'肝炎δ核酶的IVT模板产生。

表5.示例性SVV RNA脂质纳米颗粒

*SVV-neg构建体由不含核酶的IVT模板产生

脂质纳米颗粒的物理特性分析：表5中的脂质纳米颗粒的物理特性在切向流过滤之前和之后进行评估。使用Malvern Nano-ZSζ粒度仪(Malvern Instruments有限公司,Worcestershire,UK)通过光散射测定粒度分布和ζ电位。尺寸测量在pH 7.4的HBS中进行，并且ζ电位测量在pH 7.4的0.01M HBS中进行。通过Ribogreen测定法测量RNA截留百分比。对显示超过80％的RNA截留的脂质纳米颗粒进行体内测试。

各种脂质纳米颗粒制剂的物理特性示于下表6中。

表6.SVV RNA脂质纳米颗粒的物理特性

如图3A-图3D和表6所示，脂质组成和脂质比例的变化会改变纳米颗粒的大小和/或RNA截留。在下面描述的实施例4-18中对显示超过80％的RNA截留的脂质纳米颗粒进行了体内测试。

实施例3：包含编码SVV的RNA的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒并抑制肿瘤生长

进行实验以确定包含SVV-WT RNA的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒以抑制小鼠肿瘤生长的能力。

如实施例3中所述进行SVV RNA脂质纳米颗粒产生、配制和物理特性分析，并总结在下表7中。

表7.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞悬浮在0.1mL无血清DPBS和Matrigel(1:1v/v)中并经皮下接种在8周龄雌性无胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腰窝中。小鼠被随机分配到实验组中，当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³(120-180mm³范围)时开始处理。

在第1天和第8天静脉内施用两剂含有SVV-WT RNA的脂质纳米颗粒(每剂5μg)。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。在第16天，收获肿瘤用于评估感染性病毒。

如图4A所示，与用PBS处理的小鼠相比，用SVV-WT脂质纳米颗粒处理的小鼠显示肿瘤生长显著降低(双向RM ANOVA，p<0.0.001)。此外，如图4B所示，用SVV-WT脂质纳米颗粒处理不影响体重，这表明了脂质纳米颗粒在静脉内施用时是无毒的。图5A和图5B展示了静脉内给与SVV-WT脂质纳米颗粒后感染性SVV从肿瘤中恢复。

实施例4：包含功能获得型编码SVV的RNA的颗粒抑制肿瘤生长

进行实验以确定包含具有功能获得型突变的编码SVV的RNA分子(SVV-S177A)的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒以抑制小鼠肿瘤生长的能力。

如实施例3中所述进行SVV RNA脂质纳米颗粒产生、配制和物理特性分析，并总结在下表8中。

表8.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例3中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下接种在8周龄雌性无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。小鼠被随机分配到4个实验组中：(i)仅PBS；(ii)SVV-阴性(SVV-Neg，制剂ID：70009-1.C)；(iii)SVV(野生型，制剂ID：70009-2.C)和(iv)SVV-S177A(制剂ID：70009-3.C)。SVV-Neg脂质纳米颗粒由无法复制的RNA分子构成，但大小与SVV-WT和SVV-S177A RNA相似。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，在第1天静脉内施用脂质纳米颗粒(每剂5μg)，然后在第6天、第11天和第16天进行另外的处理。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。在第22天，处死小鼠，并收获肿瘤和肝脏组织，以通过使用qRT-PCR测量负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在来确定复制的感染性病毒的存在。

如图6A所示，与用SVV-Neg脂质纳米颗粒或PBS处理的小鼠相比，用SVV-WT或SVV-S177A脂质纳米颗粒处理的小鼠显著抑制肿瘤生长(p<0.05，双向ANOVA)。在整个研究过程中，施用SVV脂质纳米颗粒对体重的影响最小(图6B)，这表明包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒是无毒并且耐受良好的。

在用包含SVV-WT或SVV-S177A RNA分子的脂质纳米颗粒处理的小鼠的肿瘤组织中检测到SVV的主动复制(图6C)。重要的是，在任何处理组的肝脏组织中都没有发生主动病毒复制，包括接受了能够在肿瘤组织中产生感染性病毒的脂质纳米颗粒的小鼠(图6D)。

实施例5：包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒和抑制肿瘤生长的能力。

实施例2和下表9中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表9.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个H1299细胞经皮下接种于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，在第1天和第6天向小鼠静脉内施用两剂5μg的包含MC-3、SS-LC或SS-EC可电离的脂质的SVV脂质纳米颗粒(制剂示于上表9中)。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。在第12天，收获肿瘤组织，并使用qRT-PCR分析负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在。

如图7所示，与用PBS处理的小鼠相比，用基于MC3的脂质纳米颗粒(制剂ID：70053-1.C)处理的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制(F检验以比较方差，**p<0.01)。然而，基于SS-LC或基于SS-EC的脂质纳米颗粒(制剂ID：70053-2.C、70059-1.C或70059-2.C)对肿瘤生长没有抑制作用。这些数据表明，基于MC3的脂质纳米颗粒将编码SVV的RNA分子递送至肿瘤组织，引起感染性病毒的产生和体内肿瘤溶解。

实施例6：包含编码SVV的RNA的脂质纳米颗粒在小细胞肺癌中的体内功效

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒和抑制小细胞肺癌(SCLC)生长的能力。

实施例2和下表10中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表10.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H82异种移植模型测试编码SVV的RNA脂质纳米颗粒对SCLC的体内功效。简单地说，将NCI-H82细胞(1×10⁶个细胞/0.1mL于1:1无血清PBS与的混合物中)经皮下接种在8周龄雌性无胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³(120-180mm³范围)时，小鼠开始处理，并且在第1天、第6天、第11天和第16天静脉内施用10μg SVV-WT脂质纳米颗粒(制剂ID：70087-1C)，或在第1天和第4天瘤内施用与Lipofectamine RNAiMax(阳性对照物)一起配制的1μg SVV-WT RNA。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图8所示，与用PBS处理的小鼠相比，用SVV-WT脂质纳米颗粒或Lipofectamine配制的SVV-WT RNA处理的小鼠显示出显著的肿瘤生长抑制(双向ANOVA p<0.05)。这些结果表明，静脉内施用包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒或瘤内施用Lipofectamine配制的编码SVV的RNA分子可有效启动肿瘤组织中的病毒复制，引起肿瘤细胞溶解。

实施例7：脂质组成的变化会改变编码SVV的RNA纳米颗粒的抗肿瘤活性

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的纳米颗粒的脂质组成是否影响体内病毒复制和抗肿瘤活性。

实施例2和下表11中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表11.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下接种于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，在第1天和第6天向小鼠静脉内施用5μg脂质纳米颗粒(制剂示于上表11中)。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。在第12天，收获肿瘤组织，并使用qRT-PCR分析负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在。

如图9A所示，与用PBS处理的小鼠相比用基于MC3和基于OC的脂质纳米颗粒(制剂ID：70077-3.C、70077-4.C、70077-8.C、70077-10.C和70077-11.C)处理的小鼠显著抑制肿瘤生长(双向ANOVA，图基多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test)，****：对比PBS，p<0.0001)。来自用不同脂质纳米颗粒制剂处理的小鼠的肿瘤组织显示存在负链SVVRNA，这证实静脉内施用SVV-WT RNA脂质纳米颗粒诱导肿瘤组织中的病毒复制(图9D)。基于MC3的脂质纳米颗粒导致体重减轻和肝酶AST和ALT增加，而基于OC的脂质纳米颗粒不影响这些参数(图9B和图9C)。总的来说，这些数据表明基于OC的脂质纳米颗粒制剂显著抑制肿瘤生长，并且在小鼠中具有良好的耐受性。

实施例8：PEG组成改变脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒的PEG组成是否影响体内病毒复制和抗肿瘤活性。

实施例2和下表12中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表12.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下接种于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，在第1天、第6天、第11天和第16天向小鼠静脉内施用两剂包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒(每剂5μg)。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图10所示，与用PBS处理的小鼠相比，用制剂70087-1.C和70087-4.C(表12)处理的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制(双向ANOVA，图基多重比较检验，对比PBS，****：p<0.0001，和***：p<0.001)。制剂70087-2.C和70087-3.C与70087-4.C的不同之处仅在于制剂中使用的PEG化脂质的类型不同(表12)。这些发现表明PEG化脂质的类型可以对编码SVV的RNA纳米颗粒的抗肿瘤活性产生显著影响。

实施例9：PEG组成改变基于OC的脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒的PEG组成是否影响体内病毒复制和抗肿瘤活性。

实施例2和下表13中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表13.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下施用于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，向小鼠静脉内施用5μg含有DSPE-PEG5K或DPG-、DMG-或DSG-PEG2K(制剂示于表13中)的SVV RNA脂质纳米颗粒。处理后72小时从小鼠中收集肿瘤组织，并使用qRT-PCR分析负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在。

如图11所示，制剂中使用的PEG类型可以改变纳米颗粒将SVV基因组有效递送至肿瘤组织的能力。用制剂80010-2.C、80010-3.C和80010-4.C处理的小鼠的肿瘤显示出更多数目的SVV负(-)链或SVV复制。制剂80010-2.C、80010-3.C、80010-4.C和80010-5.C的不同之处仅在于制剂中使用的脂质-PEG的类型和百分比。这表明PEG类型的选择和使用的百分比会对这些纳米颗粒的生物活性产生重大影响。

实施例10：可电离的脂质的组成改变脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性

进行实验以确定可电离的脂质的组成是否影响包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒在体内的抗肿瘤活性。

实施例2和下表14中描述脂质纳米颗粒的产生、配制和SVV RNA脂质纳米颗粒的物理特性分析。

表14.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV RNA纳米颗粒的可电离的脂质的组成抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下施用于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，在研究的第1天和第8天向小鼠静脉内施用1mg/kg包含SS-OC(制剂ID：80033-1.C)、SS-LC(制剂ID：80033-2.C)或SS-OP(制剂ID：80033-3.C)可电离的脂质的SVV-S177A RNA脂质纳米颗粒。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图12所示，与用PBS或基于SS-LC的脂质纳米颗粒处理的小鼠相比用基于SS-OC或基于SS-OP的脂质纳米颗粒处理的小鼠显示显著的肿瘤生长抑制(双向ANOVA，图基多重比较检验，对比PBS，*p<0.05，**p<0.001)。这些结果表明可电离的脂质的组成影响体内SVVRNA脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性。

实施例11：包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒在小细胞肺癌中的体内功效

进行实验以确定包含编码SVV的RNA分子的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒和抑制小细胞肺癌(SCLC)生长的能力。

实施例2和下表15中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和物理特性分析。

表15.SVV-RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H446异种移植模型测试编码SVV的RNA脂质纳米颗粒对SCLC的体内功效。简单地说，将NCI-H446细胞(5×10⁶个细胞/0.1mL于1:1无血清PBS与的混合物中)经皮下接种在8周龄雌性无胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³(120-180mm³范围)时，在第1天、第8天和第15天向小鼠静脉内施用1mg/kg SVV-Neg(制剂ID：80059-1.C)或SVV-S177A(制剂ID：80059-2.C)RNA脂质纳米颗粒或PBS。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。在第22天，收获肿瘤，并使用qRT-PCR分析负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在。

如图13A所示，与用SVV-Neg脂质纳米颗粒或PBS处理的小鼠相比，用SVV-S177A脂质纳米颗粒处理的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制(双向ANOVA，p<0.0.001)。重要的是，编码SVV的RNA脂质纳米颗粒的静脉内施用对体重没有影响，这表明这些剂无毒并且耐受性良好(图13B)。来自用SVV-S177A RNA脂质纳米颗粒处理的小鼠的肿瘤组织显示存在负链SVVRNA，这表明静脉内施用SVV-S177A RNA脂质纳米颗粒诱导肿瘤组织中的病毒复制(图13C)。这些结果表明，SVV-S177A RNA脂质纳米颗粒的全身施用引起体内SCLC细胞的SVV复制和溶解。

实施例12：SVV-IRES2 RNA脂质纳米颗粒对肿瘤生长的体内功效

进行实验以确定含有SVV-IRES2 RNA的脂质纳米颗粒是否可以抑制体内肿瘤生长。

实施例2和下表16中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表16.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV-WT和SVV-IRES2脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下施用于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，向小鼠静脉内施用0.2mg/kg含有SVV-WT(制剂ID：80130-1.C)或SVV-IRES2(制剂ID：80130-2.C)RNA分子的脂质纳米颗粒(第1天)。在研究的第8天施用后续剂量的PBS或脂质纳米颗粒。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图14所示，与用PBS处理的小鼠相比，用SVV-WT RNA或SVV-IRES2 RNA脂质纳米颗粒处理的小鼠表现出显著更低的肿瘤负荷(双向ANOVA，图基多重比较检验，****p<0.0001)。这些结果表明，含有SVV-WT或SVV-IRES2 RNA分子的脂质纳米颗粒在体内表现出抗肿瘤活性，其中SVV-IRES2表现出最好的抗肿瘤作用。

实施例13：含有编码SVV IRES2的RNA分子的脂质纳米颗粒能够在神经母细胞瘤肿瘤中复制

进行实验以确定SVV-WT和SVV-IRES2 RNA脂质纳米颗粒在体内复制的能力。

实施例2和下表17中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表17.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用N1E-115异种移植模型评估SVV-WT和SVV-IRES2脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力。简单地说，将N1E-115细胞(5×10⁵个细胞/0.1mL于1:1无血清DPBS与Matrigel的混合物中)经皮下接种在8周龄雌性A/J小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³(120-180mm³范围)时，向小鼠静脉内施用0.4mg/kg SVV-WT(制剂ID：80130-1.C)或SVV-IRES2(制剂ID：80130-2.C)RNA脂质纳米颗粒(第1天)。在脂质纳米颗粒处理后96小时从小鼠中收获肿瘤，并使用qRT-PCR分析负链SVV RNA(复制SVV的替代标记)的存在。

如图15所示，与PBS对照物相比，施用SVV-WT或SVV-IRES2RNA脂质纳米颗粒的小鼠显示出高10-1000倍的负链SVV RNA水平。值得注意的是，与施用SVV-WT RNA脂质纳米颗粒的小鼠相比，来自用SVV-IRES2脂质纳米颗粒处理的小鼠的大部分肿瘤组织表现出更高水平的SVV复制。这些结果表明SVV-WT或SVV-IRES2 RNA脂质纳米颗粒的全身施用引起体内神经母细胞瘤肿瘤中的SVV复制。

