具体实施方式

如无特殊要求，本发明中所用材料均为本领域技术人员常规购买所得即可。

本发明提供了一种降血尿酸的组合物，所述组合物的有效成分为酚酸，所述酚酸的质量为所述组合物质量的37％。本发明所述组合物对URAT1蛋白的抑制作用优于苯溴马隆对URAT1蛋白的抑制作用，进而达到降尿酸的效果，而且副作用小。

本发明提供了上述组合物的制备方法，包括以下步骤：

将去籽后的葵花盘与水混合后浸泡，煎煮2h后，采用300目过滤筛过滤，得滤液；

将滤液浓缩后过大孔树脂柱，依次采用水、体积百分含量为10％、20％、60％、70％的乙醇水溶液进行洗脱，分段收集乙醇溶液的洗脱液，得降血尿酸的组合物；所述水、体积百分含量为10％、20％、60％、70％的乙醇水溶液的用量均为大孔树脂柱体积的3倍。

本发明将去籽后的葵花盘与水混合后浸泡，煎煮2h后过滤，得滤液。本发明对所述煎煮的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述浸泡前，优选还包括将所述葵花盘切碎；切碎后葵花盘的粒径优选为3cm。

在本发明中，所述浸泡的时间优选为30min；所述浸泡的温度优选为室温。在本发明中，所述煎煮和过滤的次数优选为2次；每次所述煎煮时的用水质量优选为葵花盘块质量的20倍。本发明对所述过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明将滤液浓缩后过大孔树脂柱，依次采用水、体积百分含量为10％、20％、60％、70％的乙醇水溶液进行洗脱，分段收集乙醇溶液的洗脱液，得降血尿酸的组合物；所述水、体积百分含量为10％、20％、60％、70％的乙醇水溶液的用量均为大孔树脂柱体积的3倍。在本发明中，所述过大孔树脂柱的方式优选为将离心所得上清液沿大孔树脂柱壁缓慢倒入大孔树脂柱中。本发明将所述上清液缓慢倒入大孔树脂柱中能够有效防止将大孔树脂被冲起，降低大孔树脂对有效成分的吸附，进而保证采用本发明所述方法制备得到的组合物将血尿酸的效果。

本发明采用不同浓度乙醇溶液进行洗脱，分段收集洗脱液的方式有利于将不同极性以及不同吸附能力的化合物分开，进而保证获得本发明所需化合物。

在本发明中，所述浓缩的温度优选为80℃。在本发明中，所述滤液浓缩后优选还包括对浓缩所得浓缩液进行离心；所述离心的转速优选为4000rpm；所述离心的时间优选为2min。

在本发明中，所述大孔树脂的型号优选为HPD500；所述大孔树脂优选依次经过95％乙醇、水、1N HCl、水、1N NaOH、水和95％乙醇的清洗；所述大孔树脂柱的体积优选为120ml。在本发明中，所述95％的乙醇溶液优选为体积百分含量为95％的乙醇溶液。

本发明所述洗脱后，优选还包括对不同浓度乙醇溶液洗脱所得洗脱液进行浓缩干燥，得降血尿酸的组合物，即固体组合物。在本发明中，所述浓缩干燥的温度优选为80℃。

本发明所述干燥后，还包括将所得干燥组合物进行混合，得降血尿酸的组合物。本发明对所述混合的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

本发明所述组合物能够显著降低URAT1蛋白的表达，进而保证降血尿酸的效果，因此所述组合物能够用于制备降血尿酸药物。

本发明提供了上述组合物或利用上述制备方法制备得到的组合物在制备降血尿酸药物中的应用。

本发明提供了一种降血尿酸的药物，所述药物中包括上述组合物或利用上述制备方法制备得到的组合物。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种降血尿酸的组合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、降血尿酸的组合物的制备

(1)将100g葵花盘剪成3cm的小块装入2L圆底烧瓶中，加入葵花盘质量的20倍量水，浸泡30min后，加热煎煮2h，过滤收集滤液，继续加入20倍量水将药渣煎煮2h，过滤合并滤液，将滤液置于水浴锅内80℃浓缩至700mL备用，取浓缩液50mL于蒸发皿中将其蒸干，计算出固体得率为51.6％。

(2)将型号为HPD500的大孔树脂按照95％乙醇-水-1N HCl-水-1NNaOH-水-95％乙醇的顺序进行清洗，然后将处理好的大孔树脂装于柱中，装柱体积为120mL，上样液体量为700mL，将浓缩液沿着柱壁缓慢倒入柱中后，依次水、10％、20％、60％、70％乙醇溶液洗脱，其中水、10％、20％、60％、70％乙醇溶液的用量均为柱体积的3倍，弃去水相，分段收集洗脱液，将不同浓度的乙醇洗脱液分别在80℃水浴锅浓缩干燥至固体，得降血尿酸的组合物，将固体组合物进行混合，得降血尿酸的组合物。

