具体实施方式

本申请提供了具有带茎环结构的有义链和反义链的双链核酸抑制剂分子，其中所述茎环结构的环部分是三元环。双链核酸抑制剂分子包含：在有义链(S)的第一区域(R1)和反义链(AS)之间的第一双链体(D1)和有义链的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)之间的第二双链体(D2)，其中S1和S2由三元环(triL)接合。参见图1A-1D。另外，在某些实施方案中，茎环结构的茎部分可以包含至少一个增加T_m的核苷酸，诸如4-12个增加T_m的核苷酸，例如2-6个增加T_m的核苷酸碱基对。茎环结构可位于有义链的5'-或3'-端。如本文所公开，含有三元环的双链核酸抑制剂分子在降低靶基因表达方面具有活性。此外，在某些实施方案中，与其含有四元环的对应物相比，含有三元环的双链核酸抑制剂分子可以增加靶基因表达的效力。

还提供了使用本文公开的含有三元环的双链核酸抑制剂分子和包含其的组合物在体外或体内降低靶基因的水平或表达的方法，包括用于治疗疾病的方法和组合物。

含有三元环的核酸抑制剂分子

本申请公开了具有带有茎环结构的有义链和反义链的双链核酸抑制剂分子，其中茎环结构的环部分是三元环并且其中有义链和反义链是各自具有5'-端和3'-端的单独的链，因此不形成连续的寡核苷酸。典型的含茎/环的双链核酸抑制剂分子示于图1A中，其中突出显示了有义链(“S”)和反义链(“AS”)。

有义链可进一步分为与反义链(AS)形成第一双链体(D1)的第一区域(R1)和包括接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的环(triL)的第二区域(R2)，如图1B和图1C所示。S1和S2彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，也称为茎或茎双链体。参见例如图1C和1D。如本文所述，环是三元环。通常，三元环具有序列GAA，但可以使用其他三元环序列，这些三元环序列能够使相邻双链体的解链温度(Tm)增加，其高于根据由随机碱基组成的简单模型环序列所预期的。第二双链体(D2)可以包含至少一个增加T_m的核苷酸，并且在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的所有核苷酸可以是增加T_m的核苷酸。通常，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不含任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸分子为dsRNAi抑制剂分子。

在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链含有茎双链体(D2)和环(triL)并且长度为20-65个核苷酸，所述茎双链体含有至少一个增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，茎双链体的长度为2-6个碱基对。在某些实施方案中，反义链的长度为15-40个核苷酸。

在某些实施方案中，有义链含有茎双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为20-65个核苷酸，并且反义链的长度为15-40个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的含有茎双链体(D2)和三元环(triL)的延伸部分在所述链的3'-端。在某些其他实施方案中，有义链的含有茎(D2)和三元环(triL)的延伸部分在所述链的5'-端。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成18-24个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链包含第二双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为27-35个核苷酸，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为27-35个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为27-33个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为29-31个核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有3个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有4个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有5个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有6个碱基对的长度并且不含有任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1、2、3或4个核苷酸的单链突出端。通常，在反义链的3'-端处的单链突出端由2个核苷酸组成。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成18-22个碱基对的第一双链体(D1)，诸如20个核苷酸，其中有义链包含第二双链体(D2)和三元环(triL)并且长度为27-35个核苷酸，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸，诸如长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，D1具有19-21个碱基对的长度。在某些实施方案中，反义链的长度为20-22个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为29-33个核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度并且不含有任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1-5个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链在其3'-端具有1、2、3或4个核苷酸的单链突出端。通常，在反义链的3'-端处的单链突出端由2个核苷酸组成。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成19-21个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有19-21个核苷酸的第一区域(R1)和7-15个核苷酸的第二区域(R2)，所述第二区域包含接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的三元环(triL)，其中S1和S2中的每一个的长度为2-6个核苷酸并且彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为20-24个核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3'末端具有两个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为2-5个核苷酸。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度并且含有增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度并且不含有增加T_m的核苷酸。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是单独的链并形成20个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有20个核苷酸的第一区域(R1)和7-9个核苷酸的第二区域(R2)，所述第二区域包含接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的三元环(triL)，其中反义链的长度为22个核苷酸并且在其3'-端具有两个核苷酸的单链突出端，并且其中S1和S2中的每一个都包含双环核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为3个核苷酸并且形成三个碱基对的第二双链体(D2)。在某些实施方案中，S1和S2中的每一个的长度为2个核苷酸并且形成两个碱基对的第二双链体(D2)。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸都是增加T_m的核苷酸，并且双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不包含任何增加T_m的核苷酸。

在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)具有2-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2-4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度。

在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有4-10个增加T_m的核苷酸并且具有2-5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有6-8个增加T_m的核苷酸并且具有3-4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有6个增加T_m的核苷酸并且具有3个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2含有4个增加T_m的核苷酸并且具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2中的每个核苷酸都是增加T_m的核苷酸。

