一种口腔菌群多态性调节剂
阅读说明：本技术 一种口腔菌群多态性调节剂 (Oral flora polymorphism regulator ) 是由 王亚静 高秀梅 赵鑫 刘二伟 商利娜 王雁雯 高迪 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种口腔菌群多态性调节剂,具体涉及一种维护口腔生态多样性、调节菌群结构的组合物及其用途,属于药物制剂、口腔保健制品技术领域。一种口腔菌群多态性调节剂,其活性成分由黄芩提取物和杜仲叶提取物组成,黄芩提取物和杜仲叶提取物折合生药的质量比为1:16～16:1。本发明活性分为为天然植物提取物,药味数量少,安全无毒最佳工艺简单易行,产品具有优异的维护口腔生态多样性、调节菌群结构、调节口腔菌群平衡、防治口臭、牙周炎及口腔溃疡的效果。(The invention relates to an oral flora polymorphism regulator, in particular to a composition for maintaining oral ecological diversity and regulating flora structure and application thereof, belonging to the technical field of pharmaceutical preparations and oral health products. An oral flora polymorphism regulator comprises active ingredients of a scutellaria baicalensis extract and an eucommia ulmoides leaf extract, wherein the mass ratio of the scutellaria baicalensis extract to the eucommia ulmoides leaf extract to a crude drug is 1: 16-16: 1. The invention has the advantages of small quantity of medicinal ingredients, safety, no toxicity, simple and feasible optimal process, and excellent effects of maintaining the ecological diversity of the oral cavity, adjusting the flora structure, adjusting the oral flora balance and preventing and treating halitosis, periodontitis and oral ulcer.)
技术领域
本发明涉及一种口腔菌群多态性调节剂，具体涉及一种维护口腔生态多样性、调节菌群结构的组合物及其用途，属于药物制剂、口腔保健制品及日化用品技术领域。
背景技术
口腔是外界连接呼吸道、消化道的通道，为微生物的定植提供了适宜的温度、湿度和营养源，口腔内微生物的多样性有利于维持口腔生理功能，并抵御外界不良因素对机体的侵袭。一旦微生物群落失调，则可导致龋病、牙周(龈)炎以及口腔溃疡等口腔疾病。研究表明：人体口腔微生物由700多种细菌组成，在正常情况下，这些口腔内的正常菌丛或固有菌丛不会引起疾病，实际上口腔中的大部分细菌是有益菌，对维持口腔的生理功能发挥重要作用。通常当机体与正常菌丛间维持相互平衡状态时，这些微生物显示对机体有益的作用；而当机体受到自身或外界因素的影响破坏了这种平衡状态，如抑菌物质的长期使用等，原有对条件致病菌具有抑制作用的益生菌降低，而一些原本以低数量存在的常居条件致病菌在口腔环境改变时相对增加，甚至变为优势菌，就有机会显示其有害的作用，并导致口腔溃疡、龋齿、牙周(龈)炎、口腔异味等口腔疾病和口腔问题的发生。因此口腔微生物的多样性以及菌群的相对平衡对维持口腔健康至关重要。
随着人们的口腔卫生意识越来越强，使用漱口水等进行口腔护理是目前最方便易行的方法，不但能清洁口腔的食物残渣和残留污垢，还能使口腔内的细菌减少清新口气，得到越来越多人的青睐。而如果漱口成分抑菌没有选择性，在抑制致病菌的同时也同时杀灭口腔内的有益菌，影响口腔微生物的多样性及菌群的相对平衡，对口腔健康将带来不利影响，甚至成为口腔问题的诱因或导致问题加重。
研究表明目前市售的口腔含漱液大多注重对致病菌的杀灭作用，而忽略对口腔中益生菌的影响，长期反复应用可能会导致口腔菌群的紊乱。另外，现在市场以及临床上大量使用的西药漱口剂、喷雾剂等，抑菌杀菌作用强、副作用大、易产生耐药性，且口感不佳。而外源性的补充益生菌也存在一定的风险，其潜在的安全问题也不容忽视，有报道指出滥用益生菌补充剂还可能会引起感染、水平转移耐药性、胃肠道缺血、代谢紊乱、过敏反应、免疫功能异常等不良后果。因此，调动口腔内源性的菌群调节能力仍是目前最为安全的干预方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种口腔菌群多态性调节剂。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种口腔菌群多态性调节剂，其活性成分由黄芩提取物和杜仲叶提取物组成，黄芩提取物和杜仲叶提取物折合生药的质量比为1:16～16:1。
天然植物是活性物质成分的宝库，其成分多样，作用亦各不相同。本发明对野菊花等植物以及杜仲叶等植物进行口腔相关菌作用考察。本发明考察大红袍茶、野菊花、厚朴、黄芩、杜仲叶、丁香、蒲公英等7种天然植物提取物对口腔致病菌的抑菌活性影响，结果显示，黄芩对口腔致病菌白色念珠菌的抑制作用最强；采用微量肉汤稀释法考察黄芪、白术、枸杞、杜仲叶、甘草5种等天然植物对口腔益生菌唾液链球菌的影响，结果表明，与其他几种植物相比，杜仲叶表现出明显的促菌趋势。因此确定黄芩与杜仲叶作为有助于调节口腔菌群平衡的天然植物进行后续研究。本发明使用的原料提取自天然植物，不含任何化学添加剂，对人体安全无毒。
优选的，所述黄芩提取物和杜仲叶提取物折合生药的质量比为1:2～2:1。
所述黄芩提取物的提取方法选自回流水提、回流醇提、温浸水提或温浸醇提中的一种或几种；所述杜仲叶提取物的提取方法选自回流水提、回流乙醇提、温浸水提或温浸乙醇提中的一种或几种。
所述黄芩提取物的提取方法为以下任一方法：
(1)回流水提：取黄芩粗粉，加入10-20倍量水，回流提取1-3次，提取时间为1-3h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(2)回流醇提：取黄芩粗粉，加入10-20倍量浓度为30-70％(V/V)的乙醇，回流提取1-3h，静置过夜除杂后，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(3)温浸水提：取黄芩粗粉，加入10-20倍量纯化水，50-70℃温浸提取1-3h，静置过夜除杂后，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(4)温浸醇提：取黄芩粗粉，加入10-20倍量浓度为30-70％(V/V)的乙醇，50-70℃温浸提取1-3h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
所述杜仲叶提取物的方法为以下任一方法：
(1)回流水提：取杜仲叶，加入15-25倍量纯化水，回流提取1-3次，每次回流提取1-3h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(2)回流醇提：取杜仲叶，加入15-25倍量浓度为30-50％(V/V)的乙醇，回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(3)温浸水提：15-25倍量水，60℃温浸水提1次，回流提取1-3次，每次提取时间1-3h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(4)温浸醇提：取杜仲叶，加入15-25倍量浓度为30-50％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取1-3h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物。
优选的，所述黄芩提取物的提取方法为以下任一方法：
(1)回流水提：取黄芩粗粉，加入15倍量水，回流提取1次，提取时间为2h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(2)回流醇提：取黄芩粗粉，加入15倍量浓度为50％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(3)温浸水提：取黄芩粗粉，加入15倍量纯化水，60℃温浸提取2h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