实施例14：产生针对SVV的中和兔多克隆抗体

兔多克隆抗体是通过用SVV病毒粒子对兔进行免疫接种而产生的。ELISA证实免疫兔血清中存在抗SVV抗体(数据未显示)。

为了确定抗SVV抗体是否能抑制细胞溶解，将SVV病毒(1×10⁶TCID50/mL)和抗SVV抗体的系列稀释液(1:2)在H446细胞上孵育。H446细胞的溶解活性通过计算。图16A展示了在稀释度高达1:320下SVV被兔多克隆抗体中和。

为了确定兔抗SVV多克隆抗体的1:100稀释液的有效性，将不同浓度的SVV病毒和稀释的SVV抗体(1:100)在H446细胞上孵育。如图16B所示，测试所有剂量的SVV病毒，范围从10²至10⁷TCID50/mL，被抗SVV抗体的1:100稀释液中和。1组、2组和3组是抗体稀释液的生物学重复。

实施例15：SVV-RNA脂质纳米颗粒在中和血清存在下表现出抗肿瘤活性

在体内存在SVV中和抗体的情况下测试SVV RNA脂质纳米颗粒。

实施例14中描述抗SVV多克隆抗体的产生和测试。实施例2和下表18中描述SVVRNA脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表18.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估抗SVV抗体抑制由SVV RNA脂质纳米颗粒诱导的肿瘤细胞溶解的能力，如在实施例4中进一步描述。简单地说，向负载H1299肿瘤的裸小鼠(n＝8只小鼠/组)静脉内施用100μL SVV-RNA脂质纳米颗粒(制剂ID：80139-1.C)或SVV病毒粒子，并经腹膜内注射未处理兔血清(阴性对照物)或抗SVV多克隆抗体。荷瘤小鼠在研究的第0天和第7天接受两剂抗体，并在研究的第1天和第8天接受两剂SVV病毒粒子或SVV RNA脂质纳米颗粒。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。处理组在下表19中示出。

表19：实验处理组

如图17所示，用未处理兔血清免疫接种的SVV病毒粒子处理的小鼠显示出显著的肿瘤生长抑制(双向ANOVA，图基多重比较检验，****p<0.0001)。相比之下，向SVV病毒粒子处理的小鼠施用SVV中和抗体完全阻断SVV的抗肿瘤活性。向用SVV RNA脂质纳米颗粒处理的小鼠施用SVV中和抗体(或未处理兔血清)不会影响SVV RNA脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性。SVV RNA脂质纳米颗粒处理显著抑制用SVV中和血清处理的小鼠的肿瘤生长(双向ANOVA，图基多重比较检验，****p<0.0001)。因此，与SVV病毒粒子不同，SVV RNA脂质纳米颗粒的抗肿瘤活性不受循环中中和抗体存在的影响。

实施例16：CVA21编码RNA脂质纳米颗粒在黑素瘤中的体内功效

进行实验以确定包含编码CVA21的RNA分子的脂质纳米颗粒在体内产生感染性病毒和抑制黑色素瘤肿瘤生长的能力。实施例2和下表20中描述CVA21 RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表20.CVA21脂质纳米颗粒的制剂

使用SK-MEL28异种移植模型评估CVA21 RNA脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力。简单地说，将SK-MEL28细胞(1×10⁶个细胞/0.1mL于1:1无血清PBS与的混合物中)经皮下接种在8周龄雌性无胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories)的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³(120-180mm³范围)时，向小鼠瘤内施用PBS或与Lipofectamine RNAiMax一起配制的编码CVA21的RNA(1μg)，或静脉内施用编码CVA21的RNA脂质纳米颗粒(制剂ID：70032-6C，5μg)。在第1天和第5天，小鼠接受瘤内处理，或在第1天、第6天、第11天和第16天接受静脉内处理。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图18所示，与用PBS处理的小鼠相比，用包含CVA21 RNA分子的LNP进行静脉内处理或用与Lipofectamine一起配制的CVA21-RNA分子进行肿瘤内处理可防止荷瘤小鼠的肿瘤生长(双向ANOVA，p<0.0.001)。总的来说，这些结果表明包含CVA21 RNA分子的脂质纳米颗粒是治疗黑色素瘤的有效治疗策略。

实施例17：生成SVV的离散3'端的策略

如上所述，本文所述的合成基因组需要病毒天然的离散3'和5'末端，以便从合成基因组产生具有复制能力和感染性的病毒。由T7RNA聚合酶在体外产生的RNA转录物含有哺乳动物5'和3'UTR，因此不含产生感染性ssRNA病毒所需的离散的天然末端。

采用使用3'限制酶识别序列的策略来产生感染性SVV所需的离散3'末端。SapI限制识别序列插入DNA模板的3'末端。SapI在其识别位点的5'裂解以产生适当长度的聚胸苷序列，从而产生病毒天然的离散病毒聚腺苷酸化位点。这个过程如图19所示。

实施例18：用于产生SVV的离散5'端的RNaseH策略

采用RNAseH策略产生SVV天然的离散5'端。T7 RNA聚合酶需要5'末端上的鸟苷残基。然而，SVV的5'端以尿苷残基开头。因此，必须去除T7前导序列以产生病毒的可靠端。描绘的图20是体外转录(IVT)和5'前导序列加工方法的图。IVT模板描绘在顶部，得到的RNA转录物在中间示出。然后将这个SVV+ssRNA转录物与互补的dsDNA核苷酸(虚线框)退火，并用RNaseH水解该部分。带有正确的5'端的最终病毒ssRNA产物展示在底部。

RNaseH工程转录物的正确加工通过引物延伸分析进行评估。将RNA转录物用RNaseH处理或不消化。然后将互补的荧光引物添加到消化和未消化的样品中并退火，然后通过Superscript IV逆转录酶延伸。然后将产物在TBE UREA丙烯酰胺凝胶上解析。预期条带如下：未消化≥150bp和消化＝100bp。如图21所示，该策略引起约90％RNA被正确加工，如在RNaseH存在下消化条带的增加所说明。

该策略与实施例19中描述的3'限制酶策略相结合，产生具有产生感染性SVV所需的离散5'和3'端的最终合成SVV基因组。

实施例19：用于产生SVV的离散5'端的核酶策略

采用核酶策略产生SVV天然的离散5'端。该方法的示意图示于图22中，其展示了使小核糖核酸病毒5'端裂解的核酶的设计。所描绘的两种核酶是锤头状核酶和手枪状核酶，但在这种情况下，可以采用多种其它核酶进行特异性裂解。

用于在该策略中实施的锤头状和手枪状核酶的修改分别示于图23和图24。退火并使SVV 5'端裂解的最小锤头状核酶(HHR)的结构模型示于图23A中(该核酶在箭头指示的位点使5'端裂解)。具有用于裂解SVV 5'端的稳定茎I(STBL)的锤头状核酶的结构模型示于图23B(该核酶在箭头指示的位点处使5'末端裂解)。图24A展示了在野生(手枪WT)中发现的手枪状核酶特征的示意图。图24B展示了由mFOLD建模的来自多粘类芽孢杆菌的手枪状核酶，其中添加了一个四环以融合P3链。虚线框中的核酸经过诱变以在病毒序列的背景中保留核酶折叠。虚线框中所示的WT“GUC”序列突变为“UCA”以产生手枪1，并将“GUC”序列突变为“TTA”以产生手枪2。

评估4种核酶(HHR、STBL、手枪1和手枪2)在IVT过程中介导裂解的能力。将IVT模板用HpaI线性化，在未切割的情况下产生150nt流走物，以及在核酶裂解的情况下约90和约60nt的2个裂解片段，以便在IVT过程之后给出核酶效率的读数。如图25所示，在与核酶构建体的所有反应中都存在三个条带。两个锤头状核酶裂解效率为约40-60％(STBL-泳道3和HHR-泳道4)。泳道5中的手枪1核酶在凝胶上没有可见的未切割产物。泳道6中的手枪2核酶在凝胶上具有约5％的可见的未裂解的产物。使用引物延伸分析获得类似的结果(图26)。引物延伸产物在TBE UREA丙烯酰胺凝胶上解析。预期条带是；未消化≥150bp(见泳道7的150bp的SVV-Neg参考条带)和消化＝80bp。手枪1引起完全裂解，这可以通过泳道10中没有上部条带来证明。

这些结果表明所有四种核酶都能够介导IVT转录物的裂解。然而，手枪1和手枪2核酶更有效，其中手枪1最有效的，并且在IVT过程中介导完全裂解。

实施例20：5'核酶和3'限制酶工程化的SVV基因组的体外功能

进行一项体外测定以评估SVV基因组的功能，该基因组被工程化化成具有5'核酶序列和3'SapI限制酶识别位点。以下IVT模板用于产生合成SVV基因组：

(a)5'HHR序列和3'SapI识别序列

(b)5'手枪1序列和3'SapI识别序列

H1299细胞使用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen)和1ug IVT产生的RNA转染。使用来自Qiagen的250uL QIAzol试剂在12小时、24小时和36小时从NCI-H1299细胞中提取总RNA。由该RNA产生cDNA并用负链特异性Taqman测定进行分析。将NCI-H1299细胞用固定量的所指示的IVT产生的RNA转染。随着时间的推移，对该RNA产生的cDNA进行绝对qRT-PCR。在手枪1-SapI构建体中，来自H1299细胞的SVV启动的早期动力学大大增强(图27)。

实施例21：手枪/SapI SVV RNA脂质纳米颗粒对肿瘤生长的体内功效

进行实验以确定含有SVV-手枪/SapI RNA分子的脂质纳米颗粒是否可在体内抑制肿瘤生长。

实施例2和下表21中描述SVV RNA脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表21.SVV RNA脂质纳米颗粒制剂

使用H1299异种移植模型评估SVV-HHR-HDV和SVV-手枪/SapI脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下施用于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，向小鼠静脉内施用0.2mg/kg含有SVV-HHR/HDV(制剂ID：80130-1.C)或SVV-手枪/SapI(制剂ID：80130-3.C)RNA分子的脂质纳米颗粒(第1天)。在研究的第8天施用后续剂量的PBS或脂质纳米颗粒。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。

如图28所示，与用PBS处理的小鼠相比，用SVV-HHR-HDV RNA或SVV-手枪/SapI RNA脂质纳米颗粒处理的小鼠显著抑制肿瘤生长(双向ANOVA，图基多重比较检验，****p<0.0001)。此外，与SVV-HHR RNA脂质纳米颗粒相比，用SVV-手枪/SapI RNA脂质纳米颗粒处理更有效地抑制肿瘤生长方面(双向ANOVA，图基多重比较检验，##p<0.01)。

实施例22：在修饰的核糖核苷酸下的SVV-RNA的体外合成

进行实验以评估在修饰的核糖核苷酸下体外合成SVV-RNA以增强RNA稳定性的可能性。在没有或有修饰的核糖核苷酸的情况下体外合成编码mCherry(基因表达和病毒复制的标记，SVV-mCherry)的SVV正义RNA(图29A)。将体外合成的RNA与RNAiMax(Invitrogen,Thermo Fisher,Waltham,MA)一起配制并转染到NCI-H1299人肺癌细胞中4小时，然后洗涤细胞并加入新鲜培养基，历时72小时。红色荧光蛋白mCherry的存在(在图29B中显示为较浅的阴影)用作病毒复制的替代物。

如图29A所示，在Ψ-UTP或5-m-CTP下SVV-mCherry-RNA的合成是有效的。当两种修饰的核糖核苷酸组合时，没有产生RNA。这表明多个修饰的核糖核苷酸的存在不支持SVV-RNA的IVT。SVV-Ψ-UTP RNA或SVV-5-m-CTP RNA的转染不致使病毒复制(图29B)。病毒RNA二级结构是支持病毒复制的关键，在SVV的情况下，使用修饰的核糖核苷酸可以改变RNA的天然二级构象，防止病毒复制。

实施例23：从SVV基因组表达有效负载分子

进行实验以评估是否可以从SVV病毒基因组表达编码有效负载分子的多核苷酸。将mCherry、nanoLuciferase、CXCL10、IL-12、GM-CSF和FAP-CD3 BiTE每一者的表达盒插入到编码SVV基因组的质粒中。将H1299细胞用0.015pmol质粒转染，收集上清液并过滤以收集病毒颗粒。将过滤的上清液转移到H446培养物中并评估感染性。如图30所示，每种有效负载工程化病毒都能够感染H446细胞，尽管具有不同程度的功效。每个构建体的IC50提供在下表22中。这些数据表明，SVV可以被设计成表达各种有效负载分子，以提高病毒的治疗功效。

表22：SVV-有效负载构建体的质粒长度和IC50

实施例24：编码SVV的有效负载RNA脂质纳米颗粒对肿瘤组织中肿瘤生长和有效负载表达的体内功效

进行实验以确定含有SVV-有效负载RNA的脂质纳米颗粒是否可以抑制体内肿瘤生长并评估肿瘤组织中的有效负载表达。

在实施例2以及下表23和24中描述SVV-Neg、SVV-WT和SVV-IL-36γRNA(SEQ IDNO:11)脂质纳米颗粒的产生、配制和分析。

表23：制剂的脂质组成

表24：制剂的物理特性

使用H1299异种移植模型评估SVV-WT+SVV-Neg和SVV-WT+SVV-IL-36γ脂质纳米颗粒抑制肿瘤生长的能力，如实施例4中进一步描述。简单地说，将5×10⁶个NCI-H1299细胞经皮下施用于无胸腺裸小鼠的右侧腰窝中。当肿瘤尺寸中位数达到约150mm³时，向小鼠静脉内施用0.2mg/kg含有SVV-WT+SVV-Neg(制剂ID：比率1:1的80116-3.C+80116-4.C混合物)或SVV-WT+SVV-IL-36γ(制剂ID：比率1:1的80116-4.C+80116-5.C混合物)RNA分子的脂质纳米颗粒(第1天)。在研究的第8天施用后续剂量的PBS或脂质纳米颗粒。使用电子卡尺每周测量肿瘤体积3次。研究在第10天终止，收集肿瘤用于有效负载表达分析。