在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有单个增加T_m的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度。在本文所述的含有三元环的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)含有2-6个单个增加T_m的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度，其中D2中没有一个增加T_m的核苷酸形成碱基对。例如，D2可以包含2个增加T_m的核苷酸并且具有2-6个碱基对的长度，其中2个增加T_m的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含3个增加T_m的核苷酸并且具有3-6个碱基对的长度，其中3个增加T_m的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含4个增加T_m的核苷酸并且具有4-6个碱基对的长度，其中4个增加T_m的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含5个增加T_m的核苷酸并且具有5-6个碱基对的长度，其中5个增加T_m的核苷酸不形成碱基对。D2也可以包含6个增加T_m的核苷酸并且具有6个碱基对的长度，其中6个增加T_m的核苷酸不形成碱基对。

在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子不包含任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在有义链的第一区域(R1)或反义链中不含任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不含任何增加T_m的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)中不含任何增加T_m的核苷酸。

含三元环的双链核酸分子的第二双链体(D2)中的一个或多个增加T_m的核苷酸可以是本文所述或本领域中以其他方式可用的增加T_m的核苷酸中的任一种。在某些实施方案中，双链核酸分子在第二双链体(D2)中含有至少两个增加T_m的核苷酸，并且第二双链体中的每个增加T_m的核苷酸是相同的。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)中含有至少两个不同的增加T_m的核苷酸。

在本文所述的任何含有三元环的双链核酸分子中，一个或多个增加T_m的核苷酸可以是本文所述的或本领域以其他方式可获得的任何双环核苷酸。在本文所述的任何含三元环的双链核酸分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸包含双环糖部分，其中双环糖部分是取代的呋喃糖基，其包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳的桥。

在本文所述的任何含有三元环的双链核酸抑制剂分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸具有式I、II、III、IV、Va或Vb的结构。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸可以具有式I的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式II的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式III的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IV的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Va的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Vb的结构。

第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式Ia、Ib、Ic、Id、Ie或If中的一个或多个的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IIa、IIb、IIc或IId中的一个或多个的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IIIa和/或IIIb的结构。第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸也可以具有式IVa和/或IVb的结构。

在本文所述的任何含有三元环的双链核酸分子中，第二双链体(D2)中的至少一个双环核苷酸(BN)为以下中的一个或多个：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)亚丙基碳环BN。在一个实施方案中，至少一个BN为(a)亚甲氧基BN或(d)氧氨基BN，其中R₂为CH₃。例如，D2中的至少一个BN为氧氨基BN(d)，其中R₂为CH₃。

双环核苷酸

本文公开的含三元环的双链核酸抑制剂分子含有有义链和反义链，并且在某些实施方案中，在有义链中存在的茎环结构的茎部分中可以含有至少一个双环核苷酸。双环核苷酸通常具有含4至7元环的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而产生双环结构。在某些实施方案中，桥连接第一环的2'-碳和4'-碳以形成第二环。此类双环核苷酸具有各种名称，包括分别用于双环核酸和锁核酸的BNA和LNA。双环核苷酸的合成及其在核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，包括例如，Singh等人,CHEM.COMMUN.,1998,4,455-456；Koshkin等人,TETRAHEDRON,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,BIOORG.MED.CHEM.LETT.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.ORG.CHEM.,1998,63,10035-10039；美国专利号7,427,672、7,053,207、6,794,499、6,770,748、6,268,490和6,794,499；以及已公布的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807；其各自以引用方式整体并入本文。

通常，桥含有2至8个原子。在某些实施方案中，桥含有3个原子。在某些实施方案中，桥含有4个原子。在某些实施方案中，桥含有5个原子。在某些实施方案中，桥含有6个原子。在某些实施方案中，桥含有7个原子。在某些实施方案中，桥含有8个原子。在某些实施方案中，桥含有超过8个原子。

在某些实施方案中，双环糖部分为取代的呋喃糖基，所述呋喃糖基包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥。在某些实施方案中，双环核苷酸具有式I的结构：

其中B为核碱基；

其中G为H、OH、NH₂、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、取代的C₁-C₆烷基、取代的C₂-C₆烯基、取代的C₂-C₆炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇基或取代的硫代；

其中X为O、S或NR₁，其中R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、苯或芘；并且

其中W_a和W_b各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式I表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中W_a或W_b中的至少一个为将由式I表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在式I的某些实施方案中，G为H并且X为NR₁，其中R₁为苯或芘。在式I的某些实施方案中，G为H并且X为S。

在式I的某些实施方案中，G为H并且X为O：

在式I的某些实施方案中，G为H并且X为NR₁，其中R₁为H、CH₃或OCH₃：

在式I的某些实施方案中，G为OH或NH₂并且X为O。

在式I的某些实施方案中，G为OH并且并且X为O：

在式I的某些实施方案中，G为NH₂并且X为O：

在式I的某些实施方案中，G为CH₃或CH₂OCH₃并且X为O。在式I的某些实施方案中，G为CH₃并且X为O：

在式I的某些实施方案中，G为CH₂OCH₃并且X为O：

在某些实施方案中，双环核苷酸具有式II的结构：

其中B为核碱基；

其中Q₁为CH₂或O；

其中X为CH₂、O、S或NR₁，其中R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、苯或芘；

其中如果Q₁为O，则X为CH₂；

其中如果Q₁为CH₂，则X为CH₂、O、S或NR₁，其中R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、苯或芘；

其中W_a和W_b各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式II表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中W_a或W_b中的至少一个为将由式II表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在式II的某些实施方案中，Q₁为O并且X为CH₂：