(4)温浸醇提：取黄芩粗粉，加入15倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤，滤液浓缩，得到黄芩提取物；
优选的，所述杜仲叶提取物的方法为以下任一方法：
(1)回流水提：取杜仲叶，加入20倍量纯化水，回流提取2h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(2)回流醇提：取杜仲叶，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(3)温浸水提：取杜仲叶，20倍量水，60℃温浸水提1次，提取时间2h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物；
(4)温浸醇提：取杜仲叶，加入20倍量浓度为30％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤，滤液浓缩，得到杜仲叶提取物。
最优选的，所述黄芩的提取方法为回流水提，提取工艺为15倍量水，回流提取1次，提取时间为2h，过滤至澄清，滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏，得到黄芩提取物；最优选的，所述杜仲叶的提取方法为温浸水提，提取工艺为20倍量水，60℃温浸水提1次，提取时间2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏，得到杜仲叶提取物。
本发明通过回流水提、回流醇提、温浸水提、温浸醇提得到4种不同提取方式的黄芩提取液，建立其HPLC指纹图谱。以白色念珠菌为指示菌，采用微量肉汤稀释法进行提取液体外抑菌实验，测定抑菌率。并采用灰色关联分析法对指纹图谱及黄芩抑菌药效信息相关联，并对其抑菌成分的贡献程度进行排序，确定黄芩抑制白色念珠菌的物质基础。根据黄芩“谱-效”关系中贡献程度强弱的结果，采用AHP-Critic混合加权法对黄芩提取液进行赋权，并结合正交试验，确定黄芩的最佳提取工艺。以食窦魏斯氏菌为实验益生菌，通过考察温浸水提、温浸醇提、回流水提、回流醇提4种不同提取方式的杜仲叶对食窦魏斯氏菌的益生作用，并以杜仲叶促菌生长率为指标确定杜仲叶的最佳提取工艺。
实验结果显示，4种不同提取液对白色念珠菌的抑制率为2.43％～98.10％，其中，回流水提的黄芩抑菌率为98.10％，抑菌效果最好，而其他三种提取方式的黄芩抑菌率均低于40％。HPLC指纹图谱中有26个抑菌质量标志峰，其中有17个对黄芩抑菌起到促进作用，以黄芩素活性最强，关联度为0.7689，故黄芩素是黄芩发挥抑菌作用的主要活性成分。通过AHP-Critic混合加权法结合黄芩抑菌成分的贡献程度计算得到的权重系数对正交实验结果进行综合评分，得黄芩提取最佳工艺：15倍量水，回流提取1次，每次2h。而杜仲叶以温浸水提的方式促益生菌效果最佳，确定工艺为20倍量水，60℃温浸水提2h，提取次数为1次。
所述活性成分折合生药的质量为口腔菌群多态性调节剂整体的0.5～15％(其中，液体制剂的浓度单位为W/V，固体、半固体制剂的浓度单位为W/W)，优选所述活性成分折合生药的质量为口腔菌群多态性调节剂整体的1.0～6％(其中，液体制剂的浓度单位为W/V，固体、半固体制剂的浓度单位W/W)。
采用微量肉汤稀释法考察最佳提取工艺的黄芩与杜仲叶提取液对口腔相关菌生长的影响，进一步确定发挥调节口腔菌群平衡最佳效果的提取物的配比。实验结果显示，当黄芩提取物与杜仲叶提取物折合生药的质量比为1:2～2:1、并且二者生药质量之和占口腔菌群多态性调节剂整体的1～6％(其中，液体制剂为W/V，固体、半固体制剂为W/W)范围内时，黄芩提取物、杜仲叶提取物天然活性物质组合物对白色念珠菌(口腔溃疡相关致病菌)、具核梭杆菌(口臭、牙周(龈)炎相关致病菌)、牙龈卟啉单胞菌(牙周(龈)炎相关致病菌)抑制作用最强，同时对食窦魏斯氏菌(口腔溃疡、口臭、牙周(龈)炎相关益生菌)、唾液链球菌(口腔溃疡、口臭相关益生菌)具有促进作用。
本发明所述的黄芩提取物、杜仲叶提取物可为提取液、浸膏、干膏或粉末；所述口腔菌群多态性调节剂的剂型为液体制剂、半固体制剂或固体制剂，其中液体制剂为漱口液、含漱液、喷雾剂；半固体制剂为膏霜、乳液、软膏、凝胶、软胶囊；固体制剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、膜剂。
一种口腔菌群多态性调节剂的用途，包括但不限于维护口腔生态多样性、调节菌群结构、调节口腔菌群平衡、防治口臭、牙周(龈)炎及口腔溃疡。
本发明可将黄芩与杜仲叶天然活性物质组合物作为主要活性成分，按照一定的比例，加入水及其他辅料制成口含制剂或局部给药制剂，例如漱口液、漱口片、牙膏等口腔护理产品。
为便于将本发明组合物与市售口腔护理产品相比较，故制备成简易方便的液体漱口液，并命名为本发明调理液，具体制法如下：黄、杜天然活性物质组合物为主要活性成分，加入处方量的防腐剂、香精、表面活性剂、甜味剂、抗氧化剂等，调pH值并加纯化水定容，即得。为了考察其他辅料是否对口腔菌可能产生影响，另做一组不加黄杜天然活性物质组合物，其余辅料完全相同的漱口液，记为空白辅料。
通过体外实验发现，本发明调理液对口腔溃疡主要致病菌白色念珠菌有显著抑制作用，对口腔溃疡相关益生菌食窦魏斯氏菌与唾液链球菌基本无影响；本发明调理液对口臭、牙周(龈)炎相关主要致病菌具核梭杆菌的抑制作用极强，而对口臭相关益生菌唾液链球菌与牙周(龈)炎相关食窦魏斯氏菌基本无影响；空白辅料对口腔溃疡、牙周(龈)炎及口臭相关致病菌抑制作用弱，对益生菌表现出明显的抑制作用，不具备调节口腔菌群平衡的潜力，即发挥调节口腔菌群平衡的主要功效物质为黄杜活性物质组合物；而其余市售漱口水对口腔致病菌与益生菌均具有显著的抑制作用，作用口腔后既会使致病菌数量降低也会使益生菌显著减少，不能达到调节口腔菌群的作用。因此，实验结果表明，主要功效物质黄芩与杜仲叶提取物活性物质组合物可实现在抑制致病菌的同时减少对益生菌的影响，从而提升益生菌占比，调节口腔菌群的平衡。
本发明从口腔菌群细胞结构角度出发，探究本发明调理液与空白辅料、市售漱口液对菌细胞壁、细胞膜及细胞内容物的影响机理，进一步揭示天然活性物质组合物对口腔相关菌影响的特点。以只加水的PBS菌悬液为空白对照组，以加入本发明调理液的PBS菌悬液为实验组，加入空白辅料的PBS菌悬液为阴性对照组，以加入市售漱口水西吡氯铵漱口水(批号：K1906282，杭州民生药业有限公司)与高露洁贝齿漱口水(批号：0035TH1113)的PBS菌悬液为阳性对照组，比较实验组与其他各组作用于菌体后各时间点其胞外上清液中碱性磷酸酶活力、钾离子及蛋白质含量变化的不同，实验结果发现，与空白对照组相比，实验组的口腔溃疡主要致病菌白色念珠菌、口臭及牙周(龈)炎相关致病菌牙龈卟啉单胞菌菌与具核梭杆菌体胞外上清液中碱性磷酸酶活力、钾离子及蛋白质含量均有显著升高(p<0.01)，表明本发明调理液主要通过作用于口腔溃疡、口臭及牙周(龈)炎致病菌的细胞壁、细胞膜及蛋白质从而发挥抑菌作用；本发明调理液作用于菌体后的各时间点，其上清液中碱性磷酸酶活力、钾离子及蛋白质含量均比阴性对照组显著升高(p<0.01)，表明本发明调理液中破坏口腔溃疡、口臭及牙周(龈)炎致病菌的细胞壁、细胞膜及蛋白质从而发挥抑菌作用的主要功效物质为黄杜天然活性物质组合物；与市售漱口水对比，本发明调理液破坏口腔溃疡、口臭及牙周(龈)炎致病菌的细胞壁、细胞膜及蛋白质的作用较强。
本发明利用16S rDNA V4区域扩增子和ITS测序技术比较使用本发明调理液前后，志愿者口腔中菌群在多样性及结构上的变化，进而分析使用本发明调理液对口腔健康及口腔致病菌与益生菌的影响，从而揭示黄杜天然活性物质组合物防治口腔问题的作用特点，为黄杜天然活性物质组合物的应用提供依据。口腔菌群α多样性分析结果显示，应用本发明调理液前后与未干预健康组相比，志愿者口腔微生物多样性指数无显著差异(P>0.05)，表明本发明调理液作用温和，对正常的口腔生理功能具有一定的保护作用；基于种水平物种相对丰度分析结果发现，应用本发明调理液后，牙周(龈)炎相关致病菌牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、福塞斯坦纳菌及产黑色素普氏菌的相对丰度值均不同程度的降低；口腔异味最主要致病菌莫雷氏菌的相对丰度值降低；除食窦魏斯氏菌相对丰度值轻微降低外，其余口腔益生菌的相对丰度值均升高；且对于口腔健康受试者，在使用本发明调理液后，其口腔中白色念珠菌的相对丰度值仍维持在正常范围内；而对于有口腔溃疡的受试者，其口腔中白色念珠菌的相对丰度值干预前处于较高水平，在使用本发明调理液后，白色念珠菌的相对丰度值呈现显著下降，表明本发明调理液对正常口腔几乎没有影响，而对致病菌异常口腔状态具有明显的改善作用，提示：本发明调理液可作为日常口腔护理产品维持口腔菌群平衡及防治口腔疾病。本发明调理液对牙周(龈)炎、口腔异味及口腔溃疡的主要致病菌均具有抑制作用，同时能上调与上述三种口腔疾病相关的益生菌的占比。受试者实验结果与前期体外作用结果基本一致，提示：本发明调理液通过调节口腔菌群平衡对牙周(龈)炎、口腔异味、口腔溃疡具有一定的防治作用。