2、组合物中酚酸的含量测定

(1)咖啡酸对照品溶液的制备

取咖啡酸对照品适量，精密称定，加无水甲醇制成每lmL含90μg的溶液，即得。

(2)标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，立即采用紫外-可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果如表1和图2所示，标准曲线为：y＝11.169x-0.2483，R²为0.9902，该标准曲线线性关系良好，可用来计算酚酸含量。

表1不同浓度咖啡酸吸光度结果

(3)供试品溶液的制备

精密量取上述降血尿酸的组合物固体200mg，加少量70％乙醇溶解，转移至50mL量瓶中，再加70％乙醇至刻度，摇匀，即得

(4)测定法

精密量取上述供试品0.5mL，置25mL量瓶中，加无水乙醇补至5mL，加0.3％十二烷基硫酸钠2.0mL及0.6％三氯化铁-0.9％铁氰化钾(1:0.9)混合溶液1.0mL，混匀，在暗处放置5min，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，在暗处放置20min，以相应的试剂为空白，即除供试品溶液以外的所有试剂，采用紫外-可见分光光度法，在700nm波长测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含咖啡酸的重量，计算，即得酚酸含量。

重复3次前文所述降血尿酸的组合物的制备流程，对每次提取得到的降血尿酸组合物进行测定，实验结果见表2。

表2组合物中酚酸含量测定结果

由表2记载的实验数据可知，采用本发明所提供的方法酚酸占比为36.8～37.4之间，可见本发明提供的制备方法稳定。

对比例1

1、葵花盘60％醇提工艺

葵花盘醇提物的制备：将100g葵花盘剪成3cm的小块装入2L圆底烧瓶中，加入饮片质量的10倍量60％乙醇溶液，浸泡30min后，加热煎煮1.5h，过滤收集滤液，继续加入10倍量60％乙醇溶液将药渣煎煮1.5h，过滤合并滤液，将滤液浓缩烘干，得到组合物。

2、组合物中酚酸的含量测定

实验操作同实施例1中2的含量测定步骤。

重复3次前文所述葵花盘60％醇提工艺，对每次提取得到的组合物进行测定，实验结果见表3。

表3采用60％醇提工艺提取得到的组合物中酚酸的含量测定结果

由表3记载的试验数据可知，采用此对比例的方法制备得到的组合物中酚酸占比为0.55～0.56之间。

对比例2

1、葵花盘80％醇提工艺

葵花盘醇提物的制备：将100g葵花盘剪成3cm的小块装入2L圆底烧瓶中，加入葵花盘质量的10倍量80％乙醇溶液，浸泡30min后，加热煎煮1.5h，过滤收集滤液，继续加入10倍量80％乙醇溶液将药渣煎煮1.5h，过滤合并滤液，将滤液浓缩烘干，得到组合物。

2、组合物中酚酸的含量测定

实验操作同实施例1中2的含量测定步骤。

重复3次前文所述葵花盘80％醇提工艺，对每次提取得到的组合物进行测定，实验结果见表4。

表4采用80％醇提取工艺得到的组合物中酚酸的含量测定结果

由表4记载的试验数据可知，采用此对比例的方法制备得到的组合物中酚酸占比为1.06～1.16之间。

对比例3

1、葵花盘80％醇提水沉工艺

(1)葵花盘80％醇提物的制备：实验操作同对比例2中1的操作步骤，得到提取液。

(2)葵花盘醇提水沉物的制备

上述提取液浓缩至密度为1.1g/mL，然后加入该体积的40倍量水，静置12h后过滤，将滤液烘干，得到组合物。

2、组合物含量测定

实验操作同实施例1中2的含量测定步骤。

重复3次前文所述葵花盘80％醇提水沉工艺，对每次提取得到的组合物进行测定，实验结果见表5。

表5采用醇提水沉工艺提取得到的组合物中酚酸的含量测定结果

由表5记载的试验数据可知，采用此对比例的方法制备得到的组合物中酚酸占比为9.0～10.1之间。

应用例1

药效学实验

1、实验材料

(1)供试品

四个不同工艺即实施例1、对比例1～3制备得到的组合物。

(2)阳性对照药

苯溴马隆：德国赫曼大药厂(Excella GmbH&Co.KG)，昆山龙灯瑞迪制药有限公司分装，生产批号：1806602，国药准字J20180056，有效期至2023年5月22日；