在式II的某些实施方案中，Q₁为CH₂并且X为O：

在式II的某些实施方案中，Q₁为CH₂并且X为NR₁，其中R₁为H、CH₃或OCH₃：

在式II的某些实施方案中，Q₁为CH₂并且X为NH：

在某些实施方案中，双环核苷酸具有式III的结构：

其中B为核碱基；

其中Q₂为O或NR₁，其中R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、苯或芘；

其中X为CH₂、O、S或NR₁，其中R₁为H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、苯或芘；

其中如果Q₂为O，则X为NR₁；

其中如果Q₂为NR₁，则X为O或S；

其中W_a和W_b各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式III表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中W_a或W_b中的至少一个为将由式III表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在式III的某些实施方案中，Q₂为O并且X为NR₁。在式III的某些实施方案中，Q₂为O并且X为NR₁，其中R₁是C₁-C₆烷基。在式III的某些实施方案中，Q₂为O并且X为NR₁并且R₁为CH₃。

在式III的某些实施方案中，Q₂为O并且X为NR₁并且R₁为CH₃：

在式III的某些实施方案中，Q₂为NR₁并且X为O。在式III的某些实施方案中，Q₂为NR₁，其中R₁为C₁-C₆烷基并且X为O。

在式III的某些实施方案中，Q₂为NCH₃并且X为O：

在某些实施方案中，双环核苷酸具有式IV的结构：

其中B为核碱基；

其中P₁和P₃为CH₂，P₂为CH₂或O并且P₄为O；并且

其中W_a和W_b各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式IV表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中W_a或W_b中的至少一个为将由式IV表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在式IV的某些实施方案中，P₁、P₂和P₃为CH₂，并且P₄为O：

在式IV的某些实施方案中，P₁和P₃为CH₂，P₂为O并且P₄为O：

在某些实施方案中，双环核苷酸具有式Va或Vb的结构：

其中B为核碱基；

其中r1、r2、r3和r4各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基、取代的C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、取代的C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、取代的C₂-C₁₂炔基、C₁-C₁₂烷氧基、取代的C₁-C₁₂烷氧基、OT₁、ST₁、SOT₁、SO₂T₁、NT₁T₂、N3、CN、C(＝O)OT₁、C(＝O)NT₁T₂、C(＝O)T₁、O─C(＝O)NT₁T2、N(H)C(＝NH)NT₁T₂、N(H)C(＝O)NT₁T₂或N(H)C(＝S)NT₁T₂，其中T1和T2各自独立地为H、C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₁₆烷基；或

r1和r2或r3和r4一起为＝C(r5)(r6)，其中r5和r6各自独立地为H、卤素、C₁-C₁₂烷基或取代的C₁-C₁₂烷基；并且

其中W_a和W_b各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分或将由式V表示的核苷酸附接到另一个核苷酸或寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中W_a或W_b中的至少一个为将由式V表示的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在某些实施方案中，双环糖部分是包含桥的取代的呋喃糖基，所述桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环，其中连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳的桥包括但不限于：

a)4'-CH₂-O-N(R)-2'和4'-CH₂-N(R)-O-2'，其中R为H、C₁-C₁₂烷基或保护基团，包括例如4'-CH₂-NH-O-2'(也称为BNA^NC)、4'-CH₂-N(CH₃)-O-2'(也称为BNA^NC[NMe])，(如美国专利号7,427,672中所述，其据此以引用方式整体并入)；

b)4'-CH₂-2'、4'-(CH₂)₂-2'、4'-(CH₂)₃-2'、4'-(CH₂)-O-2'(也称为LNA)、4'-(CH₂)-S-2'、4'-(CH₂)₂-O-2'(也称为ENA)、4'-CH(CH₃)-O-2'(也称为cEt)和4'-CH(CH₂OCH₃)-O-2'(也称为cMOE)，及其类似物(如美国专利号7,399,845中所述，其据此以引用方式整体并入)；

c)4'-C(CH₃)(CH₃)-O-2'及其类似物(如美国专利号8,278,283中所述，其据此以引用方式整体并入)；

d)4'-CH₂-N(OCH₃)-2'及其类似物(如美国专利号8,278,425中所述，其据此以引用方式整体并入)；

e)4'-CH₂-O-N(CH₃)-2'及其类似物(如美国专利公开号2004/0171570，其据此以引用方式整体并入)；

f)4'-CH₂-C(H)(CH₃)-2'及其类似物(如Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-34中所述，其据此以引用方式整体并入)；以及

g)4'-CH₂-C(＝CH₂)-2'及其类似物(如美国专利号8278426中所述，其据此以引用方式整体并入)。

在某些实施方案中，双环核苷酸(BN)是以下中的一种或多种：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)亚丙基碳环BN，如下所示。

在上述(a)至(i)的双环核苷酸中，B是核碱基，R₂是H或CH₃，并且W_a和W_b各自独立地是H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将所述双环核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，其中W_a或W_b中的至少一个是将所述双环核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。