本发明的优点如下：本发明活性成分为天然植物提取物，药味数量少，安全无毒最佳工艺简单易行，产品具有优异的维护口腔生态多样性、调节菌群结构、调节口腔菌群平衡、防治口臭、牙周(龈)炎及口腔溃疡的效果，用于制备漱口液、漱口片、牙膏等口腔护理产品口感清甜舒爽。
附图说明
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细的说明。
图1示出七种天然植物对C.albicans抑菌活性的比较结果
图2示出各内标物与回流水提黄芩药液的混合HPLC指纹图谱：1、蒙花苷；2、芦丁；3、丹皮酚；4、绿原酸；5、橙皮苷；6、阿魏酸
图3示出黄芩指纹图谱在202nm下的3D图谱
图4示出图黄芩指纹图谱在278nm下的3D图谱
图5示出黄芩混合对照品及供试品HPLC指纹图谱：将混合对照品过0.45μm滤膜后进样测定
图6示出黄芩混合对照品及供试品HPLC指纹图谱：将供试品与内标物的混合溶液过0.45μm滤膜后进样测定
图7示出对黄芩抑制C.albicans起促进(左)、削弱(右)作用的成分及其贡献程度
图8示出不同浓度的黄芩水提液对C.albicans的时间-抑制率曲线
图9示出不同浓度的杜仲叶水提液对唾液链球菌的时间-生长率曲线
图10示出不同浓度的杜仲叶水提液对食窦魏斯氏菌的时间-生长率曲线
图11示出7.81与15.63mg/mL浓度的黄芩水提液对唾液链球菌的时间-生长率曲线
图12示出7.81与15.63mg/mL浓度的黄芩水提液对食窦魏斯氏菌的时间-生长率曲线
图13示出各漱口水对白色念珠菌的生长动力学曲线
图14示出各漱口水对具核梭杆菌的生长动力学曲线
图15示出各漱口水对食窦魏斯氏菌的生长动力学曲线
图16示出各漱口水对唾液链球菌的生长动力学曲线
图17示出各漱口水作用于致病菌白色念珠菌后菌悬液胞外上清液中的碱性磷酸酶活力变化测定结果。
图18示出各漱口水作用于致病菌具核梭杆菌后菌悬液胞外上清液中的碱性磷酸酶活力变化测定结果。
图19示出各漱口水作用于致病菌牙龈卟啉单胞菌悬液胞外上清液中的碱性磷酸酶活力变化测定结果。
图20示出各漱口水作用于致病菌白色念珠菌后菌悬液胞外上清液中的钾离子含量变化测定结果。
图21示出各漱口水作用于致病菌具核梭杆菌后菌悬液胞外上清液中的钾离子含量变化测定结果。
图22示出各漱口水作用于致病菌牙龈卟啉单胞菌后菌悬液胞外上清液中的钾离子含量变化测定结果。
图23示出各漱口水作用于致病菌白色念珠菌后菌悬液胞外上清液中的蛋白质含量变化测定结果。
图24示出各漱口水作用于致病菌具核梭杆菌后菌悬液胞外上清液中的蛋白质含量变化测定结果。
图25示出各漱口水作用于致病菌牙龈卟啉单胞菌后菌悬液胞外上清液中的蛋白质含量变化测定结果。
图26示出本发明调理液使用前后口腔益生菌相对丰度图(n＝13)
图27示出本发明调理液使用前后口腔致病菌相对丰度图，左起1-6为细菌(n＝13)，右1为真菌白色念珠菌(n＝5)，注：Q：使用调理液前，H：使用调理液后
具体实施方式
实施例1：天然植物提取物的筛选
1.仪器与材料
1.1仪器
HCB-900V垂直层流洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；SW-CJ-JF超净台(苏州净化厂)；HPX-9052MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BSD-TX345台式摇床机(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；infinite M200 PRO酶标仪(美国TECAN公司)；EYELA N-1210B旋转蒸发仪(上海艾朗仪器有限公司)；EYELA-1000S循环水式真空泵(东京理化器械株式会所)；FA124电子天平(天津亿诺科学仪器有限公司)；LS-B 50L立式压力蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)。
1.2材料
唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius，ATCC13419)购于广东省微生物菌种保藏中心；白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans，ATCC1231)购自北纳创联生物技术有限公司；BHI肉汤(LA0360)、营养琼脂粉(A8190)、改良马丁琼脂培养基(1108S304)购自北京索莱宝生物科技有限公司；改良马丁培养基(M4101B)购自山东拓普生物工程有限公司；杜仲叶由江西普正制药有限公司提供；野菊花、蒲公英、黄芩饮片均由河北安国市誉林药业有限公司提供；黄芪、白术、枸杞、甘草、大红袍、厚朴、丁香均购自天津市同仁堂药店。
2实验方法
2.1天然植物提取物的筛选
不同天然植物提取液的制备
称取各天然植物10g，加入二十倍量纯化水，回流提取2次，每次1h，提取液趁热抽滤，放置过夜，离心，弃沉淀，60℃旋蒸浓缩至10mL，制成生药浓度为1g/mL的天然植物提取液，待冷却后置于4℃冰箱中备用。
2.1.1七种天然植物提取物对口腔致病菌C.albicans抑菌活性的筛选---黄芩
采用改良牛津杯法测定天然植物对口腔致病菌的抑菌活性。在无菌条件下，取15mL熔融的改良马丁琼脂固体培养基铺板(第一层)，待凝固后垂直放入9个牛津杯，固定好后再向培养皿中加入10mL熔融的含50μL稀释后的C.albicans菌液的改良马丁琼脂固体培养基(第二层)，待第二层凝固后去除牛津杯，于孔内分别加入野菊花、蒲公英、大红袍、黄芩、杜仲叶、厚朴及丁香的提取液各50μL；阴性对照为无菌水50μL，阳性对照为百倍稀释的硝酸益康唑喷雾20μL，将培养皿置于30℃恒温培养箱内培养36h，结果采用“十字交叉法”测定抑菌圈直径，试验平行测定3次取平均值比较抑菌活性。
评价指标：抑菌圈直径≥20mm，极度敏感；15mm≤抑菌圈直径＜20mm，高度敏感；10mm≤抑菌圈直径＜15mm，中度敏感；无抑菌圈或抑菌圈直径＜10mm，低敏或耐药。
2.1.2补益类植物对口腔益生菌S.salivarius促菌活性的筛选---杜仲叶
采用微量肉汤稀释法考察补益类植物对益生菌唾液链球菌的促菌能力，筛选出促菌作用最强的植物。将5种补益类植物提取液依次进行2倍稀释。于96孔板内设置实验组、阴性对照组、control组和空白对照组，其中实验组为稀释后的S.salivarius菌液100μL和不同浓度的补益类植物提取液100μL；阴性对照组为100μLBHI液体培养基和不同浓度的补益类植物提取液100μL；control组为稀释后的S.salivarius菌液100μL和100μLBHI液体培养基；空白对照组为200μLBHI液体培养基。将96孔板置于酶标仪中设置参数测定每孔吸光度，记录数据，试验平行测定3次。
3.实验结果
3.1七种天然植物提取物对口腔溃疡致病菌C.albicans抑菌活性的筛选---结果黄芩
考察七种天然植物对C.albicans的抑菌活性，抑菌圈直径结果见表1和图1。结果显示，在相同的提取方式、相同的实验条件下，七种天然植物中黄芩对C.albicans的抑制作用最强，抑菌圈直径可达18.76±0.09mm，属于高敏天然植物；而大红袍、丁香、厚朴及杜仲叶属于中敏天然植物，蒲公英与野菊花为低敏天然植物；七种天然植物对C.albicans的抑菌圈直径大小排序为：黄芩＞大红袍＞丁香＞厚朴＞杜仲叶＞蒲公英＞野菊花。
表1七种天然植物对C.albicans的抑菌圈及药物敏感程度结果
注：各组与阴性对照比较*P＜0.05，**P＜0.01。
3.2补益类植物对口腔益生菌S.salivarius促菌活性的筛选---结果杜仲叶
考察七种补益类植物对益生菌S.salivarius的促菌活性，结果见表2。结果显示，与其余4种补益类天然植物比较，杜仲叶表现出明显的促益生菌生长趋势，生长率可达104.90％，此时杜仲叶的药物浓度为7.81mg(生药量)/mL；因此，确定黄芩与杜仲叶作为有助于调节口腔菌群平衡的天然植物进行后续研究。
表2七种天然植物对S.salivarius促菌活性的影响
实施例2.提取物提取工艺及配比研究
1.仪器与材料
1.1仪器
HCB-900V垂直层流洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；SW-CJ-JF超净台(苏州净化厂)；HPX-9052MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BSD-TX345台式摇床机(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；infinite M200 PRO酶标仪(美国TECAN公司)；FA124电子天平(天津亿诺科学仪器有限公司)；LS-B 50L立式压力蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)。Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent 20RBAX Eclipse Plus色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，YP1001电子天平(上海箐海仪器有限公司)，AX205十万分之一电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，Mili-Q超纯水处理器(美国Milipore公司)，EYELA N-1100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会所)；EYELA A-1000S循环水式真空泵(东京理化器械株式会所)；HH.S21-6电热恒温水浴锅(济南捷岛分析仪器有限公司)。