(3)溶媒的选择

鉴于阳性药在不同溶媒之中的溶解和分散情况不同，本研究根据阳性药的溶解情况在酵母联合氧嗪酸钾引起的小鼠高尿酸血症实验中，使用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液(w/w)溶解阳性药及葵花盘提取物，此外实验中涉及到的酵母溶液的配置以及氧嗪酸钾溶液的配置也使用0.5％的羧甲基纤维素钠作为溶媒。

(4)实验动物

基于现有研究及临床表现，男性HUA患病率高于女性，对于其发病机制，目前认为主要是不同性别体内性激素水平差异所致，雄激素是XDH/XO活力诱导剂，雌激素是该酶活力抑制剂，它们在转录水平上发挥调节作用，从而影响与嘌呤代谢相关的酶的活性，进一步影响血UA的代谢。因此，本项目在进行HUA及其后期痛风有关的研究中，选用雄性动物，以期获得更为符合临床的研究效果。

参与最终实验的实验动物为雄性C57BL/6N小鼠70只，6周龄，SPF级，实验动物均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2016-0006。

实验动物数量依据实验动物伦理福利进行确定，上述实验动物选择饲养在屏障环境，实验单位许可证编号SYXK(京)2019-0003，适用范围为屏障级小鼠、大鼠、豚鼠、兔，其中大鼠饲养于实验室三，小鼠饲养于实验室五。

动物饲料为SPF级大小鼠维持饲料，由北京科澳协力饲料有限公司提供，产品批号：20043213，生产日期：20200410，保质期为六个月。

实验动物饮用水为纯净水，易神州(北京)科技有限公司生产的RO-300型反渗透制水机制得。

(5)试剂

氧嗪酸钾(Oxonic acidpotassium salt)，Sigma公司产品，Lot：STBH8632；

酵母粉，OXOID公司产品，Lot：2746246-02；

羧甲基纤维素钠(300-800mPaS)，国药集团化学试剂有限公司，批号：20181211；

RIPA组织/细胞裂解液，Solarbio产品，Lot：R0020；

SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒，碧云天产品，Lot：P0012AC；

BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio产品，Lot：PC0020；

PageRulerPrestained Protein Ladder，thermo scientific产品，Lot：26616；

Difco TM Skim Milk，Biotopped产品，Lot：232100；

Beta Actin Rabbit Polyclonal antibody，Proteintech产品，Lot：20536-1-AP；

URAT1 Rabbit Polyclonal antibody，Proteintech产品，Lot：14937-1-AP；

尿酸测定试剂盒(尿酸酶法)，中生北控生物科技股份有限公司，批号：190902，有效期到2021年9月。

(6)仪器

BTM21C手持红外测温仪，BSIDE公司生产；

Synergyhio酶标仪，Biotek公司生产；

离心机，日本久保田公司产品，型号KUBOTA5922；

电子天平Sartorius BP211D用于210实验室中痕量物质的定量称量；

电子天平Sartorius BSA3202S-CW(序列号24790283、24790266、36892266)分别用于小鼠实验中实验动物体重、饲料量的称量。

电泳仪，美国Bio-RadPowerPacTM Basic公司生产；

凝胶成像分析仪(MP Imaging System)，美国BD ChemiDocTM公司生产；

酶标仪，BioTek Synergy H1 microplate reader公司生产。

2、给药剂量、方式及配置

灌胃体积：0.2mL/10g(酵母)、0.1mL/10g(苯溴马隆、实施例1提取得到的组合物、对比例1～3提取得到的组合物)。

腹腔注射体积：0.1mL/10g。

(1)供试品的剂量

根据相关文献(《Hepatoprotective effect ofcalculus bovis sativus onnonalcoholic fatty liver disease in mice by inhibiting oxidative stress andapoptosis ofhepatocytes》，Wenxi H,Yanjiao X,Chengliang Z,et al.Drug Design,Development and Therapy,2017,Volume 11:3449-3460；《DBZ is a putative PPARγagonist that prevents high fat diet-induced obesity,insulin resistance andgut dysbiosis》Xu P,Hong F,Wang J,et al.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,2017,1861(11PtA):2690；《萆薢总皂苷对大鼠慢性高尿酸血症和肾小管尿酸转运体1表达的影响》，陈光亮，朱立然，那莎，李莉.中国中药杂志,2013,38(14):2348-2353；《桑叶黄酮对腺嘌呤诱导大鼠高尿酸血症肾损伤的防治作用》，王珂，王瑞坡，李姣，赵頔，王洁琼，冉霞，瞿伟菁.天然产物研究与开发，2012，24(02):172-175+202)的给药剂量对给药浓度进行了梯度实验，并考虑工艺原材料消耗成本不采用高剂量，低剂量具有降尿酸效果，但无统计学意义，因此确定最优给药剂量为200mg/kg。

