一种热稳定的植酸酶制剂
阅读说明：本技术 一种热稳定的植酸酶制剂 (Thermostable phytase preparation ) 是由 韩红兵 刘桂丽 于 2021-01-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种热稳定的植酸酶制剂,其包括植酸酶和壳聚糖衍生物,所述壳聚糖衍生物包含烷基取代基和羧甲基取代基,所述植酸酶和壳聚糖衍生物的重量比为1:1-1:10。本发明的植酸酶制剂原料安全无毒,制备工艺简单,在高温条件下可保持长时间酶活性,对于禽畜的生产性能具有显著改善作用,因此具有广阔的市场应用前景。(The invention relates to a thermostable phytase preparation, which comprises phytase and a chitosan derivative, wherein the chitosan derivative comprises an alkyl substituent and a carboxymethyl substituent, and the weight ratio of the phytase to the chitosan derivative is 1:1-1: 10. The phytase preparation provided by the invention has the advantages of safe and nontoxic raw materials, simple preparation process, capability of keeping enzyme activity for a long time under a high-temperature condition, and remarkable improvement effect on the production performance of livestock, so that the phytase preparation has a wide market application prospect.)
技术领域
本发明涉及饲料领域，具体涉及一种植酸酶制剂。
背景技术
磷是动物生长发育必需的营养元素之一，对动物生长发育有重要的作用。植物种子中的磷主要以植酸形式贮存，玉米、豆粕、菜粕所含的磷约40％-70％主要以植酸磷形式存在。由于单胃动物消化道内缺乏能分解消化植酸磷的酶，所以饲料中绝大部分磷从动物粪便中排出，进入水体，造成水体富营养化。解决磷这种循环方式的根本就在于解决磷的利用问题，因而在动物饲料中添加微生物植酸酶正在逐渐被推广和应用。
植酸酶是1907年由Suzuki等在玉米糠中发现的一种单体蛋白质，之后相继在多种动物、植物及微生物中检测到植酸酶的存在。植酸酶可以催化植酸分解为磷酸和肌醇，现在已经发现的植酸酶有3种类型：特异性3-磷酸水解酶(phyA)、特异性6-磷酸水解酶(phyB)以及非特异性磷酸水解酶。植酸酶可以将植酸分子中的磷酸基团分步水解，将植酸水解为肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸和肌醇一磷酸5种不同的中间产物，在产物生成过程中无机磷被不断释放出来。因此，植酸酶作为饲料添加剂，是解决畜禽养殖过程中磷的易用率和粪便磷污染的最佳途径，具有广阔的应用前景。
商品化的植酸酶存在价格昂贵、产量低、不耐高温及产品质量不稳定等缺点。另外，高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常用的加工工艺，植酸酶作为饲料添加剂必须确保在高温加工工艺中保持较高的酶活性方可满足饲料加工的要求。
目前，现有技术在改善植酸酶耐高温特性方面的研究已有一些报道，例如CN201710554915.0公开了在改性淀粉溶液中依次加入植酸酶和交联剂，加入后混合均匀，室温下使其充分反应，得到载有植酸酶的水凝胶，将水凝胶经过切粒、干燥后得到酸酶凝胶制剂。CN201710815634.6公开了以海藻糖、硫酸镁、硫酸铵、氯化钙、玉米淀粉、微晶纤维素、高粱糖浆、维生素D3、乙醇等为载体，将植酸酶发酵液制备成植酸酶微丸，再以聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素、滑石粉、糊精、氧化锌、黄原胶、聚丙烯酸树脂混合物为包衣剂，制备包衣的植酸酶制剂。然而这些现有技术制备的植酸酶制剂工艺复杂、制造成本高，且长时间在高温下存储时植酸酶的活性仍无法满足实际需求。因此，亟需开发一种可以工业化、制备工艺简单，耐高温效果好的植酸酶制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种在高温条件下可保持长时间酶活性的植酸酶制剂，所述植酸酶制剂制备工艺简单，原料安全无毒，对于禽畜的生产性能具有显著改善作用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面提供一种热稳定的植酸酶制剂，其包括植酸酶和壳聚糖衍生物，所述壳聚糖衍生物包含烷基取代基和羧甲基取代基，所述植酸酶和壳聚糖衍生物的重量比为1:1-1:10。
