具体实施方式

定义

如上所述，本发明用于预测受试者脑卒中风险的方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中的CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

b)将CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与一个参考量(或多个参考量)进行比较，从而预测脑卒中风险。

脑卒中预测应基于比较步骤(b)的结果。

因此，本发明的方法优选地包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中的CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

b)将CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与一个参考量(或多个参考量)进行比较，从而预测脑卒中风险，以及

c)优选地基于比较步骤(b)的结果预测受试者脑卒中风险。

根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括进一步的步骤的方法。此外，本发明的方法优选地为离体方法，更优选地为体外方法。此外，其还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及测定进一步的标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可以全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。

如本领域技术人员应理解的，与本发明相关的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。该术语优选地要求能够对受试者的具有统计显著性的部分进行正确的评定(诸如本文所述的疗法的诊断、区别、预测、鉴别或评定)。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，确定置信区间、p值确定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需费力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情请参见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley和Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.4、0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

根据本发明的方法，应预测脑卒中风险。术语“脑卒中”在本领域是众所周知的。该术语优选地是指缺血性脑卒中，特别是指脑缺血性脑卒中。通过本发明的方法预测的脑卒中应为由于流向大脑或其部分的血流量减少所致，该血流量减少导致脑细胞供氧不足。特别地，由于脑细胞死亡，脑卒中会导致不可逆转的组织损伤。脑卒中的症状在本领域是众所周知的。缺血性脑卒中可能为由动脉粥样硬化血栓形成或大脑主动脉栓塞、由凝血障碍或非肿瘤性血管疾病、或由导致总血流量减少的心脏缺血引起的。缺血性脑卒中优选地选自由动脉粥样硬化性血栓性脑卒中、心脏栓塞性脑卒中和腔隙性脑卒中组成的组。优选地，要预测的脑卒中为急性缺血性脑卒中，特别是心脏栓塞性脑卒中。心房颤动可以引起心脏栓塞性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。

术语“脑卒中”优选地不包括出血性脑卒中。受试者是否罹患脑卒中，特别是缺血性脑卒中，可以通过众所周知的方法来测定。此外，脑卒中的症状在本领域中是众所周知的。例如，脑卒中症状包括面部、手臂或腿部突然麻木或无力，特别是在身体的一例，突然意识混乱，说话或理解困难，一只或两只眼睛突然看不到，以及突然行走困难，头晕，失去平衡或协调。

本领域中已知的是，生物标志物可在各种疾病和疾患中改变。这也适用于CES-2。因此，“脑卒中风险的预测”的表述有助于预测与心房颤动相关的不良事件的风险。

这里所指的“受试者”优选地为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该受试者为人类受试者。

优选地，待测受试者为任何年龄，更优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。

进一步地，该受试者的年龄可以为55岁或更高。

在本发明方法的一个优选实施例中，待测受试者罹患心房颤动。心房颤动可以为阵发性、持续性或永久性心房颤动。因此，该受试者可能罹患阵发性、持续性或永久性心房颤动。特别地，设想受试者罹患阵发性、持续性或永久性心房颤动。在本发明的基础研究中已经显示，如本文所述的生物标志物的测定允许对所有子组中的脑卒中的可靠预测。

因此，在本发明的一个实施例中，该受试者罹患阵发性心房颤动。

在本发明的另一实施例中，该受试者罹患持续性心房颤动。

术语“心房颤动”在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地是指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的快速室上性心律失常。特别地，该术语是指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。其涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状为心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征为通过在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或纤维波代替一致的P波，该振荡或纤维波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。

美国心脏病学会(ACC)、美国心脏病协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)提出了以下分类体系(参见Fuster(2006)Circulation 114(7)：e257-354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。

所有罹患AF的人最初都属于被称为第一次检测到AF的类别。然而，该受试者可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果AF已持续超过一年，则受试者罹患永久性AF。特别地，不会发生转换回窦性心律的(或仅在医疗干预下转换回窦性心律)。如果AF持续超过7天，则受试者罹患持续性AF。该受试者可能需要药物或电干预来终止心房颤动。因此，持续性AF在发作时发生，但心律失常通常不会自发(即在没有医学发明的情况下)转换回窦性心律。阵发性心房颤动优选地是指持续不超过7天并且自发(即在没有医疗干预的情况下)终止的心房颤动的间歇性发作。在大多数阵发性AF的病例中，发作持续小于24小时。因此，虽然阵发性心房颤动为自发终止，但是持续性心房颤动并不是自发结束的，并且需要电复律或药物复律来进行终止，或需要其他程序，诸如消融程序(Fuster(2006)Circulation 114(7)：e257-354)。术语“阵发性心房颤动”被定义为这样的AF发作，该AF发作在小于48小时内，更优选在小于24小时内，并且最优选在小于12小时内自发终止。持续性和阵发性AF都可能复发。

如上所述，优选罹患阵发性、持续性或永久性心房颤动的待测受试者。

进一步地，设想在获得样品时该受试者罹患心房颤动的发作。这可能是例如如果该受试者罹患永久性或持续性AF的情况。

可替代地，设想在获得样品时该受试者未罹患心房颤动的发作。这可能是例如如果该受试者罹患阵发性AF的情况。因此，当获得样品时，该受试者应具有正常的窦性心律，即处于窦性心律。

进一步地，预期心房颤动先前已在受试者中诊断出。因此，心房颤动应为被诊断出的，即被检测到的心房颤动。

如实例所示，预测心力衰竭患者的风险是可能的。

因此，待测受试者可能罹患心力衰竭。根据本发明方法的术语“心力衰竭”优选地涉及左心室射血分数降低的心力衰竭。

进一步地，在没有心力衰竭病史的受试者中预测该风险是可能的。因此，待测受试者优选地未罹患心力衰竭。特别地，根据NYHA II、III和IV级，待测受试者未罹患心力衰竭。

在特别优选的实施例中，该受试者为未罹患心力衰竭，但是罹患心房颤动的受试者。

有利地，在本发明方法的基础研究中已经证明，即使受试者已经接受抗凝疗法，即旨在降低脑卒中风险的疗法(约70％的患者接受口服抗凝剂和约30％的维生素K拮抗剂，诸如华法林(warfarin)和双香豆素(dicumarol))，也可以做出可靠的预测。令人惊讶的是，已经证明通过测定CES-2的量可以区分人群或风险患者(即接受抗凝疗法的心房颤动患者)，可以可靠地区分降低的脑卒中风险和增加的脑卒中风险。脑卒中风险增加的AF患者可以受益于抗凝疗法的强化。此外，脑卒中风险降低的AF患者可能会被过度治疗，并且可能受益于更小强度的抗凝疗法(导致例如医疗保健成本降低)。