1.2材料
唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius，ATCC13419)购于广东省微生物菌种保藏中心；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis，ATCC33277)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum，ATCC10953)、白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans，ATCC1231)购自北纳创联生物技术有限公司；食窦魏斯氏菌(Weissella.Cibaria，W.cibaria，CPCC101289)购自中国药学微生物菌种保藏管理中心；哥伦比亚血平板(批号：352241)购自北纳创联生物技术有限公司；BHI肉汤(LA0360)、MRS肉汤(M8540)、营养琼脂粉(A8190)、改良马丁琼脂培养基(1108S304)、氯化血红素溶液(H8132)、维生素K3(V8170)均由北京索莱宝生物科技有限公司提供；改良马丁培养基(M4101B)由山东拓普生物工程有限公司提供；厌氧产气袋、厌氧培养袋(日本三棱瓦斯化学株式会社)；Yeast Extract酵母粉LP0021(OXOID)；杜仲叶由江西普正制药有限公司提供；黄芩片(批号：190102，产地：山西)由河北安国市誉林药业有限公司提供；黄芩苷对照品(P20A9F59353)，黄芩素对照品(C20MBY31962)，汉黄芩素对照品(W30M10284622)，橙皮苷对照品(P06D9F77001)均由上海源叶生物科技有限公司提供；汉黄芩苷对照品(823B022)由北京索莱宝科技有限公司提供；甲醇(色谱级)由天津市康科德科技技术有限公司提供；乙腈(色谱级)由美国费希尔Fisher公司提供；去离子水(MIILLIPORE超纯水系统)。
2.实验方法
一、天然植物提取物最优提取工艺的确定
2.1中药黄芩提取工艺的研究
前期预实验发现回流水提、回流60％乙醇提、温浸水提、温浸60％乙醇提这4种方式制备的黄芩药液对C.albicans的抑菌圈具有显著差异，因此，本实验特意设置4种不同提取方式，使其化学成分及药效(抑菌率)具有显著差异，从“抑菌差异”的角度出发，探寻黄芩抑制C.albicans的物质基础。
2.1.1不同提取方式提取物的制备
精密称取4份黄芩粗粉，每份10g，分别加入对应溶剂200mL(水或60％乙醇)，以回流水提、回流60％乙醇提、温浸水提、温浸60％乙醇提的方式提取2h，提取液放凉后用对应溶剂补足失重，离心弃去药渣，0.45μm滤膜过滤后，4℃备用，所制备的溶液记为供试品溶液。
2.1.2指纹图谱分析方法的建立
2.1.2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)；梯度洗脱(0～25min，85％～75％B；25～40min，75％～70％B；40～45min，70％～60％B；45～60min，60％～57％B；60～65min，57％～30％B；65～70min，30％～85％B；70～75min，85％B)；检测波长：202nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。
2.1.2.2内标物及波长的选择
内标物的选择：精密吸取黄芩水提液6份，每份1mL，分别向其中加入1mL的蒙花苷、芦丁、丹皮酚、绿原酸、橙皮苷和阿魏酸对照品溶液，混合均匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤后，按本实施例中“2.1.2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，以出峰时间及分离度为指标，筛选出最适的内标物。
波长的选择：吸取黄芩水提液适量，经0.45μm的微孔滤膜过滤后，按本实施例“2.1.2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，设置全波长扫描(190-400nm，步长2nm)，根据指纹图谱所有峰的响应确定黄芩指纹图谱的波长。
2.1.2.3溶液的制备
橙皮苷内标物溶液：精密称取橙皮苷1.47mg，加入甲醇定容至25mL，配制成质量浓度为58.8μg/mL的内标物溶液，4℃备用。
混合对照品溶液：精密称取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素各适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为0.516，1.000，0.506，0.515mg/mL的对照品原液。分别吸取各对照品溶液1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声混匀，0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为混合对照品溶液。
供试品与内标物的混合溶液：用前取上述“2.1.1”项下的供试品溶液1mL置于5mL容量瓶中，对应溶剂定容至5mL，取1mL稀释后的供试品溶液与1mL内标物溶液混合，过0.45μm微孔滤膜后，按本实施例中“2.1.2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪进行指纹图谱的测定。
2.1.2.4重复性
取同一供试品与内标物的混合溶液，按本实施例中“2.1.2.1”项下的色谱条件连续进样6次，测定各色谱峰的出峰时间、各色谱峰峰面积与内标物峰面积的比值(相对峰面积比值)，并计算相对标准偏差RSD(％)，考察方法的重复性。
2.1.2.5精密度
取同一批次供试品与内标物的混合溶液各6份，按本实施例中“2.1.2.1”项下的色谱条件进样，测定各色谱峰的出峰时间、各色谱峰峰面积与内标物峰面积的比值(相对峰面积比值)，并计算相对标准偏差RSD(％)，考察仪器的精密度。
2.1.2.6稳定性
取同一供试品与内标物的混合溶液，按本实施例中“2.1.2.1”项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16和24h进样，测定各色谱峰的出峰时间、各色谱峰峰面积与内标物峰面积的比值(相对峰面积比值)，并计算相对标准偏差RSD(％)，考察方法的重复性。
2.1.3对C.albicans抑菌活性的研究
采用微量肉汤稀释法测定黄芩提取液对C.albicans的体外抑菌实验。取无菌96孔板，在A1-A11中分别依次加入100μL浓度为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98mg(生药量)/mL的黄芩提取液，再分别在A1-A11孔内加入100μL稀释至104倍的C.albicans菌液，使每孔终浓度为500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98，0.49mg(生药量)/mL，作为实验组；B1-B11孔依次加入100μL浓度为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98mg(生药量)/mL的黄芩提取液，再分别加入100μL改良马丁液体培养基作为阴性对照组；A12孔加入100μL灭菌水和100μL稀释至104倍的菌液，作为control组；B12加入100μL灭菌水和100μL改良马丁液体培养基，作为空白对照。将96孔板置于600nm的酶标仪中测定吸光度(OD)，实验平行测定3次。
抑菌率计算公式如下：
2.1.4灰色关联度分析的建立
2.1.4.1确定参考序列与比较序列
本实施例研究不同提取工艺下的黄芩提取液各成分(即各组分峰面积)对白色念珠菌抑菌率的影响程度。因此以抑菌率作为参考序列(母序列)，记作X0(k)；k＝1、2、3、4；以27种成分的峰值作为比较序列(子序列)，分别作为Xi(k)；i＝1、2、3···27；k＝1、2、3、4。
2.1.4.2无量纲化处理
为了确保实验结果的准确性，便于各指标的比较，在计算灰色关联度之前，需要对数据进行无量纲化处理，本实验研究采用均值化法处理，即用各序列元素分别除以相应序列的平均值，计算公式为：Xi’(k)＝Xi(k)/Xi，i＝0、1、2、3···27；k＝1、2、3、4。其中表示序列i的样本数据的平均值，Xi(k)代表原数据，Xi’(k)代表无纲量化处理后的数据。从而得到均值化的序列{Xi’(k)}。
2.1.4.3建立求差数列
即计算参比序列与比较序列的绝对差值。
求差数列计算公式为：