如图31A所示，与用PBS处理的小鼠相比，用SVV-WT+SVV-Neg或SVV-WT+SVV-IL-36γRNA脂质纳米颗粒处理的小鼠表现出显著较低的肿瘤负荷(双向ANOVA，图基多重比较检验，****p<0.0001)。这些结果表明含有SVV-WT+SVV-IL-36γRNA分子的脂质纳米颗粒在体内表现出抗肿瘤活性。

对在研究结束时收集的肿瘤组织进行加工以产生肿瘤溶解物。IL36γ水平由Elisa(R&D系统，DY2320-05)测定。如图31B所示，在用SVV-WT+SVV-IL36γRNA脂质纳米颗粒处理的小鼠中检测到人IL-36γ。这些结果表明，含有SVV-IL-36γRNA分子的脂质纳米颗粒支持病毒基因组中编码的转基因在肿瘤组织中的表达。

实施例25：编码柯萨奇病毒的RNA分子的优化

进行实验以评估从重组RNA分子产生感染性柯萨奇病毒A21(CVA21)的能力。简单地说，包含CVA21病毒基因组的RNA多核苷酸是基于先前描述的CVA21基因组序列(参见Newcombe等人,Cell ular receptor interactions of C-cluster human group Acoxsackieviru ses Journal of General Virology(2003),84,3041-3050.GenBank登录号AF465515)通过T7转录在体外产生的。将SK-MEL-28细胞用1μg CVA21 RNA构建体在Lipofectamine RNAiMax中转染4小时，此时洗涤孔并将完全培养基添加到每个孔中。48小时后，从SK-ME L-28培养物中去除上清液，并用结晶紫染色细胞以评估病毒感染性。如图32A(左图)所示，包含Newcombe CVA21序列(CVA21 WT)的RNA分子不产生活性溶解病毒(由未溶解的SK-MEL-28细胞的结晶紫染色指示)。

令人惊讶的是，从重组RNA分子产生感染性CVA21需要改变5'UTR。如图32A(右图)所示，Brown等人描述的5'UTR序列(Journal of Virology,(2003)77:16,第8973-8984号.GenBank登录号AF546702)掺入Newcombe描述的CVA21基因组序列中(CVA21-Brown)引起感染性CVA21病毒的产生和病毒细胞溶解，这由多个独立克隆中缺乏结晶紫染色所指示。72小时后从经两种不同的CVA21-Brown克隆转染的SK-MEL-28细胞收集上清液，并用注射器用0.45μM过滤器进行针筒式过滤并连续稀释到新鲜的SK-MEL-28细胞上。48小时后，从SK-MEL-28培养物中去除上清液，并用结晶紫染色细胞以评估病毒感染性。如图32B所示，包含Brown 5'UTR序列(UTR序列-SEQ ID NO:26，修饰的CVA21序列-SEQ ID NO:27)的编码CVA21的RNA分子引起感染性CVA21的产生和释放到转染细胞的上清液中，这由单独上清液介导细胞溶解的能力指示。

以引用的方式并入

本文中引用的所有参考文献、文章、公布、专利、专利公布和专利申请均以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的。然而，对本文中引用的任何参考文献、文章、公布、专利、专利公布和专利申请的提及，并不也不应被视为承认或任何形式的建议，它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

尽管本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案；但是本领域的技术人员显而易见的是，只是以示例的方式提供这类实施方案。在不脱离本公开的情况下，本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实践本公开中可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。意图以下权利要求书界定本公开的范围，并且由此涵盖在这些权利要求书范围内的方法和结构和它们的等同物。

序列表

<110> 昂克诺斯公司(Oncorus, Inc.)

<120> 包封的RNA多核苷酸及使用方法

<130> ONCR-015/01WO 324865-2145

<150> 62/788,504

<151> 2019-01-04

<150> 62/895,135

<151> 2019-11-03

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7310

<212> RNA

<213> 塞内加病毒A(Senecavirus A)

<400> 1

uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60

ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120

ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180

uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240

ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360

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acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720

accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780

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uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140

aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200

ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260

agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320

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uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500

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uuccucggau uuguugauuc caucaccucu gaacaaggaa cuuacgcaag acucuuuagg 5640

uacaggguga cgaccuacaa aggauggugc ggcucggccc uggucuguga ggccgguggc 5700

guccgacgca ucauuggccu gcauucugcu ggcgccgccg guaucggcgc cgggaccuau 5760

aucucaaaau uaggacuaau caaagcccug aaacaccucg gugaaccuuu ggccacaaug 5820

caaggacuga ugacugaauu agagccugga aucaccguac auguaccccg gaaauccaaa 5880

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acugccaaug ucccuuacca accuccuuug uucuacacau acaugucaga guacgcucau 6060

cgagucuucu ccuucuuggg gaaagacaau gacauucuga ccgucaaaga agcaauucug 6120

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 塞内加病毒A S177A IR2突变体

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ugggcauccc cggacuagac cccauggauc cccacacagc uccgggucug ccuuacgcca 6180

ucaacggccu ucgacguacu gaucucgucg auuuugugaa cgguacagua gaugcggcgc 6240

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-mCherry构建体

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accaagggug gcccccugcc cuucgccugg gacauccugu ccccucaguu cauguacggc 3720

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cggauguacc ccgaggacgg cgcccugaag ggcgagauca agcagaggcu gaagcugaag 4020

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<211> 7992

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-nLuc构建体

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ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

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gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800

uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860

aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920

uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980

acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040

gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100

uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160

gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220

aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280

aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340

augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400

acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460

uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520

aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580

ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640

acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700

gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760

ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820

aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880

cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940

gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000

cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060

acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120

gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180

cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240

ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300

cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360

gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420

gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480

ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug uggcuccaaa accugcucuu ccucggaauu 3540

gucguguacu cccuguccgc uccuacuaga agcccaauca caguaacaag accuuggaaa 3600

cacguggaag cuauaaaaga agcccugaac cugcuugacg auaugcccgu aacccugaau 3660

gaagaaguug aaguuguaag caacgaauuu uccuucaaga aacucacaug ugugcaaacc 3720

cggcugaaaa uauuugaaca aggacugaga ggaaauuuua cuaaacuuaa aggcgcacuu 3780

aauaugacug cuucuuauua ccagacuuau ugccccccua caccagaaac cgauugcgaa 3840

acccaaguga cuaccuaugc cgacuuuauc gauuccuuga aaacguuccu uacugauaua 3900

cccuuugaau gcaaaaaacc uggacagaaa gagggcagag gaagucugcu aacaugcggu 3960

gacgucgagg agaaucccgg gccugcuucu gacaacccaa uuuuggaguu ucuugaagca 4020

gaaaaugauc uagucacucu ggccucucuc uggaagaugg ugcacucugu ucaacagacc 4080

uggagaaagu augugaagaa cgaugauuuu uggcccaauu uacucagcga gcuagugggg 4140

gaaggcucug ucgccuuggc cgccacgcua uccaaccaag cuucaguaaa ggcucuuuug 4200

ggccugcacu uucucucucg ggggcucaau uacacugacu uuuacucuuu acugauagag 4260

aaaugcucua guuucuuuac cguagaacca ccuccuccac cagcugaaaa ccugaugacc 4320

aagcccucag ugaagucgaa auuccgaaaa cuguuuaaga ugcaaggacc cauggacaaa 4380

gucaaagacu ggaaccaaau agcugccggc uugaagaauu uucaauuugu ucgugaccua 4440

gucaaagagg uggucgauug gcugcaggcc uggaucaaca aagagaaagc cagcccuguc 4500

cuccaguacc aguuggagau gaagaagcuc gggccugugg ccuuggcuca ugacgcuuuc 4560

auggcugguu ccgggccccc ucuuagcgac gaccagauug aauaccucca gaaccucaaa 4620

ucucuugccc uaacacuggg gaagacuaau uuggcccaaa gucucaccac uaugaucaau 4680

gccaaacaaa guucagccca acgaguugaa cccguugugg ugguccuuag aggcaagccg 4740

ggaugcggca agagcuuggc cucuacguug auugcccagg cuguguccaa gcgccucuau 4800

ggcucccaaa guguauauuc ucuuccccca gauccagauu ucuucgaugg auacaaagga 4860

caguucguga ccuugaugga ugauuuggga caaaacccgg auggacaaga uuucuccacc 4920

uuuugucaga uggugucgac cgcccaauuu cuccccaaca uggcggaccu ugcagagaaa 4980

gggcgucccu uuaccuccaa ucucaucauu gcaacuacaa aucuccccca cuucaguccu 5040

gucaccauug cugauccuuc ugcagucucu cgccguauca acuacgaucu gacucuagaa 5100

guaucugagg ccuacaagaa acacacacgg cugaauuuug acuuggcuuu caggcgcaca 5160

gacgcccccc ccauuuaucc uuuugcugcc caugugcccu uuguggacgu agcugugcgc 5220

uucaaaaaug gucaccagaa uuuuaaucuc cuagaguugg ucgauuccau uuguacagac 5280

auucgagcca agcaacaagg ugcccgaaac augcagacuc ugguucuaca gagccccaac 5340

gagaaugaug acacccccgu cgacgaggcg uuggguagag uucucucccc cgcugcgguc 5400

gaugaggcgc uugucgaccu cacuccagag gccgacccgg uuggccguuu ggcuauucuu 5460

gccaagcuag gucuugcccu agcugcgguc accccugguc ugauaaucuu ggcaguggga 5520

cucuacaggu acuucucugg cucugaugca gaccaagaag aaacagaaag ugagggaucu 5580

gucaaggcac ccaggagcga aaaugcuuau gacggcccga agaaaaacuc uaagcccccu 5640

ggagcacucu cucucaugga aaugcaacag cccaacgugg acaugggcuu ugaggcugcg 5700

gucgcuaaga aaguggucgu ccccauuacc uucaugguuc ccaacagacc uucugggcuu 5760

acacaguccg cucuucuggu gaccggccgg accuuccuaa ucaaugaaca uacauggucc 5820

aaucccuccu ggaccagcuu cacaauccgc ggugagguac acacucguga ugagcccuuc 5880

caaacgguuc auuucacuca ccacgguauu cccacagauc ugaugauggu acgucucgga 5940

ccgggcaauu cuuucccuaa caaucuagac aaguuuggac uugaccagau gccggcacgc 6000

aacucccgug ugguuggcgu uucguccagu uacggaaacu ucuucuucuc uggaaauuuc 6060

cucggauuug uugauuccau caccucugaa caaggaacuu acgcaagacu cuuuagguac 6120

agggugacga ccuacaaagg auggugcggc ucggcccugg ucugugaggc cgguggcguc 6180

cgacgcauca uuggccugca uucugcuggc gccgccggua ucggcgccgg gaccuauauc 6240

ucaaaauuag gacuaaucaa agcccugaaa caccucggug aaccuuuggc cacaaugcaa 6300

ggacugauga cugaauuaga gccuggaauc accguacaug uaccccggaa auccaaauug 6360

agaaagacga ccgcacacgc gguguacaaa ccggaguuug agccugcugu guugucaaaa 6420

uuugauccca gacugaacaa ggauguugac uuggaugaag uaauuugguc uaaacacacu 6480

gccaaugucc cuuaccaacc uccuuuguuc uacacauaca ugucagagua cgcucaucga 6540

gucuucuccu ucuuggggaa agacaaugac auucugaccg ucaaagaagc aauucugggc 6600

auccccggac uagaccccau ggauccccac acagcuccgg gucugccuua cgccaucaac 6660

ggccuucgac guacugaucu cgucgauuuu gugaacggua caguagaugc ggcgcuggcu 6720

guacaaaucc agaaauucuu agacggugac uacucugacc augucuucca aacuuuucug 6780

aaagaugaga ucagacccuc agagaaaguc cgagcgggaa aaacccgcau uguugaugug 6840

cccucccugg cgcauugcau ugugggcaga auguugcuug ggcgcuuugc ugccaaguuu 6900

caaucccauc cuggcuuucu ccucggcucu gcuaucgggu cugacccuga uguuuucugg 6960

accgucauag gggcucaacu cgaggggaga aagaacacgu augacgugga cuacagugcc 7020

uuugacucuu cacacggcac uggcuccuuc gaggcucuca ucucucacuu uuucaccgug 7080

gacaaugguu uuagcccugc gcugggaccg uaucucagau cccuggcugu cucggugcac 7140

gcuuacggcg agcgucgcau caagauuacc gguggccucc ccuccgguug ugccgcgacc 7200

agccugcuga acacagugcu caacaaugug aucaucagga cugcucuggc auugacuuac 7260

aaggaauuug aauaugacau gguugauauc aucgccuacg gugacgaccu ucugguuggc 7320

acggauuacg aucuggacuu caaugaggug gcacgacgcg cugccaaguu gggguauaag 7380

augacuccug ccaacaaggg uucugucuuc ccuccgacuu ccucucuuuc cgaugcuguu 7440

uuucuaaagc gcaaauucgu ccaaaacaac gacggcuuau acaaaccagu uauggauuua 7500

aagaauuugg aagccaugcu cuccuacuuc aaaccaggaa cacuacucga gaagcugcaa 7560

ucuguuucua uguuggcuca acauucugga aaagaagaau augauagauu gaugcacccc 7620

uucgcugacu acggugccgu accgagucac gaguaccugc aggcaagaug gagggccuug 7680

uucgacugac ccagauagcc caaggcgcuu cggugcugcc ggcgauucug ggagaacuca 7740

gucggaacag aaaagggaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 7786

<210> 8

<211> 8993

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV IL-12构建体

<400> 8

uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60

ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120

ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180

uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240

ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360

aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420

gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480

acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540

gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600

gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660

acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720

accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780

ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840

aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900

caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960

augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020

ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080

uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140

aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200

ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260

agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320

aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380

uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440

uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500

ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560

gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620

accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680

ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740

gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800

uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860

aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920

uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980

acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040

gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100

uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160

gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220

aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280

aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340

augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400

acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460

uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520

aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580

ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640

acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700

gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760

ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820

aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880

cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940

gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000

cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060

acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120

gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180

cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240

ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300

cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360

gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420

gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480

ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug uguccucaga agcuaaccau cuccugguuu 3540