优选的，所述植酸酶和壳聚糖衍生物的重量比为1:1-1:5；更优选的，所述植酸酶和壳聚糖衍生物的重量比为1:2。
优选的，所述烷基取代基为C8-C12烷基取代基；更优选的，所述烷基取代基为C8-C10烷基取代基；最优选的，所述烷基取代基为C10烷基取代基。
优选的，所述壳聚糖衍生物的制备方法包括以下步骤：
S1、羧甲基壳聚糖衍生物的制备：取壳聚糖，加入稀醋酸溶液搅拌，再加入异丙醇，分批加入氢氧化钠固体，40℃水浴碱化，将氯乙酸溶于适量异丙醇，滴加入反应液，40℃下反应，倾去上清液，加水使之成为澄清透明的黄色溶液；冰醋酸调节溶液pH至中性，甲醇分散，过滤，冻干即得羧甲基壳聚糖衍生物；
S2、烷基-羧甲基壳聚糖衍生物的制备：取S1得到的羧甲基壳聚糖衍生物，混悬于甲醇中，滴加醛类，搅拌反应0.5h，滴加NaBH4水溶液，继续搅拌12h，盐酸液调节pH至中性，甲醇分散沉淀，过滤，真空干燥，即得烷基-羧甲基壳聚糖衍生物。
优选的，步骤S1中所述壳聚糖的分子量为5KDa-20KDa；更优选的，所述壳聚糖的分子量为10KDa。
优选的，步骤S1中所述壳聚糖的脱乙酰度＞80％；更优选的，所述壳聚糖的脱乙酰度＞90％。
优选的，步骤S1中所述水浴碱化时间为1-4h；更优选的，所述水浴碱化时间为2h。
优选的，步骤S1中壳聚糖与氯乙酸的重量比为1:5-1:10；更优选的，步骤S1中壳聚糖与氯乙酸的重量比为1:6。
优选的，步骤S1中加入氯乙酸后的反应时间为1-4h；更优选的，步骤S1中加入氯乙酸后的反应时间为2h。
优选的，步骤S2中醛类选自正辛醛、正葵醛或正十二醛；更优选的，步骤S2中醛类为正葵醛。
优选的，步骤S2中羧甲基壳聚糖衍生物与醛类的重量比为20:1-5:1；更优选的，步骤S2中羧甲基壳聚糖衍生物与醛类的重量比为10:1。
优选的，步骤S2中加入醛类后的搅拌反应时间为15-60min；更优选的，步骤S2中加入醛类后的搅拌反应时间为30min。
优选的，步骤S2中NaBH4水溶液的浓度为5-20％(w/v)；更优选的，步骤S2中NaBH4水溶液的浓度为10％(w/v)。
优选的，步骤S2中羧甲基壳聚糖衍生物与NaBH4水溶液的质量体积为1:2-1:5(g/ml)；更优选的，步骤S2中羧甲基壳聚糖衍生物与NaBH4水溶液的质量体积为1:4(g/ml)。
优选的，步骤S2中加入NaBH4水溶液后继续搅拌8-16h；更优选的，步骤S2中加入NaBH4水溶液后继续搅拌12h。
本发明的第二方面提供一种热稳定的植酸酶制剂的制备方法，包括将上述处方量的植酸酶和烷基-羧甲基壳聚糖衍生物溶于蒸馏水中，充分混合后冷冻干燥，即得植酸酶制剂。
本发明的第三方面提供上述植酸酶制剂在制备禽畜饲料中的应用。
优选的，所述禽畜选自猪、鸡和鸭。
优选的，所述禽畜饲料用于改善禽畜的生产性能。
本发明具有积极有益的效果：
本发明的发明人在试验中意外发现，使用烷基-羧甲基壳聚糖衍生物作为植酸酶的稳定剂可以使植酸酶在高温条件下长时间保持酶活性，有利于其作为饲料添加剂显著改善禽畜的生产性能。此外，本发明的植酸酶制剂的材料来源天然，安全无毒，制剂制备工艺简单，易于工业化生产，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明使用的壳聚糖原料购自浙江金壳生物化学有限公司，脱乙酰度＞90％，植酸酶原料购自河南康之旺生物科技有限公司，其余试剂均为分析纯。
实施例1羧甲基壳聚糖衍生物的合成
取分子量为10KDa的壳聚糖5g，置三颈瓶中，加入稀醋酸溶液，搅拌，再加入异丙醇，分批加入氢氧化钠固体，40℃水浴碱化2h，30g氯乙酸溶于适量异丙醇，滴加入反应液，40℃反应2h，倾去上清液，加入100ml水，使之成为澄清透明的黄色溶液。冰醋酸调节溶液pH至中性，甲醇分散，过滤，滤饼用甲醇/水混合溶剂多次洗涤，滤饼再用50ml水溶解，滤过，冻干即得羧甲基壳聚糖衍生物。
实施例2烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1的合成
取实施例1制备得到的羧甲基壳聚糖衍生物2g，混悬于甲醇中，滴加正辛醛0.2g，搅拌反应30min，滴加10％(w/v)NaBH4水溶液8ml，继续搅拌12h，5M盐酸液调节pH至中性，甲醇分散沉淀，垂熔漏斗过滤，滤饼依次用甲醇和丙酮洗涤，真空干燥，即得烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1。
实施例3烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C2的合成
使用0.2g正葵醛替代实施例2中的0.2g正辛醛，其余步骤与实施例2相同，即得烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C2。