因此，根据本发明优选的为受试者接受抗凝疗法。

如上所述，抗凝疗法优选为旨在降低所述受试者的抗凝风险的疗法。更优选地，抗凝疗法为施用至少一种抗凝剂。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。在一个优选实施例中，至少一种抗凝剂选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(即维生素K拮抗剂)(特别是华法林或双香豆素)、口服抗凝剂(特别是达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)或阿哌沙班(apixaban))、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子IXa抑制剂、因子Xa抑制剂、因子Va和因子VIIIa的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗IIa型)。因此，设想受试者服用上述药物中的至少一种。

在优选的实施例中，该抗凝剂为维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素。维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素价格较低，但是因为治疗不方便，繁琐，而且往往不可靠，并且治疗时间在治疗范围内波动，所以需要更好的患者依从性。NOAC(新的口服抗凝剂)包括直接因子Xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班(darexaban)、依度沙班(edoxaban))、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和PAR-1拮抗剂(沃拉帕沙(vorapaxar)、阿托帕沙(atopaxar))。

在另一优选实施例中，抗凝剂和口服抗凝剂，特别是阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班、依度沙班、达比加群、沃拉帕沙或阿托帕沙。

因此，待测受试者可以在测试时(即收到样品时)处于用口服抗凝剂或维生素K拮抗剂疗法。

在一个优选实施例中，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括如果已确定受试者有脑卒中风险i)建议抗凝疗法的步骤，或ii)建议强化抗凝疗法的步骤。在一个优选实施例中，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括如果已确定该受试者有脑卒中风险(通过本发明的方法)i)开始抗凝疗法的步骤，或ii)强化抗凝疗法。

如本文所用的术语“建议”是指建立可以应用于受试者的疗法的提议。然而，应该理解的是该术语并不包括应用实际疗法。建议的疗法取决于通过本发明的方法提供的结局。

特别地，以下规定适用：

如果待测受试者未接受抗凝疗法，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议开始抗凝疗法。因此，应开始抗凝疗法。

如果待测受试者已接受抗凝疗法，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议加强抗凝疗法。因此，应加强抗凝疗法。

在一个优选实施例中，通过增加抗凝剂的剂量(即，当前施用的凝结剂的剂量)来加强抗凝疗法。

在一个特别优选实施例中，通过增加使用更有效的抗凝剂替换当前施用的抗凝剂来加强抗凝疗法。因此，建议更换抗凝剂。

本发明的方法可以通过以下来用于评定受试者的抗凝疗法的功效：测定来自受试者的样品中的CES-2的量和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，并且将CES-2的量和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与一个参考量(或多个参考量)进行比较，从而评定脑卒中风险。

在本发明的一个优选实施例中，CES-2量的减少表明抗凝疗法无效，并且其中CES-2量的正常或增加表明抗凝疗法有效。

如果待测受试者接受抗凝疗法，并且CES-2的量减少，则建议加强抗凝。因此，应该加强抗凝疗法或建议更换抗凝剂。

本发明进一步涉及一种用于鉴定符合条件施用至少一种抗凝药物或符合条件增加至少一种抗凝药物的剂量的受试者的方法，其包括：a)测定CES-2的量和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及b)将步骤a)中测定的量与参考量进行比较，从而鉴定符合条件施用所述至少一种药物或符合条件增加所述至少一种药物的剂量的受试者。

本发明进一步涉及一种用于监测接受抗凝疗法的受试者的方法，该方法包括以下步骤：a)测定来自受试者的样品中的CES-2的量和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及b)将CES-2的量和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与一个参考量(或多个参考量)进行比较，从而评定脑卒中风险。

因此，通过实施本发明的方法，可以鉴定需要更密切的监测，特别是对于抗凝疗法(并且因此需要更密切观察)的受试者。优选地，“更密切的监测”意指在本发明方法的步骤a)中所提及的样品后不久，在至少一种从受试者获得的另外的样品中测定本文所指的生物标志物，即CES-2和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物。

据描述，与维生素K拮抗剂华法林相比，使用口服抗凝剂阿哌沙班实现了高风险患者中的更好预防，如Hijazi等人，The Lancet 2016 387，2302-2311，(图4)所示。

因此，设想待测受试者是使用维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)疗法的受试者。如果已确定受试者有罹患脑卒中风险(通过本发明的方法，建议使用口服抗凝剂(特别是达比加群、利伐沙班或阿哌沙班)替代维生素K拮抗剂。根据使用维生素K拮抗剂的疗法中止，开始使用口服抗凝剂疗法。

在本发明的一个优选实施例中，受试者具有脑卒中或TIA(短暂性脑缺血发作)的病史。特别地，该受试者有脑卒中病史。

因此，设想受试者在实施本发明的方法之前(或更精确地在获得待测样品之前)罹患脑卒中或短暂性脑缺血发作。尽管受试者过去应罹患过脑卒中或短暂性脑缺血发作，但在获得待测样品时，受试者不应罹患脑卒中或短暂性脑缺血发作)。

如上所述，在除心房颤动以外的各种疾病和疾患中，生物标志物CES-2可能改变。在本发明的一个实施例中，设想受试者未罹患此类疾病和疾患。

本发明的方法也可用于筛选更大的受试者群体。因此，设想评定至少100名受试者，特别是至少1000名受试者的脑卒中风险。因此，在来自至少100名或特别是至少1000名受试者的样品中测定生物标志物的量。此外，设想评定至少10,000名受试者。

术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或组织或器官样品。体液样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水，或任何其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样品。样品可以为冷冻、新鲜、固定(例如福尔马林固定)、离心和/或包埋(例如石蜡包埋)的等。在评定样品中一种或多种生物标志物的量之前，细胞样品当然可以接受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。

在本发明的一个优选实施例中，样品为血液(即全血)、血清或血浆样品。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血块并收集上清液。血浆为血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或EDTA处理过的试管)中。通过离心将细胞从样品中去除，并获得上清液(即血浆样品)。

优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评定受试者将遭受脑卒中的概率。典型地，预测受试者是有罹患脑卒中风险(因此风险升高)还是没有罹患脑卒中风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分有脑卒中风险的受试者和没有脑卒中风险的受试者。进一步地，设想本发明的方法允许区分降低的、平均的和升高的脑卒中风险。