ΔXi(k)＝|Xi'(k)-X0'(k)| (3)
2.1.4.4确定关联系数
灰色关联系数的计算公式为：
式中|X0(k)－Xi(k)|表示序列X0与序列Xi在k点差值的绝对值；表示差值绝对值的二级最小值，即是在各序列差值最小值的基础上，进一步得出所有序列的差值最小值；为差值绝对值的二级最大值，即是在各序列差值最大值的基础上，进一步得出所有序列的差值最大值。ρ为分辨系数，取值区间为(0，1)，本实验取ρ＝0.5。
2.1.4.5计算灰色关联度
关联系数ξi(k)表示参考序列X0和比较序列Xi在k(k＝1,2,3,4)时的关联程度。进一步求得某一个序列i(i＝1、2、3......27)下的关联系数的均值，则可以用来表示参考序列X0与该比较序列Xi之间的整体关联程度，即为两个序列之间的灰色关联度。
灰色关联度γ0i的计算公式如下：
(n为任一序列i下的样本数，本实验中n＝4) (5)2.1.4.6关联极性分析
序列Xi'(k)与X0'(k)间的关联极性由下式计算：
若sgn(σi)＝sgn(σ0)，则Yi与Y0正关联，即Yi对Y0起增强作用；若sgn(σi)＝-sgn(σ0)，则Yi与Y0负关联，表示Y对Y0起削弱作用，i＝1、2、3……27。这里sgn(X)为符号函数，即：
2.1.5最佳提取工艺的确定
2.1.5.1权重的确立
采用AHP-Critic混合加权法确定权重。根据黄芩抑制白色念珠菌的“谱-效”关系结果，将各指标和抑菌率作为权重指标予以量化，即将11个指标分成6个层次，并确定各指标的优先顺序：抑菌率>成分24(黄芩素)>成分27(千层纸素A)>成分19＝成分2＝成分15>成分16＝成分11(黄芩苷)＝成分18＝成分25(汉黄芩素)>成分20(汉黄芩苷)，构建成对比较的优先判断矩阵，并赋予各项指标的相对评分确定AHP权重。
Critic法是一种客观反映指标权重的赋权方法，它是以指标间的对比强度及冲突性作为基础，其中对比强度是以标准差的形式进行反映，而冲突性则以指标间的相关性进行反映。本研究采用Critic法确定各指标间的权重，将正交试验数据经线性插值进行标准化处理[指标成分＝(实测值－最小值)/(最大值－最小值)]，根据SPSS 17.0软件处理数据得到相关系数矩阵，再计算各指标对比强度(si)，冲突性(δi)，综合权重(ci)与权重(ωi)。
根据黄芩抑制白色念珠菌的“谱-效”关系特点，AHP法得到了以主观评价为基础的权重系数，基本体现了黄芩抑菌的各指标的主次顺序；在此基础上，采用Critic法求得各指标的客观权重系数，不仅考虑到了各样本数据的变异性及指标间的相关性对赋权的影响，而且避免了主观赋权存在的偏颇。为使评估权重既注重客观，又不失主观，故而将二者的结合起来，以期评价结果更加客观、真实。
综合权重计算公式如下：
2.1.5.2正交试验设计
根据药物的性质并结合实际生产要求，以提取时间(A)、提取次数(B)、溶剂倍数(C)为考察因素，安排L9(34)正交试验，因素与水平见表3.
表3黄芩提取工艺正交试验因素与水平
2.2中药杜仲叶提取工艺的研究
本实验室前期已对杜仲叶在回流水提方式下的溶剂倍数、温度、时间等因素进行过考察，发现20倍量水，60℃提取2h的工艺最佳，但未对其提取方式进行过系统性研究，且由预实验可知，杜仲叶对W.cibaria具有显著的促菌作用，其促菌作用与其提取方式密切相关，因此本实施例中在前期实验的基础上主要考察温浸水提、温浸醇提、回流水提、回流醇提4种不同提取方式对杜仲叶促菌活性的影响，以便筛选出杜仲叶的最佳提取工艺，为后续口腔调理液的制备奠定基础。
2.2.1不同提取方式提取物的制备
精密称取杜仲叶药材4份，每份10g，分别加入对应溶剂200mL(水或40％乙醇)，以回流水提、回流40％乙醇提、温浸水提、温浸40％乙醇的方式提取2h，离心过滤至澄清并将滤液于60℃减压浓缩旋蒸至10mL(生药量1g/mL)，4℃备用。
2.2.2对W.cibaria促菌活性的研究
采用微量肉汤稀释法考察杜仲叶提取液对W.cibaria生长情况的影响。实验设置了实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。取无菌96孔板，在A1-A11中分别依次加入100μL浓度为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98mg(生药量)/mL的杜仲叶提取液，再分别在A1-A11孔内加入100μL稀释至104倍的W.cibaria菌液，使每孔终浓度为500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98，0.49mg(生药量)/mL，即为实验组；B1-B11孔依次加入100μL浓度为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98mg(生药量)/mL的杜仲叶提取液，再分别加入100μL MRS液体培养基作为阴性对照；A12孔加入100μL灭菌水和100μL稀释至104倍的菌液，作为阳性对照；B12加入100μL灭菌水和100μLMRS液体培养基，作为空白对照。将96孔板置于600nm的酶标仪中测定OD值，实验平行进行3次。
生长率计算公式如下：
2.2.3最佳提取工艺的确定
根据本实施例“2.2.2”项下的实验方法，以杜仲叶对W.cibaria的生长率为指标，确定杜仲叶的最佳提取工艺。
二、提取物配比研究
采用微量肉汤稀释法考察黄芩、杜仲叶提取液对口腔菌群生长情况的影响。实验设置了实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。取无菌96孔板，在A1-A11中分别依次加入2倍稀释的黄芩、杜仲叶提取液100μL，再分别在A1-A11孔内加入100μL稀释后的菌悬液，即为实验组；B1-B11孔依次加入2倍稀释的黄芩、杜仲叶提取液，再分别加入100μL对应液体培养基作为阴性对照；A12孔加入100μL对应液体培养基和100μL稀释后的菌悬液，作为control组；B12加入200μL对应液体培养基，作为空白对照。具核梭杆菌于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48h测定OD600，其余菌每隔2h测定一次OD600，实验平行测定3次，以时间为横坐标，生长率为纵坐标绘制时间-生长曲线。
生长率计算公式：
抑菌率计算公式：
3.实验结果
一、提取物提取工艺研究
3.1中药黄芩提取工艺的研究
3.1.1指纹图谱分析方法的建立
3.1.1.1内标物及波长的选择
内标物的选择：含蒙花苷、芦丁、丹皮酚、绿原酸、橙皮苷和阿魏酸内标物的指纹谱图见图2(图2各内标物与回流水提黄芩药液的混合HPLC指纹图谱：1、蒙花苷；2、芦丁；3、丹皮酚；4、绿原酸；5、橙皮苷；6、阿魏酸)，其保留时间及分离度见表4，结果显示，蒙花苷、芦丁4种内标与黄芩色谱峰分离度不好；而绿原酸出峰位置靠前(5.957min)，丹皮酚的出峰位置靠后(47.717min),可能会影响实验的准确性；阿魏酸出峰位置在16.175min左右，但周围峰较密集；因此综合考虑出峰时间及分离度，选择分离度与出峰时间均较好的橙皮苷作为内标物，其保留时间为22.600min，分离度为12.24。
表4各内标物指纹图谱保留时间及分离度结果
波长的选择：本实验进行了190-400nm的全波长扫描，在202nm处的3D图谱见图3，在278nm处的3D图谱见图4，结果显示，在202nm处黄芩中的27个标志峰均具有较强紫外吸收，而在278nm处有部分峰紫外吸收较低；且波长>200nm的紫外吸收带包括R带、K带、B带、E带，能将含有杂原子的不饱和化合物、共轭不饱和化合物、芳环和芳香杂环化合物等检测出来，即该波长能将黄芩提取液中大部分物质全面的表达出来。因此本节黄芩的指纹图谱的波长确定为202nm。
3.1.1.2指纹图谱测定结果
按本实施例“2.1.2.1”项下的色谱条件，将混合对照品过0.45μm滤膜后进样测定，图谱见图5；将供试品与内标物的混合溶液过0.45μm滤膜后进样测定，图谱见图6(图中：A.对照品；B.供试品；a.橙皮苷；b.黄芩苷；c.汉黄芩苷；d.黄芩素；e.汉黄芩素)。所建立的指纹图谱分离度较好，简单易行，可用于黄芩药液“谱-效”关系的考察。
3.1.1.3重复性
重复性实验结果，以7号峰为参比峰，计算26种特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为<0.1％和<3.3％，表明该方法重复性良好。
3.1.1.4精密度
精密度实验结果，以7号峰为参比峰，计算26种特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为<0.3％和<3.4％，表明该仪器精密度良好。
3.1.1.5稳定性
稳定性实验结果，以7号峰为参比峰，计算26种特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为<0.4％和<4.6％，表明供试品在24h内稳定性良好。
3.1.2指纹图谱及其对C.albicans的抑菌活性