(2)阳性对照药的剂量

苯溴马隆：依据人使用剂量50mg(药片)/人/天计算，按照人和动物间体表面积折算，计算得小鼠的给药剂量为50mg/70kg×70kg×0.0026/0.02kg＝6.5mg/kg。

(3)药物的配置

(a)0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)

称取1g羧甲基纤维素钠粉末，溶于199mL去离子水，磁力搅拌，待粉末完全溶解后常温密封保存。

(b)1g/mL酵母溶液

称取50g酵母粉，溶于50ml0.5％的羧甲基纤维素钠溶液，搅拌均匀，现配现用。

(c)30mg/mL氧嗪酸钾溶液

称取1.2g氧嗪酸钾粉末，溶于40mL羧甲基纤维素钠，斡旋混匀，现配现用。

(d)苯溴马隆(成人口服50mg/天)

称取苯溴马隆19.5mg溶于30mL 0.5％CMC-Na中。

(e)200mg/kg葵花盘提取物

配药浓度：10mg/mL

称取200mg葵花盘实施例1、对比例1～3提取得到的组合物，溶于8mL羧甲基纤维素钠，并定容至10mL，混匀待用。

3、实验分组

酵母联合氧嗪酸钾致小鼠高尿酸血症实验分为7组，分组10只，分别为空白组、模型组、苯溴马隆组(6.5mg/kg)、实施例1提取得到的组合物(T₁)(200mg/kg)、对比例1提取得到的组合物(T₂)(200mg/kg)、对比例2提取得到的组合物(T₃)(200mg/kg)、对比例3提取得到的组合物(T₄)(200mg/kg)。

4、统计学处理

实验数据均采用均数±标准差表示，实验的组间差异比较采用Student’stest检验，利用SPSS 20软件进行统计分析及数据处理。

5、实验方法和结果

取雄性C57BL/6N小鼠70只，体重17-20g，按照体重随机分组，每组10只，分别为空白组、模型组、阳性药苯溴马隆组(6.5mg/kg)、实施例1提取得到的组合物(T₁)(200mg/kg)、对比例1提取得到的组合物(T₂)(200mg/kg)、对比例2提取得到的组合物(T₃)(200mg/kg)、对比例3提取得到的组合物(T₄)(200mg/kg)。

适应性饲养结束后，开始实验，从实验第1天(D1)至第5天(D5)结束，空白组依次灌胃和腹腔注射0.5％的羧甲基纤维素钠(空白溶媒)，其余实验动物利用酵母联合氧嗪酸钾进行造模，灌胃给予酵母后随即腹腔注射氧嗪酸钾，其中酵母的给药剂量为15g/kg，灌胃容积为0.2mL/10g(体重)，氧嗪酸钾的给药剂量为300mg/kg，给药容积为0.1mL/10g(体重)，实验第3天起至实验第5天，每天造模前1h后给予不同的药物，评估葵花盘提取物是否具有降低血尿酸的作用，即除空白组和模型组实验动物灌胃给与对应体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液外，其余实验组实验动物灌胃给予对应的治疗药物，灌胃容积为0.1mL/10g(体重)。

实验第5天，造模后1h，小鼠摘眼球取血，血样于4℃冰箱中静置一夜后以3500r/min转速离心10min，收集上层血清，利用尿酸酶试剂盒检测血清UA浓度，具体结果如表6所示。

表6实施例1、对比例1～3提取得到的组合物对酵母联合氧嗪酸钾致HUA小鼠血UA含量的影响(x±SD)

注:与空白组比较,^###p<0.001；与模型对照组比较,^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001.