如上所述，应预测在一定时间窗口内罹患脑卒中风险(和概率)。根据本发明，设想预测短期风险或长期风险。例如，预测一周内或一个月内罹患脑卒中风险。在本发明的基础研究中观察到的最短时间跨度为11天。受试者的CES-2水平降低。这表明，不仅可以进行长期预测，而且可以进行短期预测。

在本发明的一个实施例中，预测窗口为约至少三个月、约至少六个月或约至少一年的时段。在另一优选实施例中，预测窗口为约五年的时段。进一步地，预测窗口可为约六年(例如用于预测脑卒中)的时段。

在一个实施例中，预测窗口为多至10年的时段。因此，可以预测十年内罹患脑卒中风险。

在另一实施例中，预测窗口为多至7年的时段。因此，可以预测七年内罹患脑卒中风险。

在另一实施例中，预测窗口为多至3年的时段。因此，可以预测三年内罹患脑卒中风险。

此外，设想预测窗口为1年至10年的时段。

优选地，从本发明的方法的完成起计算预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。

如上文所述，“预测脑卒中风险”的表述是指要通过根据本发明的方法分析受试者被分配到有脑卒中风险的受试者组中，或被分配到没有脑卒中风险的受试者组中。因此，可以预测受试者是否有罹患脑卒中风险。如本文所使用的，“有罹患脑卒中风险的受试者”优选地具有升高的罹患脑卒中风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。如本文所用的，“没有罹患脑卒中风险的受试者”优选地具有降低的罹患脑卒中风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选在五年的预测窗口内，有罹患脑卒中风险的受试者优选具有至少7％或更优选至少10％的罹患脑卒中风险。优选在五年的预测窗口内，没有罹患脑卒中风险的受试者优选具有低于5％，更优选低于3％的罹患脑卒中风险。

生物标志物羧酸酯酶-2(缩写为CES-2)在本领域中是众所周知的。生物标志物通常也称为CES-2；iCE；CE-2；PCE-2；CES-2A1。CES-2主要在小肠中表达。此外，其还可以在心脏、脑、睾丸、骨骼肌、结肠、脾脏、肾脏和肝脏中表达。

在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人类CES-2多肽的量。人类CES-2多肽的序列在本领域中为众所周知的，并且可以为例如通过Uniprot数据库评定，请参见条目(UniProtKB-O00748(EST2_HUMAN)。

人类CES-2基因位于16号染色体。CES-2为大约60kDa多肽的蛋白质，选择性剪接导致多个变体编码相同的蛋白质。描述了该基因的12个转录物(剪接变体)、130个直系同源物、12个旁系同源物和4个表型。此外，CES-2与4个表型相关。CES-2包含12(15)个外显子。(Ensembl版本93，http：//www.ensembl.org)。

Wu等人，(Pharmacogenetics.2003年7月；13(7)：425-35)鉴定了三个不同的启动子，其中两个启动子具有组织特异性，并且另一个远端启动子负责该基因在许多组织中的低水平表达。

CES-2基因转录为12种不同的同种型，其中只有一半为蛋白质编码(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8824#reference-sequences)。

在一个优选实施例中，测定CES-2转录物的同种型1的量，即具有623个氨基酸序列的同种型1，如RefSeq登录号NP_003860.2所示。

在一个优选实施例中，测定CES-2转录物的同种型2的量，即具有607个氨基酸序列的同种型2，如RefSeq登录号NP_932327.1所示。

在一个优选实施例中，测定CES-2转录物的同种型3的量，即具有450个氨基酸序列的同种型3，如RefSeq登录号XP_016879307.1所示。

在一个优选实施例中，测定CES-2转录物的同种型4的量，即具有466个氨基酸序列的同种型4，如RefSeq登录号XP_011521723.1所示。

在另一优选实施例中，测定CES-2转录物的同种型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的量，即全部CES-2。

例如，可以使用针对CES-2多肽的氨基酸的单克隆抗体(例如小鼠抗体)和/或使用山羊多克隆抗体来测定CES-2的量。

在另一优选实施例中，CES-2与利钠肽和/或ESM1组合测定。

术语“利钠肽”包括心钠肽(ANP)型肽和脑钠肽(BNP)型肽。因此，根据本发明的利钠肽包含ANP型肽和BNP型肽及其变体(参见，例如，Bonow RO.等人，Circulation 1996；93：1946-1950)。

ANP型肽包含pre-proANP、proANP、NT-proANP、和ANP。

BNP型肽包含pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP、和BNP。

前肽原(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶切以释放前肽(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。前肽进一步切割为N端前肽(NT-前肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为28个氨基酸)。

根据本发明的优选的利钠肽为NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP。ANP和BNP为活性激素，并且比其各自的非活性对应物NT-proANP和NT-proBNP的半衰期短。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP作为完整分子在血液中循环，并且因此经肾脏清除。

使用NT-proBNP进行预分析更稳定，可以轻松将样品运输至中心实验室(MuellerT，Gegenhuber A，Dieplinger B，Poelz W，Haltmayer M.Long-term stability ofendogenous B-type natriuretic peptide(BNP)and amino terminal proBNP(NT-proBNP)in frozen plasma samples.Clin Chem Lab Med 2004；42：942-4.)。血液样品可以在室温下保存几天，或者可以在没有回收损失的情况下，进行邮寄或运输。相反，BNP在室温或4℃下储存48小时导致浓度损失至少20％(Mueller T，Gegenhuber A等人，Clin ChemLab Med 2004；42：942-4；Wu A H，Packer M，Smith A，Bijou R，Fink D，Mair J，WallentinL，Johnston N，Feldcamp C S，Haverstick D M，Ahnadi C E，Grant A，Despres N，Bluestein B，Ghani F.Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVIACentaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heartfailure：a multisite study.Clin Chem 2004；50：867-73.)。因此，根据目标时间过程或性质，利钠肽的活性形式或非活性形式的测量可以为有利的。

根据本发明的最优选的利钠肽为NT-proBNP和BNP，特别是NT-proBNP。如上所简要讨论的，根据本发明的人类NT-proBNP为多肽，其优选包含长度为76个氨基酸，其对应于人类NT-proBNP分子的N-末端部分。人类BNP和NT-proBNP的结构在现有技术中已详细描述，例如WO02/089657，WO 02/083913和Bonow RO.等人，New Insights into the cardiacnatriuretic peptides.Circulation 1996；93：1946-1950。优选地，如本文所用，人类NT-proBNP为EP 0 648 228 B1中公开的人类NT-proBNP。