gccaucguuu ugcugguguc uccacucaug gccauguggg agcuggagaa agacguuuau 3600

guuguagagg uggacuggac ucccgaugcc ccuggagaaa cagugaaccu caccugugac 3660

acgccugaag aagaugacau caccuggacc ucagaccaga gacauggagu cauaggcucu 3720

ggaaagaccc ugaccaucac ugucaaagag uuucuagaug cuggccagua caccugccac 3780

aaaggaggcg agacucugag ccacucacau cugcugcucc acaagaagga aaauggaauu 3840

ugguccacug aaauuuuaaa aaauuucaaa aacaagacuu uccugaagug ugaagcacca 3900

aauuacuccg gacgguucac gugcucaugg cuggugcaaa gaaacaugga cuugaaguuc 3960

aacaucaaga gcaguagcag uuccccugac ucucgggcag ugacaugugg aauggcgucu 4020

cugucugcag agaaggucac acuggaccaa agggacuaug agaaguauuc aguguccugc 4080

caggaggaug ucaccugccc aacugccgag gagacccugc ccauugaacu ggcguuggaa 4140

gcacggcagc agaauaaaua ugagaacuac agcaccagcu ucuucaucag ggacaucauc 4200

aaaccagacc cgcccaagaa cuugcagaug aagccuuuga agaacucaca gguggagguc 4260

agcugggagu acccugacuc cuggagcacu ccccauuccu acuucucccu caaguucuuu 4320

guucgaaucc agcgcaagaa agaaaagaug aaggagacag aggaggggug uaaccagaaa 4380

ggugcguucc ucguagagaa gacaucuacc gaaguccaau gcaaaggcgg gaaugucugc 4440

gugcaagcuc aggaucgcua uuacaauucc ucgugcagca agugggcaug uguucccugc 4500

aggguccgau ccggaggugg cgguucuggc gguggaggga gcggaggcgg aggaucaagg 4560

gucauuccag ucucuggacc ugccaggugu cuuagccagu cccgaaaccu gcugaagacc 4620

acagaugaca uggugaagac ggccagagaa aaacugaaac auuauuccug cacugcugaa 4680

gacaucgauc augaagacau cacacgggac caaaccagca cauugaagac cuguuuacca 4740

cuggaacuac acaagaacga gaguugccug gcuacuagag agacuucuuc cacaacaaga 4800

gggagcugcc ugcccccaca gaagacgucu uugaugauga cccugugccu ugguagcauc 4860

uaugaggacu ugaagaugua ccagacagag uuccaggcca ucaacgcagc acuucagaau 4920

cacaaccauc agcagaucau ucuagacaag ggcaugcugg uggccaucga ugagcugaug 4980

cagucucuga aucauaaugg cgagacucug cgccagaaac cuccuguggg agaagcagac 5040

ccuuacagag ugaaaaugaa gcucugcauc cugcuucacg ccuucagcac ccgcgucgug 5100

accaucaaca gggugauggg cuaucugagc uccgccgagg gcagaggaag ucugcuaaca 5160

ugcggugacg ucgaggagaa ucccgggccu gcuucugaca acccaauuuu ggaguuucuu 5220

gaagcagaaa augaucuagu cacucuggcc ucucucugga agauggugca cucuguucaa 5280

cagaccugga gaaaguaugu gaagaacgau gauuuuuggc ccaauuuacu cagcgagcua 5340

gugggggaag gcucugucgc cuuggccgcc acgcuaucca accaagcuuc aguaaaggcu 5400

cuuuugggcc ugcacuuucu cucucggggg cucaauuaca cugacuuuua cucuuuacug 5460

auagagaaau gcucuaguuu cuuuaccgua gaaccaccuc cuccaccagc ugaaaaccug 5520

augaccaagc ccucagugaa gucgaaauuc cgaaaacugu uuaagaugca aggacccaug 5580

gacaaaguca aagacuggaa ccaaauagcu gccggcuuga agaauuuuca auuuguucgu 5640

gaccuaguca aagagguggu cgauuggcug caggccugga ucaacaaaga gaaagccagc 5700

ccuguccucc aguaccaguu ggagaugaag aagcucgggc cuguggccuu ggcucaugac 5760

gcuuucaugg cugguuccgg gcccccucuu agcgacgacc agauugaaua ccuccagaac 5820

cucaaaucuc uugcccuaac acuggggaag acuaauuugg cccaaagucu caccacuaug 5880

aucaaugcca aacaaaguuc agcccaacga guugaacccg uugugguggu ccuuagaggc 5940

aagccgggau gcggcaagag cuuggccucu acguugauug cccaggcugu guccaagcgc 6000

cucuauggcu cccaaagugu auauucucuu cccccagauc cagauuucuu cgauggauac 6060

aaaggacagu ucgugaccuu gauggaugau uugggacaaa acccggaugg acaagauuuc 6120

uccaccuuuu gucagauggu gucgaccgcc caauuucucc ccaacauggc ggaccuugca 6180

gagaaagggc gucccuuuac cuccaaucuc aucauugcaa cuacaaaucu cccccacuuc 6240

aguccuguca ccauugcuga uccuucugca gucucucgcc guaucaacua cgaucugacu 6300

cuagaaguau cugaggccua caagaaacac acacggcuga auuuugacuu ggcuuucagg 6360

cgcacagacg ccccccccau uuauccuuuu gcugcccaug ugcccuuugu ggacguagcu 6420

gugcgcuuca aaaaugguca ccagaauuuu aaucuccuag aguuggucga uuccauuugu 6480

acagacauuc gagccaagca acaaggugcc cgaaacaugc agacucuggu ucuacagagc 6540

cccaacgaga augaugacac ccccgucgac gaggcguugg guagaguucu cucccccgcu 6600

gcggucgaug aggcgcuugu cgaccucacu ccagaggccg acccgguugg ccguuuggcu 6660

auucuugcca agcuaggucu ugcccuagcu gcggucaccc cuggucugau aaucuuggca 6720

gugggacucu acagguacuu cucuggcucu gaugcagacc aagaagaaac agaaagugag 6780

ggaucuguca aggcacccag gagcgaaaau gcuuaugacg gcccgaagaa aaacucuaag 6840

cccccuggag cacucucucu cauggaaaug caacagccca acguggacau gggcuuugag 6900

gcugcggucg cuaagaaagu ggucgucccc auuaccuuca ugguucccaa cagaccuucu 6960

gggcuuacac aguccgcucu ucuggugacc ggccggaccu uccuaaucaa ugaacauaca 7020

ugguccaauc ccuccuggac cagcuucaca auccgcggug agguacacac ucgugaugag 7080

cccuuccaaa cgguucauuu cacucaccac gguauuccca cagaucugau gaugguacgu 7140

cucggaccgg gcaauucuuu cccuaacaau cuagacaagu uuggacuuga ccagaugccg 7200

gcacgcaacu cccguguggu uggcguuucg uccaguuacg gaaacuucuu cuucucugga 7260

aauuuccucg gauuuguuga uuccaucacc ucugaacaag gaacuuacgc aagacucuuu 7320

agguacaggg ugacgaccua caaaggaugg ugcggcucgg cccuggucug ugaggccggu 7380

ggcguccgac gcaucauugg ccugcauucu gcuggcgccg ccgguaucgg cgccgggacc 7440

uauaucucaa aauuaggacu aaucaaagcc cugaaacacc ucggugaacc uuuggccaca 7500

augcaaggac ugaugacuga auuagagccu ggaaucaccg uacauguacc ccggaaaucc 7560

aaauugagaa agacgaccgc acacgcggug uacaaaccgg aguuugagcc ugcuguguug 7620

ucaaaauuug aucccagacu gaacaaggau guugacuugg augaaguaau uuggucuaaa 7680

cacacugcca augucccuua ccaaccuccu uuguucuaca cauacauguc agaguacgcu 7740

caucgagucu ucuccuucuu ggggaaagac aaugacauuc ugaccgucaa agaagcaauu 7800

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gaugugcccu cccuggcgca uugcauugug ggcagaaugu ugcuugggcg cuuugcugcc 8100

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gauuuaaaga auuuggaagc caugcucucc uacuucaaac caggaacacu acucgagaag 8760

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uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240

ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

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aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200

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ggcacgcucg ugaccguaag ugcgggcucc acuagcgguu ccggcaaacc uggcagcgga 3960

gaaggcagca ccaaagggca gaucguccug acgcagucuc cagccaucau gagcgccuca 4020

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agcagcaugg aggcagaaga cgcagcuacc uauuacugcc agcaauggag cuuuaaccca 4260

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cugcggucac cccuggucug auaaucuugg cagugggacu cuacagguac uucucuggcu 6660

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ucgauuuugu gaacgguaca guagaugcgg cgcuggcugu acaaauccag aaauucuuag 7860

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agaaaguccg agcgggaaaa acccgcauug uugaugugcc cucccuggcg cauugcauug 7980

ugggcagaau guugcuuggg cgcuuugcug ccaaguuuca aucccauccu ggcuuucucc 8040

ucggcucugc uaucgggucu gacccugaug uuuucuggac cgucauaggg gcucaacucg 8100

aggggagaaa gaacacguau gacguggacu acagugccuu ugacucuuca cacggcacug 8160

gcuccuucga ggcucucauc ucucacuuuu ucaccgugga caaugguuuu agcccugcgc 8220

ugggaccgua ucucagaucc cuggcugucu cggugcacgc uuacggcgag cgucgcauca 8280

agauuaccgg uggccucccc uccgguugug ccgcgaccag ccugcugaac acagugcuca 8340

acaaugugau caucaggacu gcucuggcau ugacuuacaa ggaauuugaa uaugacaugg 8400

uugauaucau cgccuacggu gacgaccuuc ugguuggcac ggauuacgau cuggacuuca 8460

augagguggc acgacgcgcu gccaaguugg gguauaagau gacuccugcc aacaaggguu 8520

cugucuuccc uccgacuucc ucucuuuccg augcuguuuu ucuaaagcgc aaauucgucc 8580

aaaacaacga cggcuuauac aaaccaguua uggauuuaaa gaauuuggaa gccaugcucu 8640

ccuacuucaa accaggaaca cuacucgaga agcugcaauc uguuucuaug uuggcucaac 8700

auucuggaaa agaagaauau gauagauuga ugcaccccuu cgcugacuac ggugccguac 8760

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ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180

uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240

ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360

aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420

gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480

acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540

gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600

gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660

acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720

accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780

ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840

aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900

caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960

augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020

ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080

uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140

aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200

ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260

agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320

aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380

uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440

uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500

ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560

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uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980

acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040

gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100

uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160

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augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400

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acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120

gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180

cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240

ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300

cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360

gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420

gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480

ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug aacccaagug cugccgucau uuucugccuc 3540