黄芩指纹图谱数据采用各标志峰峰面积与内标物峰面积的比值予以表达，抑菌效果以黄芩浓度为7.81mg(生药量)/mL时的抑菌率表达(实验考察了黄芩抑制C.albicans的最低抑菌浓度为7.81mg(生药量)/mL，且此浓度下4种方式提取液的抑菌率具有显著差异)，数据见表4，结果显示，回流水提的抑菌率为98.10％，抑菌效果最好，而其他三种方式抑菌率均低于40％。
表4黄芩指纹图谱峰比值及抑菌率实验数据表
3.1.3灰色关联度的结果分析
按本实施例“2.1.4”项下方法对黄芩“谱-效”关系进行分析，可以得到黄芩提取液中27个标志峰与抑菌率之间的关联度与关联极性，见表5。正相关表示该成分对黄芩抑制C.albicans的生长起促进作用，负相关则表示该成分对黄芩抑制C.albicans的生长起削弱作用。结果表明，除了成分1、3、8、10、12、14、21、22、26对抑菌起削弱作用外，其他成分都对抑菌起促进作用，各成分对抑菌率的影响程度见图7；其中对抑菌起促进的成分中，关联度最强的是峰24(黄芩素)，其关联度为0.7689；对抑菌起削弱的成分中，关联度最强的是峰22，其关联度为0.6247，即峰24(黄芩素)是黄芩中促进其抑制C.albicans生长的主要活性成分，而峰22所代表的成分则是削弱其抑制C.albicans生长的主要成分。
表5黄芩提取液中抑菌质量标志峰与抑菌率之间的关联度与关联极性
注：各峰关联极性与X0关联极性(-1)相同则为正相关，与X0相反则为负相关。
3.1.4最佳提取工艺的确定
3.1.4.1指标权重的确定
AHP法确定权重系数：根据黄芩抑制白色念珠菌的“谱-效”关系结果，将11个指标分成6个层次，并确定各指标的优先顺序：抑菌率>成分24(黄芩素)>成分27(千层纸素A)>成分19＝成分2＝成分15>成分16＝成分11(黄芩苷)＝成分18＝成分25(汉黄芩素)>成分20(汉黄芩苷)，构建成对比较的优先判断矩阵，见表6，结果显示，11项指标经层次分析后得到的权重系数分别为0.3195、0.2159、0.1413、0.0717、0.0632、0.0537、0.0366、0.0311、0.0274、0.0233、0.0163，一致性比例因子(CR)＝0.0571＜0.10，即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效。
表6指标成对比较的判断优先矩阵
Critic法确定权重系数：按照本实施例“2.1.5.1”项下实验方法，将正交9组数据经线性插值进行标准化处理，并再计算各指标的对比强度(si)，冲突性(δi)，综合权重(ci)与权重(ωi)，相关计算结果见表7。
表7相关计算数据
AHP-Critic混合加权法确定权重：根据黄芩抑制白色念珠菌的“谱-效”关系特点，按照本实施例“2.1.5.1”项下的实验方法，将AHP层次分析法与Critic法结合起来，计算综合权重以期评价结果更加客观、真实。各指标成分的AHP、Critic、AHP-Critic法权重见表8。
表8 AHP、Critic、AHP-Critic法权重系数
3.1.4.2正交试验结果分析
以AHP-Critic混合加权法计算得到的权重系数对正交9组实验结果进行综合评分，正交试验的直观分析结果见表9，方差分析见表10。直观分析可知，各因素对黄芩提取工艺作用主次为：C(溶剂倍数)＞A(提取时间)＞B(提取次数)，方差分析表明，C(溶剂倍数)因素对试验结果具有显著影响(p<0.05)。取各因素较高水平的组合，得最佳工艺A2B1C2，即15倍量水，回流提取1次，每次2h。
表9正交试验综合评分结果
表10方差分析结果
3.1.4.3验证试验
取同一批黄芩药材，按照上述确定的A2B1C2的提取工艺进行3次验证试验，并按照本实施例“2.1.2.1”项下色谱条件测定各特征峰的相对峰面积，再按照本实施例“2.1.3”项下方法测定黄芩抑制C.albicans的抑菌率，并计算其综合评分，评分分别为83.23、82.09、81.43分，RSD为1.1％，验证试验结果表明该提取方法工艺稳定可行。
3.2中药杜仲叶提取工艺的研究
3.2.1最佳提取工艺的确定
按照本实施例“2.2.2”项下的方法确定杜仲叶的最佳提取方式，结果见表11，结果显示，温浸水提的杜仲叶具有显著的促菌作用，生长率可达131.98％，此时药液浓度为7.81mg(生药量)/mL，因此，杜仲叶的最佳提取方式为温浸水提，提取工艺为20倍量水，60℃温浸水提2h。
表11 4种不同提取方式杜仲叶对W.cibaria最佳生长率统计表
二、提取物配比研究
黄芩提取物以最佳工艺提取得到：即15倍量水，回流提取1次，每次2h。
杜仲叶提取物以最佳工艺提取提取得到：20倍量水，60℃温浸水提2h。
1.黄芩提取物对白色念珠菌口腔致病菌生长的影响
测定黄芩对C.albicans(白色念珠菌)的MIC(最低抑菌浓度)，时间-抑菌率曲线及MIC结果见图8。结果显示，当黄芩药液浓度≥3.91mg(生药量)/mL时，对C.albicans产生抑制作用，当黄芩药液浓度≥7.81mg(生药量)/mL时，其对C.albicans的抑菌率均高于80％。
2.杜仲叶提取物对口腔益生菌唾液链球菌与食窦魏斯氏菌的生长的影响
测定杜仲叶对益生菌唾液链球菌与食窦魏斯氏菌的生长的影响，时间-生长动力学曲线见图9、图10。结果显示，当杜仲叶提取液浓度<62.5mg(生药量)/mL时，其对食窦魏斯氏菌影响较小，生长率可达80％以上；当杜仲叶提取液浓度为7.81～15.63mg(生药量)/mL时，与control组相比，食窦魏斯氏菌的生长率超过100％，表现出明显的促菌趋势，且明显高于其他浓度杜仲叶提取液作用下食窦魏斯氏菌的生长率；当杜仲叶提取液浓度<31.25mg(生药量)/mL时，其对唾液链球菌影响较小，生长率可达80％以上；当杜仲叶提取液浓度为7.81～15.63mg(生药量)/mL时，与control组相比，唾液链球菌的生长率超过100％，表现出明显的促菌趋势。
3.黄芩提取物对口腔益生菌唾液链球菌与食窦魏斯氏菌的生长的影响
测定7.81～15.63mg(生药量)/mL浓度的黄芩对益生菌唾液链球菌与食窦魏斯氏菌生长的影响，时间-生长动力学曲线见图11、图12。结果显示，当黄芩提取液浓度为7.81～15.63mg(生药量)/mL时，与control组相比，食窦魏斯氏菌的生长率超过100％，表现出明显的促菌趋势，唾液链球菌的生长率为90％左右，表明此浓度范围的黄芩对唾液链球菌基本无影响。
当黄芩药液浓度3.91～500mg(生药量)/mL时，其对C.albicans均有抑制作用；当杜仲叶提取液浓度<31.25mg(生药量)/mL时，其对唾液链球菌影响较小，生长率可达80％以上；当杜仲叶提取液浓度<62.5mg(生药量)/mL时，其对食窦魏斯氏菌影响较小，生长率可达80％以上，即黄芩与杜仲叶提取物折合生药质量比为1:16～16:1。当黄芩浓度为7.81～15.63mg(生药量)/mL时，对致病菌白色念珠菌有显著的抑制作用，而对益生菌基本无影响；当杜仲叶浓度为7.81～15.63mg(生药量)/mL时，对益生菌唾液链球菌和食窦魏斯氏菌有明显的促菌作用，即黄芩与杜仲叶提取物折合生药质量比为1:2～2:1，调节口腔菌群平衡功效最好。
实施例3.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，回流提取2h，离心过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，60℃温浸提取2h，离心过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例4.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入10倍量纯化水，回流提取1.5h，减压过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为0.8g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入15倍量纯化水，60℃温浸提取1.5h，减压过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为0.8g/mL的清膏。
实施例5.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，回流提取2.5h，离心过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.2g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入25倍量纯化水，60℃温浸提取2.5h，离心过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.2g/mL的清膏。