在氧氨基BN(d)的一个实施方案中，R₂为CH₃，如下(也称为BNA^NC[NMe])：

在某些实施方案中，双环糖部分和掺入了此类双环糖部分的双环核苷酸由异构构型进一步定义。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为α-L构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为β-D构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈α-L构型(α-L LNA)的2'O,4'-C-亚甲基桥(2'-O-CH₂-4')。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为R构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为S构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈S-构型的4'-CH(CH₃)-O-2'桥(即，cEt)。

三环核苷酸

在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸可以是三环核苷酸。三环核苷酸的合成及其向核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，所述文献包括例如，Steffens等人，J.AM.CHEM.SOC.1997；119:11548-11549；Steffens等人，J.ORG.CHEM.1999；121(14):3249-3255；Renne berg等人，J.AM.CHEM.SOC.2002；124:5993-6002；Ittig等人，NUC LEIC ACIDSRES.2004；32(1):346-353；Scheidegger等人，Chemistry 2006；12:8014-8023；Ivanova等人，OLIGONUCLEOTIDES 2007；17:54-65；这些文献中的每一个各自据此以引用方式整体并入本文。

在某些实施方案中，三环核苷酸是三环的核苷酸(也称为三环的DNA)，其中3'-碳和5'-碳中心通过与环丙烷环稠合的亚乙基连接，如例如在Leumann CJ,Bioorg.Med.Chem.2002；10:841-854以及已公布的美国申请2015/0259681和2018/0162897中所述的，所述参考各自据此以引用方式并入。在某些实施方案中，三环核苷酸包含取代的呋喃糖基环和第三稠合环，所述呋喃糖基环包含连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳以形成第二环的桥，所述第三稠合环由将5'-碳连接到桥(所述桥连接呋喃糖基的2'-碳和4'-碳)的亚甲基的基团产生，如例如在已公布的美国申请2015/0112055中所述的，所述参考据此以引用方式并入本文。

其他增加T_m的核苷酸

除双环和三环核苷酸外，其他增加T_m的核苷酸可在本文所述的核酸抑制剂分子中使用。例如，在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物(Wilds等人,Chem,2002；114:123和Wilds等人,Chim Acta 2003；114:123)、己糖醇核苷酸(Herdewijn,Chem.Biodiversity 2010；7:1-59)或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可具有修饰的核碱基，如本文所述，包括例如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基修饰的嘧啶或2-氨基腺嘌呤(也称为2,6-二氨基嘌呤)(Deleavey等人,Chem.&Biol.2012；19:937-54)或2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷和假尿苷。修饰的核苷酸还可具有修饰的糖部分，如例如美国专利号8,975,389中所述，所述参考据此以引用方式并入，或如本文所述，除了增加T_m的核苷酸在糖部分的2'-碳处未用2'-F或2'-OMe修饰。

在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为双环核苷酸。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为三环核苷酸。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为己糖醇核苷酸。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为双环或三环核苷酸。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸或G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹、胍G-夹或其类似物、或己糖醇核苷酸。

在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸的每次掺入使核酸抑制剂分子的第二双链体(D2)的T_m增加至少2℃。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸的每次掺入使D2的T_m增加至少3℃。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸的每次掺入使D2的T_m增加至少4℃。在某些实施方案中，增加T_m的核苷酸的每次掺入使D2的T_m增加至少5℃。

其他修饰

本文所述的双链核酸抑制剂分子除第二双链体(D2)中的至少一个增加T_m的核苷酸以外，还可含有其他核苷酸修饰。通常，双链核酸抑制剂分子的多个核苷酸被修饰以改善分子的各种特性，诸如对核酸酶的抗性或降低的免疫原性。参见例如，Bramsen等人,(2009),Nucleic Acids Res.,37,2867-2881。许多核苷酸修饰已用于寡核苷酸领域，特别是用于核酸抑制剂分子。可在核苷酸的包括糖部分、磷酸二酯键和核碱基的任何部分上进行此类修饰。核苷酸修饰的典型实例包括但不限于2'-F、2'-O-甲基(“2'-OMe”或“2'-OCH3”)和2'-O-甲氧基乙基(“2'-MOE”或“2'-OCH2CH2OCH3”)。如本文所述，修饰也可发生在核苷酸的糖部分的其他部分，诸如5'-碳处。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子还可在1'-位处包括除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的一种或多种如本领域已知和如本文所述的修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含有氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含有核碱基(无碱基)。修饰的核碱基的典型实例为5'-甲基胞嘧啶。

RNA和DNA的天然存在的核苷酸间键为3'-至5'-磷酸二酯键。修饰的磷酸二酯键包括非天然存在的核苷酸间连接基团，包括如本领域已知和如本文所述的含有磷原子的核苷酸间键和不含磷原子的核苷酸间键。通常，如本文所述，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团。在其他实施方案中，如本文所述，双链核酸抑制剂分子的核苷酸间连接基团中的一个或多个为非含磷键。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团和一个或多个不含磷核苷酸间连接基团。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有少于10个，诸如少于5个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有4个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。

双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端可包括天然取代基，诸如羟基或磷酸酯基团。在某些实施方案中，羟基基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端。在某些实施方案中，磷酸酯基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端。通常，在寡核苷酸合成之前将磷酸酯加入单体中。在其他实施方案中，在将核酸抑制剂分子引入到细胞质中之后，例如通过胞质Clp1激酶自然地实现5'-磷酸化。在一些实施方案中，5'-末端磷酸酯为磷酸酯基团，诸如5'-单磷酸酯[(HO)₂(O)P-O-5']、5'-二磷酸酯[(HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5']或5'-三磷酸酯[(HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-0-5']。