术语“ESM1”也称为Endocan，包括由20kDa成熟多肽和30kDa O-连接的聚糖链及其变体组成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)

在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人类ESM-1多肽的量。人类ESM-1多肽的序列在本领域是众所周知的(参见例如Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271：20458-20464，并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMAN)。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同种型，即同种型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同种型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同种型1的长度为184个氨基酸。在同种型2中，缺少同种型1的氨基酸101至150。氨基酸1至19形成信号肽(其可能会被切割)。

在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同种型1的量，即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示序列的同种型1。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同种型2的量，即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示序列的同种型2。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同种型1和同种型2的量，即全部ESM-1。

例如，可以使用针对ESM-1多肽的氨基酸85至184的单克隆抗体(例如小鼠抗体)和/或使用山羊多克隆抗体来测定ESM-1的量。

生物标志物血管生成素-2(缩写为“Ang-2”，通常也称为ANGPT2)在本领域中是众所周知的。其为Ang-1和TIE2两者的天然存在的拮抗剂(参见例如Maisonpierre等人，Science 277(1997)55-60)。在没有ANG-1的情况下，该蛋白可诱导TEK/TIE2的酪氨酸磷酸化。在没有血管生成诱导因子(诸如VEGF)的情况下，ANG2介导的细胞基质接触的松动可诱导内皮细胞凋亡，以及随之发生的血管退行。通过与VEGF的配合，其可促进内皮细胞的迁移和增殖，从而作为允许性血管生成信号。人类血管生成素的序列在本领域中是众所周知的。Uniprot列出了血管生成素-2的三种同种型：同种型1(Uniprot标识符：O15123-1)、同种型2(标识符：O15123-2)和同种型3(O15123-3)。在一个优选实施例中，测定血管生成素-2的总量。总量优选为复合和游离血管生成素-2的量之和。

IGFBP-7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是由内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞分泌的30kDa模块化糖蛋白(Ono，Y.等人，Biochem Biophys Res Comm 202(1994)1490-1496)。优选地，术语“IGFBP-7”是指人类IGFBP-7。蛋白质的序列在本领域中是众所周知的，并且例如可通过UniProt(Q16270，IBP7_HUMAN)或通过GenBank(NP_001240764.1)获得。生物标志物IGFBP-7的详细定义如WO2008/089994中所提供，该专利的全部内容以引用方式并入本文。IGFBP-7有两种同种型：同种型1和同种型2，其通过选择性剪接产生。在本发明的一个实施例中，测量两种同种型的总量(关于序列，参见UniProt数据库条目(Q16270-1和Q16270-2)。

术语“测定”如本文所述的生物标志物(诸如CES-2或利钠肽)的量是指生物标志物的量化，例如使用本文别处描述的适当检测方法来测量样品中生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。

在一个实施例中，生物标志物的量是通过以下方式来测定的：使样品与特异性结合生物标志物的试剂接触，从而在该试剂与所述生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标志物的量。

本文提及的生物标志物(诸如CES-2)可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测方法通常包括量化样品中生物标志物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫分析，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在Elecsys^TM分析仪上可用)、CBA(例如在Roche-Hitachi^TM分析仪上可用的酶钴结合测定)和乳胶凝集测定(例如在Roche-Hitachi^TM分析仪上可用)。

对于本文所述的生物标志物蛋白的检测，可以使用这种测定形式的各种免疫测试技术，参见例如U.S.Pat.Nos.4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记的抗体与靶标生物标志物的直接结合。

采用电化学发光标记物的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见Richter，M.M.，Chem.Rev.2004；104：3003-3036。

在一个实施例中，用于测量生物标志物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标记物。在一个实施例中，所述钌标记物为联吡啶钌(II)复合物。或抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标记物。在一个实施例中，所述铱标记物是如WO2012/107419中所公开的复合物。

在用于测定CES-2的夹心测定的一个实施例中，该测定包括与CES-2特异性结合的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及与CES-2特异性结合的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的CES-2形成夹心免疫测定复合物。

在用于测定利钠肽的夹心测定的一个实施例中，该测定包括与利钠肽特异性结合的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及与利钠肽特异性结合的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的利钠肽形成夹心免疫测定复合物。

测量多肽(诸如CES-2或利钠肽利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7)的量可优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性结合所述多肽的试剂接触，(b)(可选地)去除未结合的试剂，(c)测量结合试剂的量，即在步骤(a)中形成的试剂的复合物。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。

与生物标志物特异性结合的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地偶联到标记物，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标记物直接偶联(共价或非共价)到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标记物偶联，和/或是三级结合试剂与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可以包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“加标签”。此类标签可以为更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于N-末端和/或C-末端。合适的标记物是可以通过合适的检测方法检测到的任何标记物。典型的标记物包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酸酯、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标记物、放射性标记物、磁性标记物(“例如磁珠”，包括顺磁标记物和超顺磁标记物)和荧光标记物。酶活性标记物包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及其衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从Roche Diagnostics购得)、CDP-Star^TM(Amersham Bio-sciences)、ECF^TM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可以产生有色反应产物、荧光或化学发光，所述有色反应产物、荧光或化学发光可根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的摄像系统)来测定。对于酶反应的测量，上述给定的标准类似地适用。典型的荧光标记物包括荧光蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa568)。进一步的荧光标记物可从Molecular Probes(Oregon)购得。同样，还考虑使用量子点作为荧光标记物。放射性标记物可以通过任何已知且适当的方法检测，所述方法为例如感光胶片或磷光成像仪。

多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文其他部分所述的多肽的结合试剂的固体支持物与包含所述肽或多肽的样品接触，以及(b)测量与支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、耐久细胞(duracytes)、反应盘的孔和壁、塑料管等。

在另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合试剂与至少一种标志物之间形成的复合物中移除样品。因此，在一个方面中，该结合试剂可以固定在固体支持物上。在另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样品。

“夹心测定”为最有用和最常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变型。简单地说，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样品与捕获结合试剂接触。经过一段适当的孵育期和一段足以允许形成结合试剂-生物标志物复合物的时间后，添加能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂，并孵育足够形成结合试剂-生物标志物-标记物的结合试剂的另一复合物的时间。可以将任何未反应的材料洗掉，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来测定生物标志物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品进行比较来量化。