实施例6.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例7.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例8.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例9.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量浓度为60％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例10.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉10g，加入10倍量浓度为70％(V/V)的乙醇，回流提取1.5h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为0.9g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入15倍量浓度为30％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取1.5h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为0.9g/mL的清膏。
实施例11.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉10g，加入20倍量浓度为50％(V/V)的乙醇，回流提取3h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入25倍量浓度为35％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取3h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.1g/mL的清膏。
实施例12.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量浓度为60％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例13.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入10倍量浓度为70％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取1.5h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入15倍量浓度为50％(V/V)的乙醇，回流提取1.5h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例14.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入20倍量浓度为60％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取3h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入25倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，回流提取3h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1.1g/mL的清膏。
实施例15.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例16.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例17.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量纯化水，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例18.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量浓度为60％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量浓度为40％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例19.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量浓度为30％(V/V)的乙醇，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，60℃温浸提取2h，静置过夜除杂后，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例20.制备本发明活性成分
取黄芩粗粉15g，加入15倍量浓度为60％(V/V)的乙醇，60℃温浸提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏；
取杜仲叶15g，加入20倍量纯化水，回流提取2h，过滤至澄清，将滤液于60℃减压浓缩至生药质量浓度约为1g/mL的清膏。
实施例21.制备液体漱口液(每100mL含活性提取物折合生药量1.6g)
取600mL纯化水，依次加入9.0g PEG-60氢化蓖麻油、9.0g木糖醇、1.0g柠檬酸、4.5g柠檬酸钠、2.0gVC、2.0g溶菌酶，溶解，得到溶液A；
取0.7g薄荷香精加入20mL 95％(V/V)食用乙醇溶解并溶于200g甘油中，将溶液A搅拌下加入其中，得溶液B；
取实施例3制备得到的黄芩提取物8mL(相当于黄芩生药8g)、杜仲叶提取物8mL(相当于杜仲叶生药8g)，分别加入到溶液B中，充分搅拌均匀，用5％(W/V)柠檬酸钠水溶液调pH至5.5，用纯化水定容至1000mL，过滤至澄清，洁净条件下分装，即得。每次根据需要取适量(常用量约10～20mL)漱口，漱后吐出，即可。
实施例22.制备液体漱口液(每100mL含活性提取物折合生药量3.6g)
取600mL纯化水，依次加入15.0g PEG-40氢化蓖麻油、8.5g木糖醇、1.2g柠檬酸、4.5g柠檬酸钠、2.0gVC、3.0g溶菌酶，溶解，得到溶液A；
取0.5g薄荷香精、0.4g绿茶香精，加入15mL 95％(V/V)食用乙醇溶解并溶于220g甘油中，将溶液A搅拌下加入其中，得溶液B；
取实施例5制备得到的黄芩提取物10mL(相当于黄芩生药12g)，杜仲叶提取物20mL(相当于杜仲叶生药24g)，分别加入到溶液B中，充分搅拌均匀，用6％(W/V)柠檬酸钠水溶液调pH至6.4，用纯化水定容至1000mL，过滤至澄清，洁净条件下分装，即得。每次根据需要取适量(常用量约10～20mL)漱口，漱后吐出，即可。
实施例23.制备液体漱口液(每100mL含活性提取物折合生药量1.2g)
取650mL纯化水，依次加入9.0g月桂酰肌氨酸钠、9.5g木糖醇、1.2g柠檬酸、4.8g柠檬酸钠、2.3gVC、3.4g溶菌酶，溶解，得到溶液A；
取0.6g薄荷香精，加入10mL 95％(V/V)食用乙醇溶解并溶于200g甘油中，将溶液A搅拌下加入其中，得溶液B；
取实施例4制备得到的黄芩提取物10mL(相当于黄芩生药8g)、杜仲叶提取物5mL(相当于杜仲叶生药4g)，分别加入到溶液B中，充分搅拌均匀，用6％(W/V)柠檬酸钠水溶液调pH至4.7，用纯化水定容至1000mL，过滤至澄清，洁净条件下分装，即得。每次根据需要取适量(常用量约10～20mL)漱口，漱后吐出，即可。
实施例24.制备固体漱口片(每100g含活性提取物折合生药量5.2g)
1.制备活性成分喷雾干燥粉
取实例3得到的黄芩提取物在进风温度130℃，进液速度10ml/min条件下进行喷雾干燥，得到的黄芩喷干粉过80目筛，备用；
取实例3得到的杜仲提取物在进风温度150℃℃，进液速度10ml/min条件下喷雾干燥，得到的杜仲喷干粉过80目筛，备用。
2.制备固体漱口片
取0.7g黄芩喷干粉(折合黄芩生药3.9g)、0.2g杜仲喷干粉(折合杜仲叶生药1.3g)，混匀，依次加入0.1g十二烷基硫酸钠、2.0g薄荷香精、2.0g木糖醇、0.02g糖精钠、22.5g柠檬酸、46.9g乳糖、22.5gNaHCO3、3.0gPEG6000过筛混合至其颜色均一，粉末直接压片，片重1g，得固体漱口片，共100片。用前取1～3片(常用1片)，加水适量(常用约10-20mL)，溶解为液体漱口液，即可。
实施例25.制备固体漱口片(每100g含活性提取物折合生药量3.4g)
1.制备活性成分减压干燥粉
分别取实例5得到的黄芩和杜仲叶提取物在60℃条件下进行减压干燥，粉碎，过80目筛，分别得到的黄芩提取物粉和杜仲叶提取物粉，备用。
2.制备固体漱口片
取0.5g黄芩减压干燥粉(折合黄芩生药2.8g)、0.1g杜仲叶减压干燥粉(折合杜仲叶生药0.6g)，与25g柠檬酸、0.1g十二烷基硫酸钠、2.0g薄荷香精、2.0g木糖醇、0.02g糖精钠，混匀，70％乙醇制软材，过20目筛制粒，得颗粒1；另取25gNaHCO3、92.5g乳糖，混匀，70％乙醇制软材，过20目筛制粒，得颗粒2；取颗粒1、颗粒2，加3.0gPEG6000，混匀，用异形冲模压制三角形片，片重1.5g，得固体漱口片，共100片。
实施例26.制备固体漱口片(每100g含活性提取物折合生药量5.9g)
1.制备活性成分冷冻干燥粉