双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端也可被修饰。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端附接至氨基磷酸酯[(HO)₂(O)P-NH-5'，(HO)(NH₂)(O)P-O-5']。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-末端附接至磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物包括5'-膦酸酯，诸如5'-亚甲基膦酸酯(5'-MP)，5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。Lima等人,Cell,2012,150-883-94；WO2014/130607。其他合适的磷酸酯模拟物包括与寡核苷酸的5'-末端核苷酸的糖部分(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)的4'-碳结合的4-磷酸酯类似物，如国际公开号WO 2018/045317中所述，所述参考据此以引用方式整体并入。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5'-端附接至氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子与糖部分或其类似物的4'-碳结合。在其他实施方案中，磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子与糖部分或其类似物的4'-碳结合。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个脱氧核糖核苷酸。通常，双链核酸抑制剂分子含有少于5个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有核苷酸都是核糖核苷酸。

在某些实施方案中，在双链核酸抑制剂分子的茎(第二双链体或D2)之外的一个或多个核苷酸含有具有修饰的环结构的糖部分，包括但不限于如本文所述的存在于双环或三环核苷酸中的修饰的环结构，以及解锁核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013),Molecular Therapy–Nucleic Acids,2,e103(doi:10.1038/mtna.2013.36))。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的一个或两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。通常，谷胱甘肽敏感部分位于糖部分的2'-碳处并且包含磺酰基。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分与亚磷酰胺寡核苷酸合成方法相容，如国际公开号WO 2018/045317中所述，所述参考据此以引用方式整体并入。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，核苷酸中的大多数被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有或基本上所有核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。

所述至少一个谷胱甘肽敏感部分通常位于双链核酸抑制剂分子的有义链或反义链的5'-末端或3'-末端核苷酸处。然而，所述至少一个谷胱甘肽敏感部分可位于双链核酸抑制剂分子中任何所关注的核苷酸处。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子被完全修饰，其中有义链和反义链的每个核苷酸均被修饰；通常，每个核苷酸在糖部分的2'-位被修饰。在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子不含可逆修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链的至少一个，诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的反义链的至少一个诸如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸被修饰。

在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子被一个或多个可逆的谷胱甘肽敏感部分修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的基本上所有的核苷酸均被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的少于一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰修饰。修饰可在核酸抑制剂分子上的基团中发生，或者可散布不同的修饰核苷酸。

在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，从一个至每个核苷酸在2'-碳处被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子用2'-F、2'-OMe和/或2'-MOE部分或完全修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，从一个至每个磷原子被修饰并且从一个至每个核苷酸在糖部分的2'-碳处被修饰。

在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处被修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了在有义链的第二区域(R2)中的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了在茎(第二双链体或D2)中增加T_m的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了茎(第二双链体或D2)中增加T_m的核苷酸和三元环中与配体部分(诸如GalNAc)缀合的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2'-碳处用2'-F或2'-OMe修饰。

降低靶基因表达的方法

如本文所述，含三元环的双链核酸抑制剂分子可在降低所关注的任何靶基因的靶mRNA表达的方法中使用。通常，降低mRNA表达的方法包括以足以降低靶基因的mRNA表达的量向样本或有需要的受试者施用如本文所述的双链核酸抑制剂分子。所述方法可在体外或体内进行。

靶RNA的水平或活性可通过本领域目前已知的或以后开发的合适的方法来确定。可以理解，用于测量靶RNA和/或靶基因的“表达”的方法可取决于靶基因及其编码的RNA的性质。例如，在靶RNA序列编码蛋白质的情况下，术语“表达”可指来源于靶基因(基因组或外源来源)的蛋白质或靶RNA/转录物。在此类情况下，靶RNA的表达可通过直接测量靶RNA/转录物的量或通过测量由靶RNA/转录物编码的蛋白质的量来确定。蛋白质可在蛋白质分析中测量，诸如通过染色或免疫印迹，或者如果所述蛋白质催化可被测量的反应，则通过测量反应速率来测量。所有此类方法是本领域已知的并且可以使用。在将要测量靶RNA水平的情况下，可使用本领域公认的用于检测RNA水平的方法(例如RT-PCR、Northern印迹等)。上述测量可在细胞、细胞提取物、组织、组织提取物或其他合适的源材料上进行。

药物组合物

本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂。

这些药物组合物可通过常规的灭菌技术来灭菌或可被无菌过滤。所得水性溶液可按原样或冻干形式被包装以供使用，冻干制剂在施用之前与无菌水性赋形剂组合。所述制剂的pH通常将在3到11之间，更优选地在5到9之间或在6到8之间，并且最优选在7到8之间，诸如7至7.5。

本公开的药物组合物应用于治疗用途。因此，本公开的一个方面提供了一种药物组合物，其可通过向受试者(包括但不限于患有疾病或病症的人)施用治疗有效量的本公开的药物组合物来用于治疗所述受试者。在某些实施方案中，所述疾病或病状为癌症，如本文所述。