典型夹心测定的孵育步骤可以根据需要和在适当时候进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标志物共同孵育。例如，将待分析的样品和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样品和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。

特异性结合试剂与生物标志物之间形成的复合物应与样品中存在的生物标志物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样品中包含的能够被特异性结合的至少一种标志物的比例程度。也可在本文其他地方找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标志物的量，从而反映样品中真实存在的量。

术语“结合试剂”、“特异性结合试剂”、“分析物特异性结合试剂”、“检测剂”和“与生物标志物特异性结合的试剂”在本文中可以互换使用。优选地，其涉及这样的试剂，所述试剂包含与对应的生物标志物特异性结合的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例为核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂为与待测定生物标志物特异性结合的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体为多克隆抗体(或由此产生的抗原结合片段)。更优选地，该抗体为单克隆抗体(或其抗原结合片段)。此外，如本文其他部分所述，设想使用在CES-2的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫测定中)。因此，至少一种抗体用于测定CES-2的量。

在一个实施例中，至少一种抗体为小鼠单克隆抗体。在另一个实施例中，至少一种抗体为兔单克隆抗体。在另一个实施例中，该抗体为山羊多克隆抗体。在甚至另一个的实施例中，该抗体为绵羊多克隆抗体。

术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合对分子在其没有与其他分子显著结合的条件下表现为彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少10⁷M^-1的亲和力(“结合常数”K_a)与对应的生物标志物结合的结合反应。术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地是指对其靶分子具有至少10⁸M^-1或甚至更优选至少10⁹M^-1的亲和力。术语“特异的”或“特异性地”用于表示样品中存在的其他分子不显著地与特异于该靶分子的结合试剂结合。

在一个实施例中，本发明的方法基于检测包含人类CES-2和非人类或嵌合CES-2特异性结合试剂的蛋白质复合物。在这样的实施例中，本发明介绍了用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：(a)将所述受试者的样品与非人类CES-2特异性结合试剂一起孵育(b)测量CES-2特异性结合试剂与(a)中形成的CES-2之间的复合物，并且(c)将测得的复合物的量与参考量进行比较。复合物的量等于或高于参考量可以表明诊断出心房颤动(并因此而存在)，存在持续性心房颤动，应接受ECG的受试者，或有发生不良事件风险的受试者。复合物的量低于参考量可以表明不存在心房颤动；存在阵发性心房颤动，不应接受ECG的受试者，或没有发生不良事件风险的受试者。

如本文所用，术语“量”包括本文提及的生物标志物(诸如CES-2或利钠肽)的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书其他部分指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用，术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物(诸如CES-2和利钠肽诸如NT-proBNP或BNP和/或ESM-1、ANG-2、IGFBP7)的量与本说明书其他部分指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用，比较通常是指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可以手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品的生物标志物的测定或检测的量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行上述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可以进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。

根据本发明，将生物标志物CES-2的量和可选地利钠肽和/或利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的量与参考进行比较。参考优选地为参考量。术语“参考量”被技术人员很好地理解。应当理解，参考量应允许本文所述的心房颤动评定。例如，关于诊断心房颤动的方法，参考量优选地是指这样的量，所述量允许将受试者分配到(i)罹患心房颤动的受试者的组，或(ii)未罹患心房颤动的受试者的组。可以从要与测试样品一起(即同时或随后)分析的参考样品测定适当的参考量。

应当理解的是，将CES-2的量与利钠肽的参考量进行比较，而将利钠肽的量与利钠肽的参考量进行比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于CES-2和利钠肽的量来计算组合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

此外，应当理解的是，将CES-2的量与ESM1的参考量进行比较，而将ESM1的量与ESM1的参考量进行比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于CES-2和ESM1的量来计算组合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

此外，应当理解的是，将CES-2的量与ANG-2的参考量进行比较，而将ANG-2的量与ANG-2的参考量进行比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于CES-2和ANG-2的量来计算组合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

此外，应当理解的是，将CES-2的量与IGFBP7的参考量进行比较，而将IGFBP7的量与IGFBP7的参考量进行比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于CES-2和IGFBP7的量来计算组合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的受试者同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见ZweigMH.等人，Clin.Chem.1993；39：561-577)。ROC图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将受试者分配到某一预后或诊断中。ROC曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上为敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上为假阳性分数，即1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/1-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确度就越高。

根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。因此，优选地，通过建立如上所述的所述同期群的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许评定心房颤动的阈值。根据诊断方法所需的敏感性和特异性，ROC曲线允许得出合适的阈值。应理解的是，最佳敏感性是排除具有脑卒中风险的受试者(即排除)所需的，而最佳特异性是针对据预测有脑卒中风险的受试者(即确定)设想的。

优选地，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许预测脑卒中风险。

优选地，参考量，即参考量应允许区分有脑卒中风险的受试者和没有脑卒中风险的受试者。

诊断算法优选如下：

优选地，与参考量相比，CES-2的量的减少和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量的增加表明受试者有罹患脑卒中风险。

优选地，与参考量相比，CES-2的量的增加或不变和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量的减少或不变表明受试者没有罹患脑卒中风险。

优选的参考量在实例部分给出。然而，本领域技术人员应理解，根据期望的敏感性和特异性，其他参考量也可用于可靠的预测。

在本发明的基础研究中，已进一步证明测定CES-2的量和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量允许改善受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性。因此，与单独的CES-2的测定和临床脑卒中风险评分的测定相比，临床脑卒中风险评分以及CES-2的量和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量的测定的组合测定可以更可靠地预测脑卒中。

因此，用于预测脑卒中风险的方法可以进一步包括CES-2的量和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与临床脑卒中风险评分的组合。基于CES-2的量和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量以及与临床风险评分的组合，可以预测测试受试者的脑卒中风险。

因此，本发明特别涉及一种预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自具有已知临床脑卒中风险评分的受试者的样品中的CES-2的量和/或一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

b)评定所述受试者的所述临床脑卒中风险评分，以及

c)基于步骤a)和b)的结果预测所述脑卒中风险。

根据本发明的方法，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。因此，临床脑卒中风险评分的值是受试者已知的。

或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。因此，步骤b)优选地包括提供临床风险评分的值。优选地，该值是数字。在一个实施例中，临床脑卒中风险评分是通过医生可用的基于临床的工具中的一种生成的。优选地，值是通过测定受试者的临床脑卒中风险评分的值而提供的。更优选地，受试者的值是从受试者的患者记录数据库和病史获得的。因此，评分的值也可以使用该受试者的历史数据或公布的数据来确定。