auccugcugg gucugagugg gacucaaggg aucccucucg caaggacggu ccgcugcaac 3600

ugcauccaua ucgaugacgg gccagugaga augagggcca uagggaagcu ugaaaucauc 3660

ccugcgagcc uauccugccc acguguugag aucauugcca cgaugaaaaa gaaugaugag 3720

cagagauguc ugaauccgga aucuaagacc aucaagaauu uaaugaaagc guuuagccaa 3780

aaaaggucua aaagggcucc ugagggcaga ggaagucugc uaacaugcgg ugacgucgag 3840

gagaaucccg ggccugcuuc ugacaaccca auuuuggagu uucuugaagc agaaaaugau 3900

cuagucacuc uggccucucu cuggaagaug gugcacucug uucaacagac cuggagaaag 3960

uaugugaaga acgaugauuu uuggcccaau uuacucagcg agcuaguggg ggaaggcucu 4020

gucgccuugg ccgccacgcu auccaaccaa gcuucaguaa aggcucuuuu gggccugcac 4080

uuucucucuc gggggcucaa uuacacugac uuuuacucuu uacugauaga gaaaugcucu 4140

aguuucuuua ccguagaacc accuccucca ccagcugaaa accugaugac caagcccuca 4200

gugaagucga aauuccgaaa acuguuuaag augcaaggac ccauggacaa agucaaagac 4260

uggaaccaaa uagcugccgg cuugaagaau uuucaauuug uucgugaccu agucaaagag 4320

guggucgauu ggcugcaggc cuggaucaac aaagagaaag ccagcccugu ccuccaguac 4380

caguuggaga ugaagaagcu cgggccugug gccuuggcuc augacgcuuu cauggcuggu 4440

uccgggcccc cucuuagcga cgaccagauu gaauaccucc agaaccucaa aucucuugcc 4500

cuaacacugg ggaagacuaa uuuggcccaa agucucacca cuaugaucaa ugccaaacaa 4560

aguucagccc aacgaguuga acccguugug gugguccuua gaggcaagcc gggaugcggc 4620

aagagcuugg ccucuacguu gauugcccag gcugugucca agcgccucua uggcucccaa 4680

aguguauauu cucuuccccc agauccagau uucuucgaug gauacaaagg acaguucgug 4740

accuugaugg augauuuggg acaaaacccg gauggacaag auuucuccac cuuuugucag 4800

auggugucga ccgcccaauu ucuccccaac auggcggacc uugcagagaa agggcguccc 4860

uuuaccucca aucucaucau ugcaacuaca aaucuccccc acuucagucc ugucaccauu 4920

gcugauccuu cugcagucuc ucgccguauc aacuacgauc ugacucuaga aguaucugag 4980

gccuacaaga aacacacacg gcugaauuuu gacuuggcuu ucaggcgcac agacgccccc 5040

cccauuuauc cuuuugcugc ccaugugccc uuuguggacg uagcugugcg cuucaaaaau 5100

ggucaccaga auuuuaaucu ccuagaguug gucgauucca uuuguacaga cauucgagcc 5160

aagcaacaag gugcccgaaa caugcagacu cugguucuac agagccccaa cgagaaugau 5220

gacacccccg ucgacgaggc guuggguaga guucucuccc ccgcugcggu cgaugaggcg 5280

cuugucgacc ucacuccaga ggccgacccg guuggccguu uggcuauucu ugccaagcua 5340

ggucuugccc uagcugcggu caccccuggu cugauaaucu uggcaguggg acucuacagg 5400

uacuucucug gcucugaugc agaccaagaa gaaacagaaa gugagggauc ugucaaggca 5460

cccaggagcg aaaaugcuua ugacggcccg aagaaaaacu cuaagccccc uggagcacuc 5520

ucucucaugg aaaugcaaca gcccaacgug gacaugggcu uugaggcugc ggucgcuaag 5580

aaaguggucg uccccauuac cuucaugguu cccaacagac cuucugggcu uacacagucc 5640

gcucuucugg ugaccggccg gaccuuccua aucaaugaac auacaugguc caaucccucc 5700

uggaccagcu ucacaauccg cggugaggua cacacucgug augagcccuu ccaaacgguu 5760

cauuucacuc accacgguau ucccacagau cugaugaugg uacgucucgg accgggcaau 5820

ucuuucccua acaaucuaga caaguuugga cuugaccaga ugccggcacg caacucccgu 5880

gugguuggcg uuucguccag uuacggaaac uucuucuucu cuggaaauuu ccucggauuu 5940

guugauucca ucaccucuga acaaggaacu uacgcaagac ucuuuaggua cagggugacg 6000

accuacaaag gauggugcgg cucggcccug gucugugagg ccgguggcgu ccgacgcauc 6060

auuggccugc auucugcugg cgccgccggu aucggcgccg ggaccuauau cucaaaauua 6120

ggacuaauca aagcccugaa acaccucggu gaaccuuugg ccacaaugca aggacugaug 6180

acugaauuag agccuggaau caccguacau guaccccgga aauccaaauu gagaaagacg 6240

accgcacacg cgguguacaa accggaguuu gagccugcug uguugucaaa auuugauccc 6300

agacugaaca aggauguuga cuuggaugaa guaauuuggu cuaaacacac ugccaauguc 6360

ccuuaccaac cuccuuuguu cuacacauac augucagagu acgcucaucg agucuucucc 6420

uucuugggga aagacaauga cauucugacc gucaaagaag caauucuggg cauccccgga 6480

cuagacccca uggaucccca cacagcuccg ggucugccuu acgccaucaa cggccuucga 6540

cguacugauc ucgucgauuu ugugaacggu acaguagaug cggcgcuggc uguacaaauc 6600

cagaaauucu uagacgguga cuacucugac caugucuucc aaacuuuucu gaaagaugag 6660

aucagacccu cagagaaagu ccgagcggga aaaacccgca uuguugaugu gcccucccug 6720

gcgcauugca uugugggcag aauguugcuu gggcgcuuug cugccaaguu ucaaucccau 6780

ccuggcuuuc uccucggcuc ugcuaucggg ucugacccug auguuuucug gaccgucaua 6840

ggggcucaac ucgaggggag aaagaacacg uaugacgugg acuacagugc cuuugacucu 6900

ucacacggca cuggcuccuu cgaggcucuc aucucucacu uuuucaccgu ggacaauggu 6960

uuuagcccug cgcugggacc guaucucaga ucccuggcug ucucggugca cgcuuacggc 7020

gagcgucgca ucaagauuac cgguggccuc cccuccgguu gugccgcgac cagccugcug 7080

aacacagugc ucaacaaugu gaucaucagg acugcucugg cauugacuua caaggaauuu 7140

gaauaugaca ugguugauau caucgccuac ggugacgacc uucugguugg cacggauuac 7200

gaucuggacu ucaaugaggu ggcacgacgc gcugccaagu ugggguauaa gaugacuccu 7260

gccaacaagg guucugucuu cccuccgacu uccucucuuu ccgaugcugu uuuucuaaag 7320

cgcaaauucg uccaaaacaa cgacggcuua uacaaaccag uuauggauuu aaagaauuug 7380

gaagccaugc ucuccuacuu caaaccagga acacuacucg agaagcugca aucuguuucu 7440

auguuggcuc aacauucugg aaaagaagaa uaugauagau ugaugcaccc cuucgcugac 7500

uacggugccg uaccgaguca cgaguaccug caggcaagau ggagggccuu guucgacuga 7560

cccagauagc ccaaggcgcu ucggugcugc cggcgauucu gggagaacuc agucggaaca 7620

gaaaagggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 7658

<210> 11

<211> 7871

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-hIL36构建体

<400> 11

uuugaaaugg ggggcugggc ccugaugccc aguccuuccu uuccccuucc gggggguuaa 60

ccggcugugu uugcuagagg cacagagggg caacauccaa ccugcuuuug cggggaacgg 120

ugcggcuccg auuccugcgu cgccaaaggu guuagcgcac ccaaacggcg caccuaccaa 180

uguuauuggu guggucugcg aguucuagcc uacucguuuc ucccccgacc auucacucac 240

ccacgaaaag uguguuguaa ccauaagauu uaacccccgc acgggaugug cgauaaccgu 300

aagacuggcu caagcgcgga aagcgcugua accacaugcu guuagucccu uuauggcugc 360

aagauggcua cccaccucgg aucacugaac uggagcucga cccuccuuag uaagggaacc 420

gagaggccuu cgugcaacaa gcuccgacac agaguccacg ugacugcuac caccaugagu 480

acaugguucu ccccucucga cccaggacuu cuuuuugaau auccacggcu cgauccagag 540

gguggggcau gaccccuagc auagcgagcu acagcgggaa cuguagcuag gccuuagcgu 600

gccuuggaua cugccugaua gggcgacggc cuagucgugu cgguucuaua gguagcacau 660

acaaauaugc agaacucuca uuuuucuuuc gauacagccu cuggcaccuu ugaagaugua 720

accggaacaa aagucaagau cguugaauac cccagaucgg ugaacaaugg uguuuacgau 780

ucgucuacuc auuuggagau acugaaccua cagggugaaa uugaaauuuu aaggucuuuc 840

aaugaauacc aaauucgcgc cgccaaacaa caacucggac uggacaucgu guacgaacua 900

caggguaaug uucagacaac gucaaagaau gauuuugauu cccguggcaa uaaugguaac 960

augaccuuca auuacuacgc aaacacuuau cagaauucag uagacuucuc gaccuccucg 1020

ucggcgucag gcgccggacc ugggaacucu cggggcggau uagcgggucu ccucacaaau 1080

uucaguggaa ucuugaaccc ucuuggcuac cucaaagauc acaacaccga agaaauggaa 1140

aacucugcug aucgagucac aacgcaaacg gcgggcaaca cugccauaaa cacgcaauca 1200

ucauugggug uguugugugc cuacguugaa gacccgacca aaucugaucc uccguccagc 1260

agcacagauc aacccaccac cacuuucacu gccaucgaca ggugguacac uggacgucuc 1320

aauucuugga caaaagcugu aaaaaccuuc ucuuuucagg ccgucccgcu ucccggugcc 1380

uuucugucua ggcagggagg ccucaacgga ggggccuuca cagcuacccu acauagacac 1440

uuuuugauga agugcgggug gcaggugcag guccaaugua auuugacaca auuccaccaa 1500

ggcgcucuuc uuguugccau gguuccugaa accacccuug augucaagcc cgacgguaag 1560

gcaaagagcu uacaggagcu gaaugaagaa cagugggugg aaaugucuga cgauuaccgg 1620

accgggaaaa acaugccuuu ucagucucuu ggcacauacu aucggccccc uaacuggacu 1680

ugggguccca auuucaucaa ccccuaucaa guaacgguuu ucccacacca aauucugaac 1740

gcgagaaccu cuaccucggu agacauaaac gucccauaca ucggggagac ccccacgcaa 1800

uccucagaga cacagaacuc cuggacccuc cucguuaugg ugcucguucc ccuagacuau 1860

aaggaaggag ccacaacuga cccagaaauu acauuuucug uaaggccuac aagucccuac 1920

uucaaugggc uucgcaaccg cuacacggcc gggacggacg aagaacaggg gcccauuccu 1980

acggcaccca gagaaaauuc gcuuauguuu cucucaaccc ucccugacga cacugucccu 2040

gcuuacggga augugcguac cccuccuguc aauuaccucc cuggugaaau aaccgaccuu 2100

uugcaacugg cccgcauacc cacucucaug gcauuugagc gggugccuga acccgugccu 2160

gccucagaca cauaugugcc cuacguugcc guucccaccc aguucgauga caggccucuc 2220

aucuccuucc cgaucacccu uucagauccc gucuaucaga acacccuggu uggcgccauc 2280

aguucaaauu ucgccaauua ccgugggugu auccaaauca cucugacauu uuguggaccc 2340

augauggcga gagggaaauu ccugcucucg uauucucccc caaauggaac gcaaccacag 2400

acucuuuccg aagcuaugca gugcacauac ucuauuuggg acauaggcuu gaacucuagu 2460

uggaccuucg ucguccccua caucucgccc agugacuacc gugaaacucg agccauuacc 2520

aacucgguuu acuccgcuga ugguugguuu agccugcaca aguugaccaa aauuacucua 2580

ccaccugacu guccgcaaag ucccugcauu cucuuuuucg cuucugcugg ugaggauuac 2640

acucuccguc uccccguuga uuguaauccu uccuaugugu uccacuccac cgacaacgcc 2700

gagaccgggg uuauugaggc ggguaacacu gacaccgauu ucucugguga acuggcggcu 2760

ccuggcucua accacacuaa ugucaaguuc cuguuugauc gaucucgauu auugaaugua 2820

aucaagguac uggagaagga cgccguuuuc ccccgcccuu ucccuacaca agaaggugcg 2880

cagcaggaug augguuacuu uugucuucug accccccgcc caacagucgc uucccgaccc 2940

gccacucguu ucggccugua cgccaauccg uccggcagug guguucuugc uaacacuuca 3000

cuggacuuca auuuuuauag cuuggccugu uucacuuacu uuagaucgga ccuugagguu 3060

acgguggucu cacuagagcc ggaucuggaa uuugcuguag ggugguuucc uucuggcagu 3120

gaauaccagg cuuccagcuu ugucuacgac cagcugcaug ugcccuucca cuuuacuggg 3180

cgcacucccc gcgcuuucgc uagcaagggu gggaagguau cuuucgugcu cccuuggaac 3240

ucugucucgu cugugcuccc cgugcgcugg gggggggcuu ccaagcucuc uucugcuacg 3300

cggggucuac cggcgcaugc ugauuggggg acuauuuacg ccuuuguccc ccguccuaau 3360

gagaagaaaa gcaccgcugu aaaacacgug gccguguaca uucgguacaa gaacgcacgu 3420

gccuggugcc ccagcaugcu ucccuuucgc agcuacaagc agaagaugcu gaugcaaucu 3480

ggcgauaucg agaccaaucc cgggccgaug agaggcacuc caggagacgc ugauggugga 3540

ggaagggccg ucuaucaauc aauguguaaa ccuauuacug ggacuauuaa ugauuugaau 3600

cagcaagugu ggacccuuca gggucagaac cuuguggcag uuccacgaag ugacagugug 3660

accccaguca cuguugcugu uaucacaugc aaguauccag aggcucuuga gcaaggcaga 3720

ggggauccca uuuauuuggg aauccagaau ccagaaaugu guuuguauug ugagaagguu 3780

ggagaacagc ccacauugca gcuaaaagag cagaagauca uggaucugua uggccaaccc 3840

gagcccguga aacccuuccu uuucuaccgu gccaagacug guaggaccuc cacccuugag 3900

ucuguggccu ucccggacug guucauugcc uccuccaaga gagaccagcc caucauucug 3960

acuucagaac uugggaaguc auacaacacu gccuuugaau uaaauauaaa ugacgagggc 4020

agaggaaguc ugcuaacaug cggugacguc gaggagaauc ccgggccugc uucugacaac 4080

ccaauuuugg aguuucuuga agcagaaaau gaucuaguca cucuggccuc ucucuggaag 4140

auggugcacu cuguucaaca gaccuggaga aaguauguga agaacgauga uuuuuggccc 4200

aauuuacuca gcgagcuagu gggggaaggc ucugucgccu uggccgccac gcuauccaac 4260

caagcuucag uaaaggcucu uuugggccug cacuuucucu cucgggggcu caauuacacu 4320

gacuuuuacu cuuuacugau agagaaaugc ucuaguuucu uuaccguaga accaccuccu 4380

ccaccagcug aaaaccugau gaccaagccc ucagugaagu cgaaauuccg aaaacuguuu 4440

aagaugcaag gacccaugga caaagucaaa gacuggaacc aaauagcugc cggcuugaag 4500

aauuuucaau uuguucguga ccuagucaaa gagguggucg auuggcugca ggccuggauc 4560

aacaaagaga aagccagccc uguccuccag uaccaguugg agaugaagaa gcucgggccu 4620

guggccuugg cucaugacgc uuucauggcu gguuccgggc ccccucuuag cgacgaccag 4680

auugaauacc uccagaaccu caaaucucuu gcccuaacac uggggaagac uaauuuggcc 4740

caaagucuca ccacuaugau caaugccaaa caaaguucag cccaacgagu ugaacccguu 4800

gugguggucc uuagaggcaa gccgggaugc ggcaagagcu uggccucuac guugauugcc 4860

caggcugugu ccaagcgccu cuauggcucc caaaguguau auucucuucc cccagaucca 4920

gauuucuucg auggauacaa aggacaguuc gugaccuuga uggaugauuu gggacaaaac 4980

ccggauggac aagauuucuc caccuuuugu cagauggugu cgaccgccca auuucucccc 5040

aacauggcgg accuugcaga gaaagggcgu cccuuuaccu ccaaucucau cauugcaacu 5100

acaaaucucc cccacuucag uccugucacc auugcugauc cuucugcagu cucucgccgu 5160

aucaacuacg aucugacucu agaaguaucu gaggccuaca agaaacacac acggcugaau 5220

uuugacuugg cuuucaggcg cacagacgcc ccccccauuu auccuuuugc ugcccaugug 5280

cccuuugugg acguagcugu gcgcuucaaa aauggucacc agaauuuuaa ucuccuagag 5340

uuggucgauu ccauuuguac agacauucga gccaagcaac aaggugcccg aaacaugcag 5400

acucugguuc uacagagccc caacgagaau gaugacaccc ccgucgacga ggcguugggu 5460