在某些实施方案中，本公开特征在于治疗有效量的如本文所述的药物组合物用于制造治疗有需要的受试者的药物的用途。在某些实施方案中，如本文所述，受试者患有癌症。

药学上可接受的赋形剂

可用于本公开的药学上可接受的赋形剂通常是常规的。Remington’sPharmaceutical Sciences,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA，第15版(1975)描述了适合于一种或多种治疗组合物的药物递送的组合物和制剂。可充当药学上可接受的赋形剂的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；麦芽；明胶；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(等渗盐水；林格氏溶液)；乙醇；pH缓冲溶液；多元醇，诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等；以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。

剂型

药物组合物可与常规赋形剂一起配制用于任何预期的施用途径，其可根据常规实践进行选择。

在一个实施方案中，药物组合物含有如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子，并且适合于肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射。通常，本公开的药物组合物被配制成用于肠胃外施用的液体形式。

适合于胃肠外施用的剂型通常包括一种或多种适合于胃肠外施用的媒介物，包括例如无菌水性溶液、盐水、低分子量醇(诸如丙二醇、聚乙二醇)、植物油、明胶、脂肪酸酯(诸如油酸乙酯)等。肠胃外制剂可含有糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。例如，可以通过表面活性剂的使用来保持适当的流动性。含有双链核酸抑制剂的液体制剂可被冻干并储存，以便以后在用无菌注射溶液重构时使用。

药物组合物也可使用众所周知的技术配制用于其他施用途径，包括局部或透皮施用、直肠或阴道施用、眼内施用、鼻内施用、颊内施用或舌下施用。

递送剂

如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子可与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式结合以有助于摄取、分布或吸收，所述其他分子、分子结构或化合物的混合物包括例如脂质体和脂质，诸如美国专利号6,815,432、6,586,410、6,858,225、7,811,602、7,244,448和8,158,601中公开的那些；聚合物材料，诸如美国专利号6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193、8,137,695和美国公布专利申请号2011/0143434、2011/0129921、2011/0123636、2011/0143435、2011/0142951、2012/0021514、2011/0281934、2011/0286957和2008/0152661中公开的那些；衣壳、类壳体或受体靶向分子。

在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。脂质-核酸纳米颗粒通常在脂质与核酸混合以形成复合物时自发形成。根据所期望的粒度分布，可以使用例如热筒挤出机(诸如挤出机(Northern Lipids,Inc))将所得的纳米颗粒混合物任选地通过聚碳酸酯膜挤出(例如100nm截止值)。为了制备用于治疗用途的脂质纳米颗粒，可能需要除去用于形成纳米颗粒的溶剂(例如，乙醇)和/或交换缓冲液，这可通过例如透析或切向流过滤来实现。制备含有核酸干扰分子的脂质纳米颗粒的方法是本领域已知的，如例如在美国公布的专利申请号2015/0374842和2014/0107178中所公开的。

在某些实施方案中，LNP包含含有阳离子脂质体和聚乙二醇化脂质的核心脂质组分。LNP还可包含一种或多种包膜脂质，诸如阳离子脂质、结构或中性脂质、固醇、聚乙二醇化脂质、或它们的混合物。

用于LNP的阳离子脂质是本领域已知的，如例如在美国公布的专利申请号2015/0374842和2014/0107178中所讨论的。通常，阳离子脂质是在生理pH下具有净正电荷的脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质体为DODMA、DOTMA、DL-048或DL-103。在某些实施方案中，结构脂质或中性脂质为DSPC、DPPC或DOPC。在某些实施方案中，固醇为胆固醇。在某些实施方案中，聚乙二醇化脂质为DMPE-PEG、DSPE-PEG、DSG-PEG、DMPE-PEG2K、DSPE-PEG2K、DSG-PEG2K或DSG-mPEG。在一个实施方案中，阳离子脂质为DL-048，聚乙二醇化脂质为DSG-mPEG，并且一种或多种包膜脂质为DL-103、DSPC、胆固醇和DSPE-mPEG。参见例如，图8，其示出了可用于配制双链核酸抑制剂分子的LNP的一个非限制性实施方案。

在某些实施方案中，含三元环的双链核酸抑制剂分子与配体共价缀合，所述配体引导寡核苷酸至所关注的组织的递送。已经探究了许多此类配体。参见，例如，Winkler,Ther.Deliv.4(7):791-809(2013)。例如，可将双链核酸抑制剂分子与一个或多个糖配体部分(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))缀合，以引导寡核苷酸进入肝脏中的摄取。参见，例如，美国专利号5,994,517、美国专利号5,574,142、WO2016/100401。在某些实施方案中，一个或多个配体与双链核酸抑制剂分子的三元环中的一个或多个核苷酸缀合。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子与三元环中的两个或三个糖配体部分缀合。在一个实施方案中，三元环中的两个核苷酸与糖配体部分缀合。在另一个实施方案中，三元环中的三个核苷酸与糖配体部分缀合。在某些实施方案中，糖配体部分为GalNAc。在一个实施方案中，糖配体部分缀合为GalNAc并且与三元环中的两个核苷酸缀合。在一个实施方案中，GalNAc与GAA三元环的AA核苷酸缀合。可使用的其他配体包括但不限于甘露糖-6-磷酸、胆固醇、叶酸、转铁蛋白和半乳糖(对于其他特定的示例性配体参见例如WO2012/089352)。