实施例4烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C3的合成
使用0.2g正十二醛替代实施例2中的0.2g正辛醛，其余步骤与实施例2相同，即得烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C3。
实施例5植酸酶制剂P1的制备
分别取1g植酸酶和2g实施例2制备得到的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1，加入20ml蒸馏水，充分混合后冷冻干燥，即得植酸酶制剂P1。
实施例6植酸酶制剂P2的制备
使用相同重量的实施例3制备得到的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C2替代实施例5中使用的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1，其余步骤同实施例5，即得到植酸酶制剂P2。
实施例7植酸酶制剂P3的制备
使用相同重量的实施例4制备得到的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C3替代实施例5中使用的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1，其余步骤同实施例5，即得到植酸酶制剂P3。
对比例1植酸酶制剂P4的制备
使用相同重量的分子量为10KDa的壳聚糖替代实施例5中使用的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1，其余步骤同实施例5，即得到植酸酶制剂P4。
对比例2植酸酶制剂P5的制备
使用相同重量的实施例1制备得到的羧甲基壳聚糖衍生物替代实施例5中使用的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物C1，其余步骤同实施例5，即得到植酸酶制剂P5。
试验例1本发明植酸酶制剂酶活性测定试验
1、试验原理
参照中华人民共和国国家标准《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》(GB/T18634-2002)规定的方法，测定植酸酶制剂在高温下不同时间点的酶活性。该方法利用植酸酶在一定的温度和pH条件下，水解底物植酸钠释放出无机磷的原理，通过加入钒钼酸铵试剂使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下进行比色测定，根据实验样品的吸光值由标准曲线回归方程即可计算出样品的植酸酶活性。
植酸酶的含量以酶活性单位表示，1植酸酶单位定义为：在温度37℃，pH值为5.5的条件下，每1分钟从浓度为5mmol/L的植酸钠中释放出1μmol无机磷所需要的植酸酶量。
2、试验方法
分别取实施例5-7和对比例1-2的植酸酶制剂P1-P5，加入适量蒸馏水，配制成植酸酶浓度为1g/L的水溶液，另取相同重量不含壳聚糖衍生物的植酸酶P0，平行操作配制成浓度为1g/L的水溶液作为对照例。将配制好的植酸酶制剂P0-P5水溶液各10mL于90℃条件下水浴加热，每种制剂分别于热处理后20min、40min和60min取样0.2mL，加入1.8mL乙酸缓冲液和4mL植酸钠，混合后在37℃保温反应30min，加入4mL钒钼酸铵试剂终止反应，在415nm波长处测定光吸收值。利用标准曲线回归方程计算样品酶活性，并且按照下述公式计算各制剂在不同时间点的剩余酶活性：
剩余酶活性(％)＝(特定条件下测定的植酸酶活性/标准条件下测定的植酸酶活性)*100％
3、试验结果
本发明不同处方的植酸酶制剂活性测定结果如下表1所示。
表1植酸酶制剂中植酸酶活性测定结果
从上表1可以看出，在90℃的高温条件下，不加壳聚糖或其衍生物的植酸酶的酶活性随时间延长快速下降，60min时的酶活不足25％。对比例1和2中加入壳聚糖或羧甲基壳聚糖的植酸酶制剂虽然在40min可以保持剩余酶活性50％以上，但是至60min时快速下降至40％以下，说明这些制剂长时间的热稳定性仍不能令人满意。与之相比，使用本发明烷基-羧甲基壳聚糖衍生物的植酸酶制剂P1-P3不仅前20min的热处理初始阶段可以保持剩余酶活在65％以上，而且在经过60min的长时间处理后仍可以使植酸酶的剩余酶活性保持在50％以上。上述试验证实，本发明的烷基-羧甲基壳聚糖衍生物对于在高温下长时间稳定植酸酶具有优异的效果。
试验例2本发明植酸酶制剂对肉仔鸡生产性能的影响
1、试验动物及试验饲粮
选择1日龄健康肉仔鸡240只，各组间均重差异不显著，随机分为6个试验组，每个试验组40只肉仔鸡。肉仔饲养管理按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进。
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