agaguucucu cccccgcugc ggucgaugag gcgcuugucg accucacucc agaggccgac 5520

ccgguuggcc guuuggcuau ucuugccaag cuaggucuug cccuagcugc ggucaccccu 5580

ggucugauaa ucuuggcagu gggacucuac agguacuucu cuggcucuga ugcagaccaa 5640

gaagaaacag aaagugaggg aucugucaag gcacccagga gcgaaaaugc uuaugacggc 5700

ccgaagaaaa acucuaagcc cccuggagca cucucucuca uggaaaugca acagcccaac 5760

guggacaugg gcuuugaggc ugcggucgcu aagaaagugg ucguccccau uaccuucaug 5820

guucccaaca gaccuucugg gcuuacacag uccgcucuuc uggugaccgg ccggaccuuc 5880

cuaaucaaug aacauacaug guccaauccc uccuggacca gcuucacaau ccgcggugag 5940

guacacacuc gugaugagcc cuuccaaacg guucauuuca cucaccacgg uauucccaca 6000

gaucugauga ugguacgucu cggaccgggc aauucuuucc cuaacaaucu agacaaguuu 6060

ggacuugacc agaugccggc acgcaacucc cgugugguug gcguuucguc caguuacgga 6120

aacuucuucu ucucuggaaa uuuccucgga uuuguugauu ccaucaccuc ugaacaagga 6180

acuuacgcaa gacucuuuag guacagggug acgaccuaca aaggauggug cggcucggcc 6240

cuggucugug aggccggugg cguccgacgc aucauuggcc ugcauucugc uggcgccgcc 6300

gguaucggcg ccgggaccua uaucucaaaa uuaggacuaa ucaaagcccu gaaacaccuc 6360

ggugaaccuu uggccacaau gcaaggacug augacugaau uagagccugg aaucaccgua 6420

cauguacccc ggaaauccaa auugagaaag acgaccgcac acgcggugua caaaccggag 6480

uuugagccug cuguguuguc aaaauuugau cccagacuga acaaggaugu ugacuuggau 6540

gaaguaauuu ggucuaaaca cacugccaau gucccuuacc aaccuccuuu guucuacaca 6600

uacaugucag aguacgcuca ucgagucuuc uccuucuugg ggaaagacaa ugacauucug 6660

accgucaaag aagcaauucu gggcaucccc ggacuagacc ccauggaucc ccacacagcu 6720

ccgggucugc cuuacgccau caacggccuu cgacguacug aucucgucga uuuugugaac 6780

gguacaguag augcggcgcu ggcuguacaa auccagaaau ucuuagacgg ugacuacucu 6840

gaccaugucu uccaaacuuu ucugaaagau gagaucagac ccucagagaa aguccgagcg 6900

ggaaaaaccc gcauuguuga ugugcccucc cuggcgcauu gcauuguggg cagaauguug 6960

cuugggcgcu uugcugccaa guuucaaucc cauccuggcu uucuccucgg cucugcuauc 7020

gggucugacc cugauguuuu cuggaccguc auaggggcuc aacucgaggg gagaaagaac 7080

acguaugacg uggacuacag ugccuuugac ucuucacacg gcacuggcuc cuucgaggcu 7140

cucaucucuc acuuuuucac cguggacaau gguuuuagcc cugcgcuggg accguaucuc 7200

agaucccugg cugucucggu gcacgcuuac ggcgagcguc gcaucaagau uaccgguggc 7260

cuccccuccg guugugccgc gaccagccug cugaacacag ugcucaacaa ugugaucauc 7320

aggacugcuc uggcauugac uuacaaggaa uuugaauaug acaugguuga uaucaucgcc 7380

uacggugacg accuucuggu uggcacggau uacgaucugg acuucaauga gguggcacga 7440

cgcgcugcca aguuggggua uaagaugacu ccugccaaca aggguucugu cuucccuccg 7500

acuuccucuc uuuccgaugc uguuuuucua aagcgcaaau ucguccaaaa caacgacggc 7560

uuauacaaac caguuaugga uuuaaagaau uuggaagcca ugcucuccua cuucaaacca 7620

ggaacacuac ucgagaagcu gcaaucuguu ucuauguugg cucaacauuc uggaaaagaa 7680

gaauaugaua gauugaugca ccccuucgcu gacuacggug ccguaccgag ucacgaguac 7740

cugcaggcaa gauggagggc cuuguucgac ugacccagau agcccaaggc gcuucggugc 7800

ugccggcgau ucugggagaa cucagucgga acagaaaagg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7860

aaaaaaaaaa a 7871

<210> 12

<211> 7540

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV IVT模板 - 5' HHR和3' HDV

<400> 12

ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 60

gcttggtacc ttatcaaact gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctttga 120

aatggggggc tgggccctga tgcccagtcc ttcctttccc cttccggggg gttaaccggc 180

tgtgtttgct agaggcacag aggggcaaca tccaacctgc ttttgcgggg aacggtgcgg 240

ctccgattcc tgcgtcgcca aaggtgttag cgcacccaaa cggcgcacct accaatgtta 300

ttggtgtggt ctgcgagttc tagcctactc gtttctcccc cgaccattca ctcacccacg 360

aaaagtgtgt tgtaaccata agatttaacc cccgcacggg atgtgcgata accgtaagac 420

tggctcaagc gcggaaagcg ctgtaaccac atgctgttag tccctttatg gctgcaagat 480

ggctacccac ctcggatcac tgaactggag ctcgaccctc cttagtaagg gaaccgagag 540

gccttcgtgc aacaagctcc gacacagagt ccacgtgact gctaccacca tgagtacatg 600

gttctcccct ctcgacccag gacttctttt tgaatatcca cggctcgatc cagagggtgg 660

ggcatgaccc ctagcatagc gagctacagc gggaactgta gctaggcctt agcgtgcctt 720

ggatactgcc tgatagggcg acggcctagt cgtgtcggtt ctataggtag cacatacaaa 780

tatgcagaac tctcattttt ctttcgatac agcctctggc acctttgaag atgtaaccgg 840

aacaaaagtc aagatcgttg aataccccag atcggtgaac aatggtgttt acgattcgtc 900

tactcatttg gagatactga acctacaggg tgaaattgaa attttaaggt ctttcaatga 960

ataccaaatt cgcgccgcca aacaacaact cggactggac atcgtgtacg aactacaggg 1020

taatgttcag acaacgtcaa agaatgattt tgattcccgt ggcaataatg gtaacatgac 1080

cttcaattac tacgcaaaca cttatcagaa ttcagtagac ttctcgacct cctcgtcggc 1140

gtcaggcgcc ggacctggga actctcgggg cggattagcg ggtctcctca caaatttcag 1200

tggaatcttg aaccctcttg gctacctcaa agatcacaac accgaagaaa tggaaaactc 1260

tgctgatcga gtcacaacgc aaacggcggg caacactgcc ataaacacgc aatcatcatt 1320

gggtgtgttg tgtgcctacg ttgaagaccc gaccaaatct gatcctccgt ccagcagcac 1380

agatcaaccc accaccactt tcactgccat cgacaggtgg tacactggac gtctcaattc 1440

ttggacaaaa gctgtaaaaa ccttctcttt tcaggccgtc ccgcttcccg gtgcctttct 1500

gtctaggcag ggaggcctca acggaggggc cttcacagct accctacata gacacttttt 1560

gatgaagtgc gggtggcagg tgcaggtcca atgtaatttg acacaattcc accaaggcgc 1620

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gagcttacag gagctgaatg aagaacagtg ggtggaaatg tctgacgatt accggaccgg 1740

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<220>

<223> SVV-177A突变体IVT模板 - 5' HHR和3' HDV

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-WT IVT模板 - 5'手枪1和3' SapI

<400> 14

ttatcgaaat taatacgact cactataggg cgtcatagta ggaagtattg ggttgggaag 60

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<211> 7455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> SVV手枪2-SapI IVT模板

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ttatcgaaat taatacgact cactataggg cgtcatagta ggaagtattg ggttgggaag 60

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<223> SVV-HHRS-SapI IVT模板

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ccgtgtggtt ggcgtttcgt ccagttacgg aaacttcttc ttctctggaa atttcctcgg 6180

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gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcct 8017

<210> 22

<211> 9258

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-mIL-12 IVT模板

<400> 22

ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 60

gcttggtacc ttatcaaact gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctttga 120

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tatgcagaac tctcattttt ctttcgatac agcctctggc acctttgaag atgtaaccgg 840

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tatcgagacc aatcccgggc cgatgtgtcc tcagaagcta accatctcct ggtttgccat 3660

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tccagtctct ggacctgcca ggtgtcttag ccagtcccga aacctgctga agaccacaga 4740

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ggaaggctct gtcgccttgg ccgccacgct atccaaccaa gcttcagtaa aggctctttt 5520

gggcctgcac tttctctctc gggggctcaa ttacactgac ttttactctt tactgataga 5580

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cattcgagcc aagcaacaag gtgcccgaaa catgcagact ctggttctac agagccccaa 6660

cgagaatgat gacacccccg tcgacgaggc gttgggtaga gttctctccc ccgctgcggt 6720

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tcccgggcct gcttctgaca acccaatttt ggagtttctt gaagcagaaa atgatctagt 4020

cactctggcc tctctctgga agatggtgca ctctgttcaa cagacctgga gaaagtatgt 4080

gaagaacgat gatttttggc ccaatttact cagcgagcta gtgggggaag gctctgtcgc 4140

cttggccgcc acgctatcca accaagcttc agtaaaggct cttttgggcc tgcactttct 4200

ctctcggggg ctcaattaca ctgactttta ctctttactg atagagaaat gctctagttt 4260

ctttaccgta gaaccacctc ctccaccagc tgaaaacctg atgaccaagc cctcagtgaa 4320

gtcgaaattc cgaaaactgt ttaagatgca aggacccatg gacaaagtca aagactggaa 4380

ccaaatagct gccggcttga agaattttca atttgttcgt gacctagtca aagaggtggt 4440

cgattggctg caggcctgga tcaacaaaga gaaagccagc cctgtcctcc agtaccagtt 4500

ggagatgaag aagctcgggc ctgtggcctt ggctcatgac gctttcatgg ctggttccgg 4560

gccccctctt agcgacgacc agattgaata cctccagaac ctcaaatctc ttgccctaac 4620

actggggaag actaatttgg cccaaagtct caccactatg atcaatgcca aacaaagttc 4680

agcccaacga gttgaacccg ttgtggtggt ccttagaggc aagccgggat gcggcaagag 4740

cttggcctct acgttgattg cccaggctgt gtccaagcgc ctctatggct cccaaagtgt 4800

atattctctt cccccagatc cagatttctt cgatggatac aaaggacagt tcgtgacctt 4860

gatggatgat ttgggacaaa acccggatgg acaagatttc tccacctttt gtcagatggt 4920

gtcgaccgcc caatttctcc ccaacatggc ggaccttgca gagaaagggc gtccctttac 4980

ctccaatctc atcattgcaa ctacaaatct cccccacttc agtcctgtca ccattgctga 5040

tccttctgca gtctctcgcc gtatcaacta cgatctgact ctagaagtat ctgaggccta 5100

caagaaacac acacggctga attttgactt ggctttcagg cgcacagacg ccccccccat 5160

ttatcctttt gctgcccatg tgccctttgt ggacgtagct gtgcgcttca aaaatggtca 5220

ccagaatttt aatctcctag agttggtcga ttccatttgt acagacattc gagccaagca 5280

acaaggtgcc cgaaacatgc agactctggt tctacagagc cccaacgaga atgatgacac 5340

ccccgtcgac gaggcgttgg gtagagttct ctcccccgct gcggtcgatg aggcgcttgt 5400

cgacctcact ccagaggccg acccggttgg ccgtttggct attcttgcca agctaggtct 5460

tgccctagct gcggtcaccc ctggtctgat aatcttggca gtgggactct acaggtactt 5520

ctctggctct gatgcagacc aagaagaaac agaaagtgag ggatctgtca aggcacccag 5580

gagcgaaaat gcttatgacg gcccgaagaa aaactctaag ccccctggag cactctctct 5640

catggaaatg caacagccca acgtggacat gggctttgag gctgcggtcg ctaagaaagt 5700

ggtcgtcccc attaccttca tggttcccaa cagaccttct gggcttacac agtccgctct 5760

tctggtgacc ggccggacct tcctaatcaa tgaacataca tggtccaatc cctcctggac 5820

cagcttcaca atccgcggtg aggtacacac tcgtgatgag cccttccaaa cggttcattt 5880

cactcaccac ggtattccca cagatctgat gatggtacgt ctcggaccgg gcaattcttt 5940

ccctaacaat ctagacaagt ttggacttga ccagatgccg gcacgcaact cccgtgtggt 6000

tggcgtttcg tccagttacg gaaacttctt cttctctgga aatttcctcg gatttgttga 6060

ttccatcacc tctgaacaag gaacttacgc aagactcttt aggtacaggg tgacgaccta 6120

caaaggatgg tgcggctcgg ccctggtctg tgaggccggt ggcgtccgac gcatcattgg 6180

cctgcattct gctggcgccg ccggtatcgg cgccgggacc tatatctcaa aattaggact 6240

aatcaaagcc ctgaaacacc tcggtgaacc tttggccaca atgcaaggac tgatgactga 6300

attagagcct ggaatcaccg tacatgtacc ccggaaatcc aaattgagaa agacgaccgc 6360

acacgcggtg tacaaaccgg agtttgagcc tgctgtgttg tcaaaatttg atcccagact 6420

gaacaaggat gttgacttgg atgaagtaat ttggtctaaa cacactgcca atgtccctta 6480

ccaacctcct ttgttctaca catacatgtc agagtacgct catcgagtct tctccttctt 6540

ggggaaagac aatgacattc tgaccgtcaa agaagcaatt ctgggcatcc ccggactaga 6600

ccccatggat ccccacacag ctccgggtct gccttacgcc atcaacggcc ttcgacgtac 6660

tgatctcgtc gattttgtga acggtacagt agatgcggcg ctggctgtac aaatccagaa 6720

attcttagac ggtgactact ctgaccatgt cttccaaact tttctgaaag atgagatcag 6780

accctcagag aaagtccgag cgggaaaaac ccgcattgtt gatgtgccct ccctggcgca 6840

ttgcattgtg ggcagaatgt tgcttgggcg ctttgctgcc aagtttcaat cccatcctgg 6900

ctttctcctc ggctctgcta tcgggtctga ccctgatgtt ttctggaccg tcataggggc 6960

tcaactcgag gggagaaaga acacgtatga cgtggactac agtgcctttg actcttcaca 7020

cggcactggc tccttcgagg ctctcatctc tcactttttc accgtggaca atggttttag 7080

ccctgcgctg ggaccgtatc tcagatccct ggctgtctcg gtgcacgctt acggcgagcg 7140

tcgcatcaag attaccggtg gcctcccctc cggttgtgcc gcgaccagcc tgctgaacac 7200

agtgctcaac aatgtgatca tcaggactgc tctggcattg acttacaagg aatttgaata 7260

tgacatggtt gatatcatcg cctacggtga cgaccttctg gttggcacgg attacgatct 7320

ggacttcaat gaggtggcac gacgcgctgc caagttgggg tataagatga ctcctgccaa 7380

caagggttct gtcttccctc cgacttcctc tctttccgat gctgtttttc taaagcgcaa 7440

attcgtccaa aacaacgacg gcttatacaa accagttatg gatttaaaga atttggaagc 7500

catgctctcc tacttcaaac caggaacact actcgagaag ctgcaatctg tttctatgtt 7560

ggctcaacat tctggaaaag aagaatatga tagattgatg caccccttcg ctgactacgg 7620

tgccgtaccg agtcacgagt acctgcaggc aagatggagg gccttgttcg actgacccag 7680

atagcccaag gcgcttcggt gctgccggcg attctgggag aactcagtcg gaacagaaaa 7740

gggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggccggc atggtcccag cctcctcgct 7800