配体可与核苷酸的任何部分缀合，只要它能够引导寡核苷酸向所关注的组织的递送即可。在某些实施方案中，配体(例如，GalNAc)在糖部分的2'-位处与核苷酸缀合。

施用/治疗的方法

一个实施方案涉及治疗病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。

在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可用于治疗或预防与增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病相关的症状。一个实施方案涉及治疗增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。

在某些实施方案中，所述病症为罕见疾病、慢性肝病、慢性肾病、心血管疾病或病毒感染性疾病。在某些实施方案中，所述病症为高草酸尿症，包括原发性高草酸尿症(PH1、PH2或PH3)或特发性高草酸尿症。在某些实施方案中，所述病症为慢性肾病症(CKD)。在某些实施方案中，所述病症为丙酮酸脱氢酶缺乏症。在某些实施方案中，所述病症为α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症。

在某些实施方案中，所述病症为癌症。此类癌症的非限制性实例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病结直肠癌、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食道鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、威尔姆氏肿瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)、肝癌(liver cancer)、肝癌瘤(liver carcinoma)、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘生物、腺泡细胞癌。前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤黑素瘤、小肠癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌瘤(gastric carcinoma)、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。通常，本公开的特征在于通过施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物来治疗肝癌、肝癌瘤、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌和肝母细胞瘤的方法。

在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者中靶基因表达的方法，所述方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用药物组合物，其中所述药物组合物包含如本文所述的含三元环的双链核酸抑制剂分子和也如本文所述的药学上可接受的赋形剂。

靶基因可以是来自任何哺乳动物的靶基因，诸如人靶基因。根据本发明的方法可使任何靶基因沉默。在某些实施方案中，靶基因与慢性肝病或慢性肾病相关，包括例如AGXT、GRHPR、HOGA1、HAO1、SERPINA1或LDHA。在某些实施方案中，靶基因与病毒感染性疾病相关，包括例如HBV基因或HCV基因。在某些实施方案中，靶基因与心血管疾病相关，包括例如APOC3或PCSK9。在某些实施方案中，靶基因与酒精代谢和肝功能相关，包括例如ALDH2。

其他示例性靶基因包括但不限于KRAS、因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA1、TTR、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因突变、p53肿瘤抑制基因以及它们的组合。

给药和时间表

通常，双链核酸抑制剂分子是肠胃外施用的(诸如经由静脉内、肌内或皮下施用)。在其他实施方案中，药物组合物经由局部施用或全身施用来递送。然而，本文公开的药物组合物也可通过本领域已知的任何方法施用，包括例如含服、舌下、直肠、阴道、尿道内、局部、眼内、鼻内和/或耳内，所述施用可包括片剂、胶囊、颗粒、水性悬浮液、凝胶、喷剂、栓剂、药膏、软膏等。

在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重20微克至10毫克、每千克100微克至5毫克、每千克0.1毫克至5.0毫克、每千克0.25毫克至5.0毫克或每千克0.2毫克至3.0毫克的剂量施用。通常，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重约0.25毫克至2.0毫克的剂量施用，诸如每天每千克接受者体重0.3毫克、每天每千克接受者体重0.5毫克，或每天每千克接受者体重1毫克。

本公开的药物组合物可每天或间歇地施用。例如，双链核酸抑制剂分子的间歇施用可以是每周1-6天、每月1-6天、每周一次、隔周一次、每月一次、隔月一次、每三月一次或每年一次或两次施用，或分为多个年、月、周或日剂量。在一些实施方案中，间歇给药可意指在初始双链核酸抑制剂分子施用后有休息期的循环中施用，在休息期中不施用长达至多一周、至多一个月、至多两个月、至多三个月或至多六个月或更长时间)，或者间歇给药可意指在隔数天、数周、数月或数年施用。

双链核酸抑制剂分子的治疗有效量可取决于施用途径和患者的身体特征，诸如受试者的大小和体重、疾病进展或侵入的程度、受试者的年龄、健康状况和性别，并且可根据这些因素和其他因素进行必要的调整。

实施例

实施例1：含有三元环和四元环的双链核酸抑制剂分子的体内剂量反应

在剂量-反应研究中评估了除不同茎长外还含有四元环和三元环的双链核酸抑制剂分子。将CD-1雌性小鼠分成多个研究组并给予分配给所述组的测试核酸抑制剂分子。对四只CD-1雌性小鼠分别给予0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg、1.6mg/kg和3.2mg/kg的五种测试核酸抑制剂分子中的每一种。另外，对四只对照CD-1小鼠给予安慰剂(PBS)，因此总样本量为124只小鼠。给药是皮下和单次给药，并且在给药后4天处死小鼠。进行了药效动力学研究，并采集了肝脏样品用于RT-qPCR。在Lysis Reagent中使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)使组织样品匀化。然后根据制造商说明(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)使用MagMAX Technology纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)制备cDNA。靶序列的引物用于在CFX384 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上的PCR。