根据本发明，将ANG-2和/或IGFBP7的量与临床脑卒中风险评分组合。这意味着优选地，将ANG-2和/或IGFBP7的量的值与临床脑卒中风险评分组合。因此，将这些值有效组合以预测受试者罹患脑卒中风险。通过组合该值，可以计算单个值，该单个值本身可用于预测。

临床脑卒中风险评分在本领域中是众所周知的。例如，在Kirchhof P.等人(European Heart Journal 2016；37：2893-2962)中描述了所述评分。在一个实施例中，评分是CHA□DS□-VASc评分。在另一个实施例中，评分是CHADS□评分。(Gage BF.等人，JAMA，285(22)(2001)，第2864-2870页)和ABC评分，即ABC(年龄、生物标志物、临床病史)脑卒中风险评分(Hijazi Z.等人，Lancet 2016；387(10035)：2302-2311)。本段中的所有出版物的全部公开内容均以引用方式并入本文。

因此，在本发明的一个实施例中，临床脑卒中风险评分是CHA₂DS₂-VASc评分。

在本发明的另一实施例中，临床脑卒中风险评分是CHADS₂评分。

在另一实施例中，临床风险评分是ABC评分。ABC脑卒中风险评分是用于预测AF中的脑卒中的新的基于生物标志物的风险评分，该风险评分在大的AF患者同期群中得到验证，并在独立的AF同期群中得到进一步的外部验证(参见Hijazi等人，2016)。其包括受试者的年龄、所述受试者的血液、血清或血浆肌钙蛋白T和NT-proBNP水平，以及关于受试者是否有脑卒中病史的信息。优选地，ABC脑卒中评分是如Hijazi等人所公开的评分。

在一个优选实施例中，预测受试者脑卒中风险的上述方法进一步包括建议抗凝疗法的步骤，或如果已确定受试者有脑卒中风险则建议强化抗凝疗法的步骤(如本文别处所述)。

提高临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法

本发明进一步涉及一种提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定CES-2的量和/或一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

b)将CES-2的量和/或一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量的值与临床脑卒中风险评分相组合，从而提高临床脑卒中风险评分的预测准确性。

该方法可包括进一步的步骤：c)基于步骤b)的结果提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本文中给出的与评定心房颤动的方法有关的定义和解释，特别是预测不良事件(诸如脑卒中)的风险的定义和解释优选地同样适用于上述方法。例如，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。

根据本发明，将CES-2的量和/或一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与临床脑卒中风险评分组合。这意味着优选地，将CES-2和/或利钠肽和/或ESM-1和/或ANG-2和/或IGFBP7的量的值与临床脑卒中风险评分组合。因此，将这些值有效组合，以提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本发明进一步涉及一种有助于预测受试者的脑卒中风险的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据本发明的方法从本文所述的受试者获得样品，

b)测定来自受试者的样品中的CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

c)向受试者的主治医生提供关于测定的CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量的信息，从而帮助预测风险。

上述样品获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样品。优选地，通过接收来自所述受试者的样品来获得该样品。因此，可以递送样品。

诊断心房颤动的方法

如本文所用，术语“诊断”是指评定根据本发明方法所指的受试者是否罹患心房颤动(AF)。在一个实施例中，诊断为受试者罹患AF。在一个优选实施例中，诊断为受试者罹患阵发性AF。在替代实施例中，诊断为受试者未罹患AF。

根据本发明，可以诊断所有类型的AF。因此，心房颤动可以为阵发性、持续性或永久性AF。优选地，特别是在未罹患永久性AF的受试者中，诊断为阵发性或心房颤动。

对受试者是否罹患AF的实际诊断可以包括进一步的步骤，诸如确认诊断(例如，通过ECG诸如Holter-ECG)。因此，本发明允许评定患者罹患心房颤动的可能性。CES-2量高于参考量的受试者可能罹患心房颤动，而CES-2量低于参考量的受试者则不太可能罹患心房颤动。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖帮助医师评定受试者是否罹患心房颤动。

优选地，与一个参考量相比(或多个参考量)，来自测试受试者的样品中CES-2的量(和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量)的增加表明受试者罹患心房颤动，和/或与一个参考量相比(或多个参考量)，来自测试受试者的样品中CES-2的量(和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量)的减少表明受试者未罹患心房颤动。

在一个优选实施例中，参考量，即CES-2的参考量，以及如果测定利钠肽，则利钠肽的参考量应允许区分罹患心房颤动的受试者和未罹患心房颤动的受试者。优选地，所述参考量为预定值。

在另一个优选实施例中，参考量，即CES-2的参考量，以及如果测定利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7，则利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的参考量应允许区分罹患心房颤动的受试者和未罹患心房颤动的受试者。优选地，所述一个或多个参考量为一个或多个预定值。

在一个实施例中，本发明的方法允许诊断罹患心房颤动的受试者。优选地，如果CES-2的量(和可选地利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的量)高于参考量，则该受试者罹患AF。在一个实施例中，如果CES-2的量高于参考量的某个百分比(例如第99个百分点)的参考上限(URL)，则该受试者罹患AF。

在另一个优选实施例中，本发明的方法允许诊断未罹患心房颤动的受试者。优选地，如果CES-2的量(和可选地利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的量)低于参考量(诸如某个百分比URL)，则该受试者未罹患AF。因此，在一个实施例中，术语“诊断心房颤动”是指“排除心房颤动”。

排除心房颤动特别值得关注，因为可以避免进一步诊断心房颤动的诊断测试，诸如ECG测试。因此，由于本发明，可以避免不必要的医疗保健成本。

因此，本发明还涉及一种用于排除心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中CES-2的量，以及

b)将CES-2的量与参考量进行比较，从而排除心房颤动。

优选地，与参考量相比(诸如排除心房颤动的参考)，受试者的样品中的生物标志物CES-2的量降低，表明受试者未罹患心房颤动，并且因此排除了受试者的心房颤动。例如，CES-2的参考量可以在未罹患AF的受试者的样品或其一组的样品中测定。

当组合测定生物标志物CES-2和生物标志物利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7时，可以实现甚至更可靠的排除。因此，步骤a)和b)优选如下：

a)测定来自受试者的样品中的CES-2的量以及一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量，以及

b)将CES-2的量和一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的量与参考量进行比较，从而排除心房颤动。