由表6结果可见，模型组血清UA水平显著增高，与空白组比较，差异具有统计学意义(p<0.05)，表明酵母联合氧嗪酸钾成功复制了小鼠HUA模型；四个不同工艺的葵花盘提取物给药后，实验动物血清UA水平明显下降，与模型对照组比较，差异具有统计学意义(p<0.001、p<0.01、p<0.01、p<0.05)，四个不同工艺的葵花盘提取物0.2g/kg对酵母联合氧嗪酸钾复制的小鼠HUA模型具有明显的降低UA作用。阳性药苯溴马隆也具有降低血UA的作用，且差异具有统计学意义(p<0.05)。另外，实验结果表明本实验水提过大孔树脂工艺的提取物对酵母联合氧嗪酸钾复制的小鼠HUA模型降低UA作用优于阳性对照药苯溴马隆。

应用例2

取小鼠肾脏组织，提取组织中蛋白。

操作方法：称量组织50mg，剪碎置于300μL RIPA蛋白裂解液中。适当研磨后，4℃12000r/min离心10min，，吸取上清至新离心管，-20℃保存备用。

2、蛋白定量：

(1)配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂(BCA试剂盒)(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀(混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失)。BCA工作液室温24小时内稳定。(预实验9个样品+24个标准品，6600μL，配制7140μL，即7000μLBCA试剂：140μL Cu试剂)

(2)稀释标准品(3个平行)：取30μLBSA标准品用PBS稀释至300μL(样品一般可用PBS稀释)，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0μL、2μL、4μL、6μL、8μL、12μL、16μL和20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20μL。

(3)各孔加入200μL BCA工作液，再加20μL到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量样品时误差偏大，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。

(4)37℃放置15～30min。用酶标仪测定A 562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。

3、蛋白质变性：取上述调整好浓度的蛋白80μL)到新的离心管内，按照4:1的比例加入20μL 5×Loading Buffer，封口，置于95℃金属浴变性5min。

4、SDS-PAGE凝胶电泳(凝胶试剂盒)

(1)按照下表配制浓度为5％浓缩胶和12％分离胶，将分离胶溶液灌注电泳板内，在上层加入蒸馏水封平。

本应用例中配制电泳分离胶和浓缩胶的步骤如表7所示。

表7电泳分离胶和浓缩胶的步骤

(2)观察分离胶彻底聚合后(约30min)，将蒸馏水除去，经滤纸将多余溶液除去，添加浓缩胶，迅速将干净梳子插入其中。

(3)当浓缩胶彻底聚合后(约40min)，拔出梳子放入电泳板，添加电泳缓冲液，上样电泳。将浓缩胶置于90V电压下约30min，分离胶恒压120V约60min后停止电泳。

5、转膜及封闭(滤纸和海绵提前用转膜液浸泡)

(1)转膜：剪取凝胶，制为大小相当的PVDF模，浸泡至甲醇内激活处理10s，于Transfer Buffer内放置20min。根据黑→海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵→白的顺序安装，200mA转膜处理120min。用TBST溶液洗3遍，每遍15min。当完成转膜后，电源切断后，将膜取出，于左上侧剪一小口。

(2)封闭：于封闭液(5％脱脂奶粉，TBST稀释)内放入PVDF膜，常温环境下置于摇床上封闭处理1h。

6、URAT1抗体(一抗、二抗)孵育过程

(1)一抗孵育：将一抗按比例1:500加入封闭液中。孵育过夜结束后，用TBST洗膜10min重复三次。

(2)二抗孵育：将二抗按照1:2000比例加入到新配封闭液中，室温下在摇床上孵育1h。孵育结束后，用TBST洗膜10min重复三次。

7、蛋白检测

(1)将ECL显影液A、B液等量混匀配制显影工作液，将工作液滴在膜上，避光反应2min，以β-actin作为内参，显影仪中曝光。

(2)通过各蛋白条带的灰度值进行定量分析，本实验重复3次。

实验结果如图2所示：通过蛋白印记，我们检测了实施例1、对比例1～3中4组组合物对小鼠肾脏尿酸转运蛋白URAT1表达水平的影响。结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肾脏URAT1蛋白显著升高，差异具有统计学意义(P<0.001)；与模型组相比，四个不同工艺的葵花盘提取物均显著降低了URAT1蛋白的表达，差异具有统计学意义差异具有统计学意义(p<0.001、p<0.001、p<0.001、p<0.001)。阳性药苯溴马隆也可以抑制URAT1蛋白的表达，且差异具有统计学意义(p<0.001)。另外，实验结果表明，四个工艺的提取物对URAT1蛋白的抑制作用均优于阳性药苯溴马隆对URAT1蛋白的抑制作用，但本发明所述方法制备得到的组合物，即水提过大孔树脂工艺的提取物药效最佳。

综上所述，本实验采用高尿酸血症小鼠模型对四个不同工艺的葵花盘提取物进行了降尿酸的考察，结果显示，通过灌胃给药不同工艺的葵花盘提取物可显著的降低小鼠血尿酸水平，可显著降低URAT1蛋白的表达。其中采用本发明所述方法得到的组合物药效最佳，且效果优于阳性对照。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。