实施例1中使用的五种测试核酸抑制剂分子(构建体1-5)示于图2A-2E中。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸和双环核苷酸之外，所述测试核酸抑制剂分子中的每个其他核苷酸在糖部分的2'-位处用2'-OMe或2'-F修饰。所述测试核酸抑制剂分子在以下方面有所不同：环部分的长度(四元环对三元环)、茎部分的长度(6个碱基对对3个碱基对)、双环核苷酸的存在或不存在以及环中GalNAc的数量(2对3)。图2A-2E中的核酸抑制剂分子总结于下表中：

表1：图1中的测试核酸抑制剂

长茎(6个碱基对)四元环构建体1和2是相同的，唯一的区别是环中GalNAc的数量(3对2)。长茎构建体2与长茎构建体3相同，不同的是构建体2具有四元环，而构建体3具有三元环。长茎构建体3与短茎(3个碱基对)构建体4相同，不同的是构建体3具有6个碱基对的茎双链体且没有双环核苷酸，而构建体4具有3个碱基对的茎双链体，其中茎双链体中的所有核苷酸都是双环核苷酸。短茎构建体4和5是相同的，唯一的区别是在构建体4的茎中存在6个BNA^NC[NMe]，而构建体5的茎中存在6个LNA双环核苷酸。在构建体4中使用的双环核苷酸是BNA^NC[NMe]，其中连接双环核苷酸的2'-碳和4'-碳的桥是4'-CH₂-N(CH₃)-O-2'。在构建体5中使用的双环核苷酸为LNA，其中连接双环核苷酸的2'-碳和4'-碳的桥为4'-(CH₂)-O-2'。

使用非线性回归分析(GraphPad Prism软件)，相对于log[mg/kg]，基于相对于PBS的50％靶基因剩余百分比计算有效剂量(ED₅₀)曲线。将四元环长茎(6个碱基对)核酸分子与三元环长茎核酸分子进行比较。另外，将含有BNA^NC[NMe]的三元环短茎(3个碱基对)核酸抑制剂分子与对应的含有LNA的三元环短茎核酸分子进行比较。还将它们与没有双环核苷酸的三元环和四元环较长茎(茎中6个碱基对)的核酸分子进行了比较。如图3和图4所示，与含有2或3个GalNAc的对应的四元环核酸分子(构建体1和2)相比，三元环较长茎的核酸抑制剂分子(构建体3)和在短茎中含有双环核苷酸的三元环较短茎的核酸分子(构建体4和5)都显示出相似的靶基因敲减效力。

实施例2：含有四元环和三元环的双链核酸抑制剂分子对于靶基因敲减的体内效力

将CD-1雌性小鼠分成多个研究组并给予分配给所述组的测试核酸抑制剂分子。实施例2中使用的测试核酸抑制剂分子(构建体6-13)示于图6A-6H中。还使用了构建体1(参见图2A)。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸和双环核苷酸之外，所述测试核酸抑制剂分子中的每个其他核苷酸在糖部分的2'-位处用2′-OMe或2′-F修饰。所述测试核酸抑制剂分子在以下方面有所不同：环部分的长度(四元环对三元环)、茎部分的长度(6个碱基对、3个碱基对、2个碱基对和1个碱基对)以及双环核苷酸的存在或不存在。图6A-6H中的核酸抑制剂分子总结于下表中：

表2：图6中的测试核酸抑制剂

长茎(6个碱基对)构建体6和7是相同的，唯一的区别是环中核苷酸的数量(四元环对三元环)。构建体1与构建体6相同，不同的是构建体1含有3个与四元环缀合的GalNAc，而构建体6含有2个与四元环缀合的GalNAc。构建体8(3个碱基对的茎)与构建体9(3个碱基对的茎)相同，不同的是构建体8具有四元环，而构建体9具有三元环。构建体10和11(2个碱基对的茎)是相同的，唯一的区别是构建体10具有四元环，而构建体11具有三元环。构建体12和13(1个碱基对的茎)是相同的，唯一的区别是构建体12具有四元环，而构建体13具有三元环。在构建体8-13中使用的双环核苷酸为BNA^NC[NMe]。

以单次0.5mg/kg剂量向动物皮下给予所分配的测试核酸抑制剂分子，并在给药后4天处死小鼠。通过进行两次4mm穿刺活检来收集肝组织，将其储存在Invitrogen^TMRNAlater^TM溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中用于随后的mRNA分析。在Lysis Reagent中使用TissueLyser II(Qiagen,Valencia,CA)使组织样品匀化。然后根据制造商说明(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)使用MagMAX Technology纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)制备cDNA。靶序列的引物用于在CFX384 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上的PCR。

将三元环测试核酸抑制剂分子(构建体7、9、11和13)与测试核酸分子的对应四元环型式(分别为构建体1、6、8、10和12)进行比较。如图7所示，与6个碱基对、3个碱基对和2个碱基对构建体的对应的四元环测试核酸分子相比，含有三元环的测试核酸抑制剂分子显示出相似的靶基因mRNA的敲减。包含与2个GalNAc缀合的三元环并在茎中具有2个碱基对的构建体11，具有比包含与3个GalNAc缀合的三元环和在茎中具有6个碱基对的构建体1更高的效力。包含在茎中具有1个碱基对的三元环的构建体13，没有表现出靶基因mRNA的敲减，而包含四元环和茎中1个碱基对的构建体12显示出靶基因mRNA的明显敲减。