优选地，两种生物标志物的量，即生物标志物CES-2的量和利钠肽的量，

或两种生物标志物的量，即生物标志物CES-2的量和ESM1的量，

或三种生物标志物的量，即生物标志物CES-2的量、利钠肽的量和ESM1的量，

在受试者的样品中，与各自的参考量(诸如排除心房颤动的参考量)相比降低，表明受试者未罹患心房颤动，并且因此排除了受试者的心房颤动。例如，利钠肽和/或ESM1的参考量可以在未罹患AF的受试者的样品或其一组的样品中测定。

在诊断心房颤动的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括基于诊断结果建议和/或开始心房颤动治疗的步骤。优选地，如果诊断为受试者罹患AF，则建议和/或开始治疗。在本文其他地方公开用于心房颤动的优选疗法。

本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：

a)提供CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物的测试，以及

b)提供关于在心房颤动的评定中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的使用说明。

上述方法的目的优选地是有助于预测脑卒中风险，如本文其他地方更详细描述的。

使用说明应包含实施评定如上所述的心房颤动的方法的方案。进一步地，说明书应包含至少一个CES-2和/或利钠肽和/或ESM-1和/或ANG-2和/或IGFBP7的参考量的值。

该“测试”优选为适于执行评定心房颤动的方法的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包括至少一种用于生物标志物ANG-2的检测剂和/或至少一种用于生物标志物IGFBP7的检测剂。这两种生物标志物的检测剂可在一个试剂盒或两个单独的试剂盒中提供。

通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标志物的量的值。

在一个实施例中，步骤b)包括提供关于在脑卒中的预测(如本文别处所述)中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的使用说明。

上面给出的定义和解释，优选地在比照后适用于以下情况：

本发明进一步涉及

i)生物标志物CES-2和可选地一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物

ii)至少一种与在来自受试者的样品中的CES-2特异性结合的检测剂和可选地至少一种与在来自受试者的样品中的一种或多种包括利钠肽、ESM-1、ANG-2、IGFBP7的生物标志物特异性结合的检测剂，用于a)评定脑卒中风险或b)用于评定抗凝疗法的功效或c)

本发明进一步设想

i)生物标志物CES-2和/或

ii)至少一种与来自受试者的样品中的CES-2特异性结合的检测剂，

与临床脑卒中风险评分组合，

用于预测受试者罹患脑卒中风险的用途。

最后，本发明进一步涉及

i)生物标志物CES-2和/或

ii)至少一种与CES-2特异性结合的检测剂，在来自受试者的样品中用于预测受试者抗凝疗法的功效的用途。

已经结合本发明的方法定义了与上述用途相关的术语，诸如“样品”、“受试者”、“检测剂”、“CES-2”、“利钠肽”、“ESM-1”、“ANG-2”、“IGFBP7”、“特异性结合”、“脑卒中”和“预测风险”。定义和解释相应地适用。

优选地，上述用途是体外用途。此外，该检测剂优选为抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)，该抗体与生物标志物特异性结合。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

实例

本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。

实例1：CES-2在AF患者心脏组织中的差异表达

已从n＝40名患者的右心耳的心肌组织样品中测定了CES-2的差异表达水平。

RNAseq分析

由于CABG或瓣膜手术，因此在开胸手术中对心房组织进行了采样。AF或SR(对照)的证据是在手术期间同时进行内心外膜高密度激动波标测产生的。AF患者和对照组患者在性别、年龄和并存病方面均相匹配。

心房组织样品已准备用于

·AF患者；n＝11名患者

·SR对照组患者；n＝39名患者。

在RNAseq分析中，应用算法RSEM和DESEQ2测定CES-2的差异表达。

如图2所示，发现CES-2表达在11名持续性AF患者对比29名对照患者的分析的心房组织中上调。

表达(FC)的倍数变化为1,439。FDR(错误发现率)为0.00000000036。

在受损的末端器官，心房组织中测定了CES-2表达的改变。将CES-2mRNA水平与心房组织高密度绘图的结果进行比较。如电绘图表征的，在具有传导紊乱的心房组织样品中检测到CES-2mRNA水平升高。脂肪浸润或间质纤维化可以引起传导紊乱。在罹患心房颤动患者的心房组织中观察到CES-2的差异表达支持，即CES-2从心肌(尤其为右心耳)在循环系统中释放，以及升高的血清/血浆滴度有助于检测AF发作。

结论是CES-2从心脏释放到血液中，并且可以有助于检测AF发作。

实例2：脑卒中的预测

分析方法

在具有记录的心房颤动的患者的前瞻性多中心登记中评定了循环CES-2预测脑卒中发生风险的能力(Conen D.，Forum Med Suisse 2012；12：860-862)。使用Borgan(2000)中所述的分层病例同期群设计测量CES-2。

对于在随访期间(“事件”)经历脑卒中的70名患者中的每一个，选择1个匹配对照。对照是根据年龄、性别、高血压病史、心房颤动类型和心力衰竭史(CHF史)的人口统计学和临床信息进行匹配的。

CES-2结果可用于69名有事件的患者和69名无事件的患者。

CES-2是使用Olink平台测量的，因此绝对浓度值不可用并且可以进行报告。结果将以任意信号标度(NPX)报告。

为了量化CES-2的单变量预后值，使用具有脑卒中结果的成比例风险模型。

通过由CES-2给出的预后信息的两种不同结合来评定CES-2的单变量预后性能。

第一成比例风险模型包括以中位数(1.4NPX)二值化的CES-2，因此比较CES-2低于或等于中位数的患者与CES-2高于中位数的患者的风险。

第二成比例风险模型包括原始的CES-2水平，但转换为log2标度。执行log2转换是为了实现更好的模型校准。

因为来自病例对照同期群的天然成比例风险模型的估计将存在偏差(由于病例与对照的比例发生了变化)，因此使用加权成比例风险模型。加权基于Mark(2006)中描述的为病例对照同期群选择的每个患者的逆概率。

为了获得基于二分法基线CES-2测量值(＜＝1.4NPX对比＞1.4NPX)的两组中的绝对生存率的估计值，如Mark(2006)所述，创建了Kaplan-Meier曲线的加权版本。

为了评定CES-2的预后值是否独立于已知的临床和人口学风险因素，计算加权的成比例cox模型，该加权成比例cox模型还包括以下变量：年龄、性别、CHF史、高血压史、脑卒中/TIA/血栓栓塞史、血管疾病史和糖尿病史。