ggcgccggct gggcaacatg cttcggcatg gcgaatggga cgcggccgct cgagtctaga 7860

gggcccgttt aaacccgctg atcagcct 7888

<210> 25

<211> 8101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SVV-hIL36 IVT模板

<400> 25

ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa 60

gcttggtacc ttatcaaact gatgagtccg tgaggacgaa acgagtaagc tcgtctttga 120

aatggggggc tgggccctga tgcccagtcc ttcctttccc cttccggggg gttaaccggc 180

tgtgtttgct agaggcacag aggggcaaca tccaacctgc ttttgcgggg aacggtgcgg 240

ctccgattcc tgcgtcgcca aaggtgttag cgcacccaaa cggcgcacct accaatgtta 300

ttggtgtggt ctgcgagttc tagcctactc gtttctcccc cgaccattca ctcacccacg 360

aaaagtgtgt tgtaaccata agatttaacc cccgcacggg atgtgcgata accgtaagac 420

tggctcaagc gcggaaagcg ctgtaaccac atgctgttag tccctttatg gctgcaagat 480

ggctacccac ctcggatcac tgaactggag ctcgaccctc cttagtaagg gaaccgagag 540

gccttcgtgc aacaagctcc gacacagagt ccacgtgact gctaccacca tgagtacatg 600

gttctcccct ctcgacccag gacttctttt tgaatatcca cggctcgatc cagagggtgg 660

ggcatgaccc ctagcatagc gagctacagc gggaactgta gctaggcctt agcgtgcctt 720

ggatactgcc tgatagggcg acggcctagt cgtgtcggtt ctataggtag cacatacaaa 780

tatgcagaac tctcattttt ctttcgatac agcctctggc acctttgaag atgtaaccgg 840

aacaaaagtc aagatcgttg aataccccag atcggtgaac aatggtgttt acgattcgtc 900

tactcatttg gagatactga acctacaggg tgaaattgaa attttaaggt ctttcaatga 960

ataccaaatt cgcgccgcca aacaacaact cggactggac atcgtgtacg aactacaggg 1020

taatgttcag acaacgtcaa agaatgattt tgattcccgt ggcaataatg gtaacatgac 1080

cttcaattac tacgcaaaca cttatcagaa ttcagtagac ttctcgacct cctcgtcggc 1140

gtcaggcgcc ggacctggga actctcgggg cggattagcg ggtctcctca caaatttcag 1200

tggaatcttg aaccctcttg gctacctcaa agatcacaac accgaagaaa tggaaaactc 1260

tgctgatcga gtcacaacgc aaacggcggg caacactgcc ataaacacgc aatcatcatt 1320

gggtgtgttg tgtgcctacg ttgaagaccc gaccaaatct gatcctccgt ccagcagcac 1380

agatcaaccc accaccactt tcactgccat cgacaggtgg tacactggac gtctcaattc 1440

ttggacaaaa gctgtaaaaa ccttctcttt tcaggccgtc ccgcttcccg gtgcctttct 1500

gtctaggcag ggaggcctca acggaggggc cttcacagct accctacata gacacttttt 1560

gatgaagtgc gggtggcagg tgcaggtcca atgtaatttg acacaattcc accaaggcgc 1620

tcttcttgtt gccatggttc ctgaaaccac ccttgatgtc aagcccgacg gtaaggcaaa 1680

gagcttacag gagctgaatg aagaacagtg ggtggaaatg tctgacgatt accggaccgg 1740

gaaaaacatg ccttttcagt ctcttggcac atactatcgg ccccctaact ggacttgggg 1800

tcccaatttc atcaacccct atcaagtaac ggttttccca caccaaattc tgaacgcgag 1860

aacctctacc tcggtagaca taaacgtccc atacatcggg gagaccccca cgcaatcctc 1920

agagacacag aactcctgga ccctcctcgt tatggtgctc gttcccctag actataagga 1980

aggagccaca actgacccag aaattacatt ttctgtaagg cctacaagtc cctacttcaa 2040

tgggcttcgc aaccgctaca cggccgggac ggacgaagaa caggggccca ttcctacggc 2100

acccagagaa aattcgctta tgtttctctc aaccctccct gacgacactg tccctgctta 2160

cgggaatgtg cgtacccctc ctgtcaatta cctccctggt gaaataaccg accttttgca 2220

actggcccgc atacccactc tcatggcatt tgagcgggtg cctgaacccg tgcctgcctc 2280

agacacatat gtgccctacg ttgccgttcc cacccagttc gatgacaggc ctctcatctc 2340

cttcccgatc accctttcag atcccgtcta tcagaacacc ctggttggcg ccatcagttc 2400

aaatttcgcc aattaccgtg ggtgtatcca aatcactctg acattttgtg gacccatgat 2460

ggcgagaggg aaattcctgc tctcgtattc tcccccaaat ggaacgcaac cacagactct 2520

ttccgaagct atgcagtgca catactctat ttgggacata ggcttgaact ctagttggac 2580

cttcgtcgtc ccctacatct cgcccagtga ctaccgtgaa actcgagcca ttaccaactc 2640

ggtttactcc gctgatggtt ggtttagcct gcacaagttg accaaaatta ctctaccacc 2700

tgactgtccg caaagtccct gcattctctt tttcgcttct gctggtgagg attacactct 2760

ccgtctcccc gttgattgta atccttccta tgtgttccac tccaccgaca acgccgagac 2820

cggggttatt gaggcgggta acactgacac cgatttctct ggtgaactgg cggctcctgg 2880

ctctaaccac actaatgtca agttcctgtt tgatcgatct cgattattga atgtaatcaa 2940

ggtactggag aaggacgccg ttttcccccg ccctttccct acacaagaag gtgcgcagca 3000

ggatgatggt tacttttgtc ttctgacccc ccgcccaaca gtcgcttccc gacccgccac 3060

tcgtttcggc ctgtacgcca atccgtccgg cagtggtgtt cttgctaaca cttcactgga 3120

cttcaatttt tatagcttgg cctgtttcac ttactttaga tcggaccttg aggttacggt 3180

ggtctcacta gagccggatc tggaatttgc tgtagggtgg tttccttctg gcagtgaata 3240

ccaggcttcc agctttgtct acgaccagct gcatgtgccc ttccacttta ctgggcgcac 3300

tccccgcgct ttcgctagca agggtgggaa ggtatctttc gtgctccctt ggaactctgt 3360

ctcgtctgtg ctccccgtgc gctggggggg ggcttccaag ctctcttctg ctacgcgggg 3420

tctaccggcg catgctgatt gggggactat ttacgccttt gtcccccgtc ctaatgagaa 3480

gaaaagcacc gctgtaaaac acgtggccgt gtacattcgg tacaagaacg cacgtgcctg 3540

gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta caagcagaag atgctgatgc aatctggcga 3600

tatcgagacc aatcccgggc cgatgagagg cactccagga gacgctgatg gtggaggaag 3660

ggccgtctat caatcaatgt gtaaacctat tactgggact attaatgatt tgaatcagca 3720

agtgtggacc cttcagggtc agaaccttgt ggcagttcca cgaagtgaca gtgtgacccc 3780

agtcactgtt gctgttatca catgcaagta tccagaggct cttgagcaag gcagagggga 3840

tcccatttat ttgggaatcc agaatccaga aatgtgtttg tattgtgaga aggttggaga 3900

acagcccaca ttgcagctaa aagagcagaa gatcatggat ctgtatggcc aacccgagcc 3960

cgtgaaaccc ttccttttct accgtgccaa gactggtagg acctccaccc ttgagtctgt 4020

ggccttcccg gactggttca ttgcctcctc caagagagac cagcccatca ttctgacttc 4080

agaacttggg aagtcataca acactgcctt tgaattaaat ataaatgacg agggcagagg 4140

aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcccggg cctgcttctg acaacccaat 4200

tttggagttt cttgaagcag aaaatgatct agtcactctg gcctctctct ggaagatggt 4260

gcactctgtt caacagacct ggagaaagta tgtgaagaac gatgattttt ggcccaattt 4320

actcagcgag ctagtggggg aaggctctgt cgccttggcc gccacgctat ccaaccaagc 4380

ttcagtaaag gctcttttgg gcctgcactt tctctctcgg gggctcaatt acactgactt 4440

ttactcttta ctgatagaga aatgctctag tttctttacc gtagaaccac ctcctccacc 4500

agctgaaaac ctgatgacca agccctcagt gaagtcgaaa ttccgaaaac tgtttaagat 4560

gcaaggaccc atggacaaag tcaaagactg gaaccaaata gctgccggct tgaagaattt 4620

tcaatttgtt cgtgacctag tcaaagaggt ggtcgattgg ctgcaggcct ggatcaacaa 4680

agagaaagcc agccctgtcc tccagtacca gttggagatg aagaagctcg ggcctgtggc 4740

cttggctcat gacgctttca tggctggttc cgggccccct cttagcgacg accagattga 4800

atacctccag aacctcaaat ctcttgccct aacactgggg aagactaatt tggcccaaag 4860

tctcaccact atgatcaatg ccaaacaaag ttcagcccaa cgagttgaac ccgttgtggt 4920

ggtccttaga ggcaagccgg gatgcggcaa gagcttggcc tctacgttga ttgcccaggc 4980

tgtgtccaag cgcctctatg gctcccaaag tgtatattct cttcccccag atccagattt 5040

cttcgatgga tacaaaggac agttcgtgac cttgatggat gatttgggac aaaacccgga 5100

tggacaagat ttctccacct tttgtcagat ggtgtcgacc gcccaatttc tccccaacat 5160

ggcggacctt gcagagaaag ggcgtccctt tacctccaat ctcatcattg caactacaaa 5220

tctcccccac ttcagtcctg tcaccattgc tgatccttct gcagtctctc gccgtatcaa 5280

ctacgatctg actctagaag tatctgaggc ctacaagaaa cacacacggc tgaattttga 5340

cttggctttc aggcgcacag acgccccccc catttatcct tttgctgccc atgtgccctt 5400

tgtggacgta gctgtgcgct tcaaaaatgg tcaccagaat tttaatctcc tagagttggt 5460

cgattccatt tgtacagaca ttcgagccaa gcaacaaggt gcccgaaaca tgcagactct 5520

ggttctacag agccccaacg agaatgatga cacccccgtc gacgaggcgt tgggtagagt 5580

tctctccccc gctgcggtcg atgaggcgct tgtcgacctc actccagagg ccgacccggt 5640

tggccgtttg gctattcttg ccaagctagg tcttgcccta gctgcggtca cccctggtct 5700

gataatcttg gcagtgggac tctacaggta cttctctggc tctgatgcag accaagaaga 5760

aacagaaagt gagggatctg tcaaggcacc caggagcgaa aatgcttatg acggcccgaa 5820

gaaaaactct aagccccctg gagcactctc tctcatggaa atgcaacagc ccaacgtgga 5880

catgggcttt gaggctgcgg tcgctaagaa agtggtcgtc cccattacct tcatggttcc 5940

caacagacct tctgggctta cacagtccgc tcttctggtg accggccgga ccttcctaat 6000

caatgaacat acatggtcca atccctcctg gaccagcttc acaatccgcg gtgaggtaca 6060

cactcgtgat gagcccttcc aaacggttca tttcactcac cacggtattc ccacagatct 6120

gatgatggta cgtctcggac cgggcaattc tttccctaac aatctagaca agtttggact 6180

tgaccagatg ccggcacgca actcccgtgt ggttggcgtt tcgtccagtt acggaaactt 6240

cttcttctct ggaaatttcc tcggatttgt tgattccatc acctctgaac aaggaactta 6300

cgcaagactc tttaggtaca gggtgacgac ctacaaagga tggtgcggct cggccctggt 6360

ctgtgaggcc ggtggcgtcc gacgcatcat tggcctgcat tctgctggcg ccgccggtat 6420

cggcgccggg acctatatct caaaattagg actaatcaaa gccctgaaac acctcggtga 6480

acctttggcc acaatgcaag gactgatgac tgaattagag cctggaatca ccgtacatgt 6540

accccggaaa tccaaattga gaaagacgac cgcacacgcg gtgtacaaac cggagtttga 6600

gcctgctgtg ttgtcaaaat ttgatcccag actgaacaag gatgttgact tggatgaagt 6660

aatttggtct aaacacactg ccaatgtccc ttaccaacct cctttgttct acacatacat 6720

gtcagagtac gctcatcgag tcttctcctt cttggggaaa gacaatgaca ttctgaccgt 6780

caaagaagca attctgggca tccccggact agaccccatg gatccccaca cagctccggg 6840

tctgccttac gccatcaacg gccttcgacg tactgatctc gtcgattttg tgaacggtac 6900

agtagatgcg gcgctggctg tacaaatcca gaaattctta gacggtgact actctgacca 6960

tgtcttccaa acttttctga aagatgagat cagaccctca gagaaagtcc gagcgggaaa 7020

aacccgcatt gttgatgtgc cctccctggc gcattgcatt gtgggcagaa tgttgcttgg 7080

gcgctttgct gccaagtttc aatcccatcc tggctttctc ctcggctctg ctatcgggtc 7140

tgaccctgat gttttctgga ccgtcatagg ggctcaactc gaggggagaa agaacacgta 7200

tgacgtggac tacagtgcct ttgactcttc acacggcact ggctccttcg aggctctcat 7260

ctctcacttt ttcaccgtgg acaatggttt tagccctgcg ctgggaccgt atctcagatc 7320

cctggctgtc tcggtgcacg cttacggcga gcgtcgcatc aagattaccg gtggcctccc 7380

ctccggttgt gccgcgacca gcctgctgaa cacagtgctc aacaatgtga tcatcaggac 7440

tgctctggca ttgacttaca aggaatttga atatgacatg gttgatatca tcgcctacgg 7500

tgacgacctt ctggttggca cggattacga tctggacttc aatgaggtgg cacgacgcgc 7560

tgccaagttg gggtataaga tgactcctgc caacaagggt tctgtcttcc ctccgacttc 7620

ctctctttcc gatgctgttt ttctaaagcg caaattcgtc caaaacaacg acggcttata 7680

caaaccagtt atggatttaa agaatttgga agccatgctc tcctacttca aaccaggaac 7740

actactcgag aagctgcaat ctgtttctat gttggctcaa cattctggaa aagaagaata 7800

tgatagattg atgcacccct tcgctgacta cggtgccgta ccgagtcacg agtacctgca 7860

ggcaagatgg agggccttgt tcgactgacc cagatagccc aaggcgcttc ggtgctgccg 7920

gcgattctgg gagaactcag tcggaacaga aaagggaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7980

aaaaaaggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgccg gctgggcaac atgcttcggc 8040

atggcgaatg ggacgcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc 8100

t 8101

<210> 26

<211> 713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 修饰的CVA21 5' UTR

<400> 26

ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60

attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120

aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180

ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240

acttcgagaa gcctagtatc accttggaat cttcgatgcg ttgcgctcaa cactctgccc 300

cgagtgtagc ttaggctgat gagtctgggc actccccacc ggcgacggtg gcccaggctg 360

cgttggcggc ctacccatgg ctgatgccgt gggacgctag ttgtgaacaa ggtgtgaaga 420

gcctattgag ctactcaaga gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct aaccacggag 480

caaccgctca caacccagtg agtaggttgt cgtaatgcgt aagtctgtgg cggaaccgac 540

tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600

aaattgttac catatagcta ttggattggc cacccagtat tgtgcaatat atttgagtgt 660

ttctttcata agccttatta acatcacatt tttaatcaca ataaacagtg caa 713

<210> 27

<211> 7435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 修饰的CVA21

<400> 27

ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60

attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120

aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180

ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240

acttcgagaa gcctagtatc accttggaat cttcgatgcg ttgcgctcaa cactctgccc 300

cgagtgtagc ttaggctgat gagtctgggc actccccacc ggcgacggtg gcccaggctg 360

cgttggcggc ctacccatgg ctgatgccgt gggacgctag ttgtgaacaa ggtgtgaaga 420

gcctattgag ctactcaaga gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct aaccacggag 480

caaccgctca caacccagtg agtaggttgt cgtaatgcgt aagtctgtgg cggaaccgac 540

tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600

aaattgttac catatagcta ttggattggc cacccagtat tgtgcaatat atttgagtgt 660

ttctttcata agccttatta acatcacatt tttaatcaca ataaacagtg caaatggggg 720

ctcaagtttc aacgcaaaag accggtgcgc acgagaatca aaacgtggca gccaatggat 780

ccaccattaa ttacactact atcaactatt acaaagacag tgcgagtaat tccgctacta 840

gacaagacct ctcccaagat ccatcaaaat tcacagaacc ggttaaggac ttaatgttga 900

aaacagcacc agctctaaac tcgcctaacg tggaagcatg tgggtacagt gaccgtgtga 960

ggcaaatcac tttaggcaac tcgactatta ctacacaaga agcagccaat gctattgttg 1020

cttacggtga atggcccact tacataaatg attcagaagc taatccggta gatgcaccca 1080

ctgagccaga cgttagtagc aaccggtttt acaccctaga atcggtgtct tggaagacca 1140

cttcaagggg atggtggtgg aagttaccag attgtttgaa ggacatggga atgtttggtc 1200

agaatatgta ctatcactac ttggggcgct ctggttacac cattcatgtc cagtgcaacg 1260

cttcaaaatt tcaccaaggg gcgttaggag tttttctgat accagagttt gtcatggctt 1320

gcaacactga gagtaaaacg tcatacgttt catacatcaa tgcaaatcct ggtgagagag 1380

gcggtgagtt tacgaacacc tacaatccgt caaatacaga cgccagtgag ggcagaaagt 1440

ttgcagcatt ggattatttg ctgggttctg gtgttctagc aggaaacgcc tttgtgtacc 1500

cgcaccagat catcaaccta cgtaccaaca acagtgcaac aattgtggtg ccatacgtaa 1560

actcacttgt gattgattgt atggcaaaac acaataactg gggcattgtc atattaccac 1620

tggcaccctt ggcctttgcc gcaacatcgt caccacaggt gcctattaca gtgaccattg 1680

cacccatgtg tacagaattc aatgggttga gaaacatcac cgtcccagta catcaagggt 1740

tgccgacaat gaacacacct ggttccaatc aattccttac atctgatgac ttccagtcgc 1800

cctgtgcctt acctaatttt gatgttactc caccaataca catacccggg gaagtaaaga 1860

atatgatgga actagctgaa attgacacat tgatcccaat gaacgcagtg gacgggaagg 1920

tgaacacaat ggagatgtat caaataccat tgaatgacaa tttgagcaag gcacctatat 1980

tctgtttatc cctatcacct gcttctgata aacgactgag ccgcaccatg ttgggtgaaa 2040

tcctaaatta ttacacccat tggacggggt ccatcaggtt cacctttcta ttttgtggta 2100

gtatgatggc cactggtaaa ctgctcctca gctattcccc accgggagct aaaccaccaa 2160

ccaatcgcaa ggatgcaatg ctaggcacac acatcatctg ggacctaggg ttacaatcca 2220

gttgttccat ggttgcaccg tggatctcca acacagtgta cagacggtgt gcacgtgatg 2280

acttcactga gggcggattt ataacttgct tctatcaaac tagaattgtg gtacctgctt 2340

caacccctac cagtatgttc atgttaggct ttgttagtgc gtgtccagac ttcagtgtca 2400

gactgcttag ggacactccc catattagtc aatcgaaact aataggacgt acacaaggca 2460

ttgaagacct cattgacaca gcgataaaga atgccttaag agtgtcccaa ccaccctcga 2520

cccagtcaac tgaagcaact agtggagtga atagccagga ggtgccagct ctaactgctg 2580

tggaaacagg agcatctggt caagcaatcc ccagtgatgt ggtggaaact aggcacgtgg 2640

taaattacaa aaccaggtct gaatcgtgtc ttgagtcatt ctttgggaga gctgcgtgtg 2700

tcacaatcct atccttgacc aactcctcca agagcggaga ggagaaaaag catttcaaca 2760

tatggaatat tacatacacc gacactgtcc agttacgcag aaaattagag tttttcacgt 2820

attccaggtt tgatcttgaa atgacttttg tattcacaga gaactatcct agtacagcca 2880

gtggagaagt gcgaaaccag gtgtaccaga tcatgtatat tccaccaggg gcaccccgcc 2940

catcatcctg ggatgactac acatggcaat cctcttcaaa cccttccatc ttctacatgt 3000

atggaaatgc acctccacgg atgtcaattc cttacgtagg gattgccaat gcctattcac 3060

acttctacga tggctttgca cgggtgccac ttgagggtga gaacaccgat gctggcgaca 3120

cgttttacgg tttagtgtcc ataaatgatt ttggagtttt agcagttaga gcagtaaacc 3180

gcagtaatcc acatacaata cacacatctg tgagagtgta catgaaacca aaacacattc 3240

ggtgttggtg ccccagacct cctcgagctg tattatacag gggagaggga gtggacatga 3300

tatccagtgc aattctacct ctgaccaagg tagactcaat taccactttt gggtttggtc 3360

atcagaacaa agcagtgtac gttgccggtt acaagatttg caactaccac ctagcaaccc 3420

caagtgatca cttgaatgca attagtatgt tatgggacag ggatttaatg gtggtggaat 3480

ctagagccca gggaactgat accatcgcca gatgtagttg caggtgtgga gtttactatt 3540

gtgaatctag gaggaagtac taccctgtca cttttactgg cccaacgttt cgattcatgg 3600

aagcaaacga ctactatcca gcaagatacc agtctcacat gctgataggg tgcggatttg 3660

cagaacccgg ggactgcggt gggatactga ggtgcactca tggggtaatt ggtatcatta 3720

ctgcaggagg tgaaggggta gtagcctttg ctgacattag agacctctgg gtgtatgaag 3780

aggaggccat ggaacaggga ataacaagct acatcgaatc tctcggcaca gcctttggcg 3840

cagggttcac ccacacaatc agtgagaaag tgactgaatt gacaacaatg gttaccagca 3900

ctatcacaga aaaactactg aaaaacttgg tgaaaatagt gtcggctcta gtgattgttg 3960

tgagaaatta tgaggacact accacgatcc ttgcaacact agcactactc gggtgtgata 4020

tatctccttg gcaatggttg aagaagaagg catgtgactt actagagatt ccttatgtga 4080

tgcgccaagg tgatgggtgg atgaagaaat tcacagaggc gtgcaatgca gctaaaggct 4140

tagagtggat tagcaacaaa atttccaagt ttatagattg gttgaagtgt aaaattatcc 4200

cagacgctaa ggacaaggtg gaatttctca ccaagttgaa acagctagac atgttggaaa 4260

atcaaattgc aaccatccac caatcttgcc ccagccaaga acaacaagag attcttttca 4320

acaatgtgag atggctagca gtccagtccc gtcggtttgc accattatac gctgtggagg 4380

cacgccgaat taacaaaatg gagagcacaa taaacaatta tatacagttc aagagcaaac 4440

accgtattga accagtatgt atgctcattc atgggtcacc agggacgggt aaatctatag 4500

ctacttcatt aataggtaga gcaatagcag agaaggaaag cacatcagtc tattcaatgc 4560

cacctgaccc atctcacttt gatggctata aacaacaagg ggtagtgatt atggacgacc 4620

taaaccaaaa ccccgatggt atggacatga aactgttttg ccaaatggta tcaacagtgg 4680

agtttattcc tccaatggcc tcattagagg agaagggcat tttgtttaca tctgattatg 4740

tcctggcttc taccaactct cattcaattg taccacccac agtggctcac agtgatgcct 4800

taaccagacg atttgcattt gatgtggagg tttacacgat gtctgaacat tcagtcaaag 4860

gcaaactgaa tatggccacg gccactcaat tgtgtaagga ttgtccaaca cctgcaaatt 4920

ttaaaaagtg ttgccctctc gtttgtggaa aggccttgca attaatggac aggtacacca 4980

gacaaaggtt cactgtagat gagattacca cattaatcat gaatgagaaa aacagaaggg 5040

ccaatatcgg caattgcatg gaagccttgt ttcaaggacc attaaggtat aaagatttga 5100

agatcgatgt gaagacagtt cccccccctg agtgcatcag tgatttgtta caagcagtgg 5160

attctcaaga ggttagggat tactgtgaga agaaaggctg gatcgttaac gttactagcc 5220

agattcaact agaaaggaac atcaataggg ccatgactat actccaagct gttaccacat 5280

tcgcagcagt cgcaggagta gtgtatgtaa tgtacaaact cttcgccggt caacagggtg 5340

catacactgg cttgccaaac aaaaaaccca atgtccctac tatcagagtc gctaaagtcc 5400

aggggccagg atttgactac gcagtggcaa tggcaaaaag aaacatagtt actgcaacca 5460

ccaccaaggg tgaatttacc atgctagggg tgcatgataa tgtagcaata ttgccaaccc 5520

atgccgctcc aggagaaacc attattattg atgggaaaga agtagagatc ctagatgcca 5580

gagccttaga agatcaagcg ggaaccaatc ttgagatcac cattattact ctaaaaagaa 5640

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gagtgttgat cgtgaacact agcaagtacc ccaatatgta tgtccccgtt ggtgctgtga 5760

ccgaacaggg atatcttaat ctcagtggac gtcaaactgc tcgcacttta atgtacaact 5820

ttccaacaag ggcaggccag tgcggaggaa tcatcacttg tactggcaaa gtcattggga 5880

tgcatgttgg cgggaacggt tcacatgggt ttgcagcagc cctcaagcga tcatacttca 5940

ctcaaaatca gggcgaaatc cagtggatga ggtcatcaaa agaagtgggg taccccatta 6000

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ccatcttttc taaatatgtg gggaacaaaa ttactgaagt ggacgagtac atgaaagaag 6180

cagtggatca ctatgcagga cagttaatgt cactggatat caacacagaa cagatgtgcc 6240

tggaggatgc catgtacggc accgatggtc ttgaggccct ggatcttagc actagtgctg 6300

gatatcctta tgttgcaatg gggaaaaaga aaagagacat tctagataaa cagaccagag 6360

atactaagga gatgcagaga cttttagata cctatggaat caatctacca ttagtcacgt 6420

acgtgaaaga tgaactcagg tcaaagacta aagtggaaca aggaaagtca agattgattg 6480

aagcttccag ccttaatgat tcagttgcaa tgagaatggc ctttggcaat ctttacgcag 6540

ctttccacaa gaatccaggt gtggtgacag gatcagcagt tggttgtgac ccagatttgt 6600

tttggagtaa gataccagtg ctaatggaag aaaaactctt cgcttttgac tacacagggt 6660

atgatgcctc actcagccct gcttggtttg aagctcttaa aatggtgtta gaaaaaattg 6720

gatttggcag tagagtagac tatatagact acctgaacca ctctcaccac ctttacaaaa 6780

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acttggacca tttaaaaatg attgcctatg gtgatgacgt gatagcttcc tacccccatg 6960

aggttgacgc tagtctccta gcccaatcag gaaaagacta tggactaacc atgactccag 7020

cagataaatc agtaaccttt gaaacagtca catgggagaa tgtaacattt ctgaaaagat 7080

ttttcagagc agatgagaag tatccattcc tggtgcatcc agtgatgcca atgaaagaaa 7140

ttcacgaatc aatcagatgg accaaggacc ctagaaacac acaggatcac gtacgctcgt 7200

tgtgcctatt agcttggcac aacggtgaag aagaatacaa taaattttta gctaaaatca 7260

gaagtgtgcc aatcggaaga gctttattgc tcccagagta ctctacattg taccgccgat 7320

ggctcgactc attttagtaa ccctacctca gtcggattgg attgggttat actgttgtag 7380

gggtaaattt ttctttaatt cggagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 7435