为了评定CES-2提高脑卒中预后的现有风险评分的能力，通过CES-2(log2转换)扩展了CHADS₂、CHA₂DS₂-VASc和ABC评分。通过创建包括CES-2和相应风险评分作为自变量的分担风险模型进行扩展。

将CHADS□、CHA□DS□-VASc和ABC评分的c-指数与这些扩展模型的c-指数进行比较。为了计算在病例同期群情况下的c-指数，如Ganna (2011)提出的，使用c-指数的加权版本。

结果

表1显示了两个单变量加权成比例风险模型的结果，该两个单变量加权成比例风险模型包括经二值化或log2转换的CES-2。

在这两个模型中，发生脑卒中风险与CES-2的基线值之间的关联显著。

二值化的CES-2的风险比意味着基线CES-2＞1.4NPX的患者组的脑卒中风险比基线CES-2＜＝1.4NPX的患者组的脑卒中风险的低0.4倍。包括作为经log2转换的线性风险预测因子的CES-2的成比例风险模型的结果表明，经log2转换的值CES-2与脑卒中风险成负相关。风险比0.14可以解释为CES-2增加2倍与脑卒中风险降低0.14有关。

在这种情况下，有趣的是CES-2水平与某些口服抗凝剂(OAK)的摄入量相关。图4所示，与其余患者相比，使用利伐沙班的患者示出更高的CES-2浓度。但是，也有一些摄入利伐沙班的患者的CES值低于1.4NPX。这可能表明CES-2可以用于监测OAK摄入的有效性。

表1：包括经二值化和log2转换的CES-2的单变量加权成比例风险模型的结果。

表2显示了包括CES-2(经log2转换的)的成比例风险模型与临床和人口统计学变量相组合的结果。

CES-2的影响仍然很明显，并且经lo2转换的CES-2的HR现在为0.09。

表2：包括CES-2及相关的临床和人口统计学变量的多变量成比例风险模型。

表3显示了加权成比例风险模型的结果，该加权成比例风险模型组合了CHADS□评分与CES-2(经log2转换的)。此外，在该模型中，CES-2可以将预后信息添加到CHADS□评分中。

表3：组合CHADS□评分与CES-2的加权成比例风险模型(经log2转换的)

表4显示了加权成比例风险模型的结果，该加权成比例风险模型组合了CHA□DS□-VASc评分与CES-2(经log2转换的)。CES-2再次添加了预后信息。

表4：组合CHA□DS□-VASc评分与CES-2的加权成比例风险模型(经log2转换的)

表5显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例风险模型组合了ABC评分与CES-2(经log2转换的)。CES-2的预后附加值略有下降，但仍保持显著水平。

表5：组合ABC评分与CES-2的加权成比例风险模型(经log2转换的)

表6显示了单独的CES-2、CHADS□、CHA□DS□-VASc和ABC评分的估计的c-指数，以及将CHADS□、CHA□DS□-VASc和ABC评分与CES-2(log2)组合的加权成比例风险模型的估计c-指数。

在CHA□DS□-VASc评分中加入CES-2可以使c-指数提高0.0611，这可以认为是在临床上对风险预测有意义的改进。

对于CHADS□评分，c-指数的提高与0.0646相当，而对于ABC评分则为0.0617。

表6CES-2、CHADS、CHA□DS□-VASc和ABC评分以及其与CES-2组合的C-指数。

实例3：生物标志物的测量

在商购可得的O-link多标志物面板中测量CES-2(羧酸酯酶-2(CES-2)；瑞典O-link的邻近延伸测定法。

病例研究

CHA2DS2-VASc评分可以在罹患或未罹患心房颤动的患者中预测脑卒中发生率(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29754652)；但是，尚不清楚，如果是并且在CHA2DS2-VASc评分为多少时，未罹患心房颤动的患者应接受口服抗凝(OAC)，并且以多少剂量，使得生物标志物诸如CES-2有助于评定OAC的治疗需求和有效性。

一名70岁罹患高血压，无心房颤动史的男性患者，呈现窦性心律。在从患者获得的EDTA血浆样品中测定CES2。CES2值低于参考值。降低的CES2效价与其他脑卒中风险参数(高龄和高血压)组合，表明发生脑卒中风险较高。因此，患者需接受抗凝疗法。

一名无心房颤动史的75岁女性患者要求在医生办公室进行检查。患者表现为窦性心律，但诊断为结构性心脏病。由于脑卒中病史和总体CHA2DS2-VASc评分高，患者已接受直接口服抗凝疗法(以低起始剂量)。为了测定当前的脑卒中风险，在从患者获得的血清样品中测量CES2。观察到CES2值低于参考值。降低的CES2效价与其他风险参数(脑卒中病史)的组合表明脑卒中风险较高。因此，增加了抗凝疗法的剂量。

一名68岁的肥胖女性患者，罹患糖尿病和心力衰竭、降低的射血分数，表现为呼吸急促的急性症状。在先前的就诊中，患者没有心房颤动史。根据高的CHA2DS2-VASC总体风险评分，即使没有AFib，医生也决定开始口服抗凝剂(低剂量)。在抗凝发作之前和之后测定CES-2水平。患者现在想知道抗凝疗法是否有效并且仍然必要。为了测定脑卒中的急性风险，在从患者获得的EDTA样品中测定CES2。观察到CES2值高于参考值。CES2效价的增加表明抗凝疗法是有效的。因此，维持抗凝疗法。

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*相关的最新研究问题“CHA2DS2VASc评分是否可预测未罹患A-Fib/振颤的患者脑卒中的发生率？”或者“AFib会对CHA□DS□-VASc增加多少风险点(例如，7倍风险，但是多少风险点]”以及2014年-2019年的第一结果：

“缺血性脑卒中或MI的事件发生率为0.67％/年、AF的事件发生率为0.96％/年、大出血的事件发生率为0.52％/年”https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29754652(相关也可参考：Circulation.2017；136：A20985)

“在罹患ACS但未罹患AF的患者中，CHADS2和CHA2DS2-VASc评分预测的缺血性脑卒中/TIA事件的准确性与罹患非瓣膜性AF的历史人群中所观察到的准确性相似，但绝对事件发生率较低。”https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24860007

“CHA2DS2-VASc工具可以预测未罹患心房颤动且具有植入装置的患者的血栓栓塞事件和总死亡率”https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28259228

“在CHA2DS2-VASc评分较高的情况下，未罹患AF的患者发生血栓栓塞并发症的绝对风险要高于罹患伴发性AF的患者。”https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26318604