分别取实例3得到的黄芩和杜仲提取物在-40℃预冻后放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-45℃，真空度为0.06kPa进行冷冻干燥，分别得到的黄芩冻干粉和杜仲冻干粉，过80目筛，备用。
2.制备固体漱口片
取0.7g黄芩冻干粉(折合黄芩生药4.7g)、0.35g杜仲冻干粉(折合杜仲叶生药1.2g)，与26.5g柠檬酸、0.1g十二烷基硫酸钠、2.0g薄荷香精、3.0g木糖醇、0.02g糖精钠，混匀，75％乙醇制软材，过20目筛制粒，得颗粒1；另取25gNaHCO3、39.3g麦芽糊精，混匀，70％乙醇制软材，过20目筛制粒，得颗粒2；取颗粒1、颗粒2，加3.0gPEG6000，混匀，用φ12冲模压片，片重0.8g，得固体漱口片，共125片。
实施例27.制备其他口腔护理产品(每100g含活性提取物折合生药量12g)
用约20mL纯化水将0.12g糖精钠、0.24g溶菌酶、4.0mL黄芩提取物(实施例18方法制备，折合黄芩生药4g)、8.0mL杜仲叶提取物(实施例17方法制备，折合杜仲叶生药8g))溶解得到溶液A；
取28g甘油将0.36g二氧化钛分散得到混合液B；
用6g聚乙二醇-400将0.75g纤维素胶、0.35g黄原胶分散得到混合液C；
再依次将溶液A、混合液B、混合液C分别加入到均质机中搅拌30min，制成混合溶液D；
将20g二氧化硅加入到混合溶液D中，再次均质搅拌20min，再加入1.5g十二烷基硫酸钠，加水调至总重为100g，继续搅拌15min，再加入1.5g薄荷香精，搅拌5min后抽真空15min，取出膏体，泵入灌装机灌装即得。
实施例28.制备其他口腔护理产品(每100g含活性提取物折合生药量15.6g)
用约20mL纯化水将0.12g糖精钠、0.26g溶菌酶、8.0mL黄芩提取物(实施例20方法制备，折合黄芩生药8g)、8.0mL杜仲叶提取物(实施例19方法制备，折合杜仲叶生药8g)溶解得到溶液A；
取24g甘油将0.36g二氧化钛分散得到混合液B；
用6g聚乙二醇-400将0.72g纤维素胶、0.36g黄原胶分散得到混合液C；
再依次将溶液A、混合液B、混合液C分别加入到均质机中搅拌30min，制成混合溶液D；
将25g二氧化硅加入到混合溶液D中，加水调至总重为100g，再次均质搅拌20min，再加入1.5g十二烷基硫酸钠，继续搅拌15min，再加入1.2g薄荷香精，搅拌5min后抽真空15min，取出膏体，泵入灌装机灌装即得。
实施例29.天然活性物质组合物的用途及应用形式
1.仪器与材料
1.1仪器
HCB-900V垂直层流洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；SW-CJ-JF超净台(苏州净化厂)；HPX-9052MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；BSD-TX345台式摇床机(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；infinite M200PRO酶标仪(美国TECAN公司)；EYELA N-1210B旋转蒸发仪(上海艾朗仪器有限公司)；EYELA-1000S循环水式真空泵(东京理化器械株式会所)；FA124电子天平(天津亿诺科学仪器有限公司)；LS-B 50L立式压力蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)。
1.2材料
唾液链球菌(Streptococcus salivarius，S.salivarius，ATCC13419)购于广东省微生物菌种保藏中心；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis，ATCC33277)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum，ATCC10953)、白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans，ATCC1231)购自北纳创联生物技术有限公司；食窦魏斯氏菌(Weissella.Cibaria，W.cibaria，CPCC101289)购自中国药学微生物菌种保藏管理中心；哥伦比亚血平板(批号：352241)购自北纳创联生物技术有限公司；BHI肉汤(LA0360)、MRS肉汤(M8540)、营养琼脂粉(A8190)、改良马丁琼脂培养基(1108S304)、氯化血红素溶液(H8132)、维生素K3(V8170)均由北京索莱宝生物科技有限公司提供；改良马丁培养基(M4101B)由山东拓普生物工程有限公司提供；厌氧产气袋、厌氧培养袋(日本三棱瓦斯化学株式会社)；Yeast Extract酵母粉LP0021(OXOID)；杜仲叶由江西普正制药有限公司提供；野菊花、蒲公英、黄芩饮片均由河北安国市誉林药业有限公司提供；黄芪、白术、枸杞、甘草、大红袍、厚朴、丁香购自天津市同仁堂药店；溶菌酶(药用级，20190126)由河南万邦实业有限公司提供；碱性磷酸酶试剂盒A059-2、钾离子定量试剂盒(C001-2-1)、总蛋白定量试剂盒(A045-4)均由南京建成生物工程研究所；空白辅料组、黄杜口腔调理液(按实施例21方法制备)；依信西吡氯铵含漱液(批号：K1906282)购自杭州民生药业有限公司；高露洁贝齿漱口水(0035TH1113)；Yeast Extract酵母粉LP0021购自OXOID；复方氯己定含漱液(20190616，深圳南粤药业有限公司)；佳洁士抗牙龈红肿出血漱口水(00735395UB，广州宝洁有限公司)；舒克(M0150337，广州薇美姿实业有限公司)；欧乐B(92345395UA，广州宝洁有限公司)；比那氏漱口水(741-18L053，深圳市麦凯莱科技有限公司)；皓乐齿亮白净色漱口水(20190411，盛势达国际贸易(上海)有限公司)；皓齿健小苏打清新炫白漱口水(2019090601，广东康王日化有限公司)；李施德林漱口水(C110L，强生(中国)有限公司)；狮王细齿洁牙龈护理(190603CA，狮王日用化工(青岛)有限公司)；黑人双重薄荷漱口水(20190831HH4121，好来化工(中山)有限公司)；OKINA漱口水(20190401，日本OKINA株式会社)。
2.实验方法
2.1本发明调理液对口腔菌群的体外作用
对致病菌C.albicans、F.nucleatum与益生菌W.cibaria、S.salivarius的影响
测定本发明调理液(按实施例21方法制备)、空白辅料及市售漱口水对口腔菌群的影响，于96孔板内加入菌悬液100μL，再加入100μL本发明调理液与市售漱口水制剂，为实验组；同时设置control组(不加药)，阴性对照(不加菌)和空白对照(培养基)，孔内终体积不足200μL用相应液体培养基补齐，具核梭杆菌于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48h测定OD600，其余菌每隔2h测定一次OD600，实验平行测定3次，以时间为横坐标，生长率为纵坐标绘制时间-生长曲线。
生长率计算公式：
抑菌率计算公式：
2.2本发明调理液及市售漱口水对口腔菌群作用机理的研究
2.2.1本发明调理液及市售漱口水对菌细胞壁完整性的影响
取30mL活化培养至对数期的菌悬液于无菌离心管中，于4℃，4000r/min条件下，离心10min，收集菌体沉淀。用灭菌的PBS缓冲液洗涤所收集的菌体沉淀3次，再次重悬于5mLPBS缓冲液中，再分别向上述菌悬液中加入5mL空白辅料作为阴性对照，本发明调理液为实验组；以加入5mL西吡氯铵含漱液、高露洁含漱液的菌悬液作为阳性对照；以加入5mL无菌水的PBS菌悬液为空白对照；将上述菌悬液同时置于恒温培养箱中，定时取样，每隔1h取样，直至8h，再在4℃，4000r/min条件下，离心10min，取其上清液按照碱性磷酸酶试剂盒的操作方法，使用酶标仪测定其于520nm处的OD值，计算胞外碱性磷酸酶的含量，实验平行测定3次。
2.2.2本发明调理液及市售漱口水对菌细胞膜完整性的影响(菌体胞外上清液中小分子物质钾离子含量)
取30mL活化培养至对数期的菌悬液于无菌离心管中，于4℃，4000r/min条件下，离心10min，收集菌体沉淀。用灭菌的PBS缓冲液洗涤所收集的菌体沉淀3次，再次重悬于5mLPBS缓冲液中，再分别向上述菌悬液中加入5mL空白辅料漱口液作为阴性对照，本发明调理液为实验组；以加入5mL西吡氯铵含漱液、高露洁含漱液的菌悬液作为阳性对照；以加入5mL无菌水的PBS菌悬液为空白对照；将上述菌悬液同时置于恒温培养箱中，定时取样，每隔1h取样，直至8h，再在4℃，4000r/min条件下，离心10min，取上清液按照钾离子试剂盒的操作方法，用酶标仪检测菌悬液中钾离子的含量，平行测定3次。
2.2.3本发明调理液及市售漱口水对菌细胞内容物的影响(菌体胞外上清液中蛋白质含量)
取30mL活化培养至对数期的菌悬液于无菌离心管中，于4℃，4000r/min条件下，离心10min，收集菌体沉淀。用灭菌的PBS缓冲液洗涤所收集的菌体沉淀3次，再次重悬于5mLPBS缓冲液中，再分别向上述菌悬液中加入5mL空白辅料作为阴性对照，本发明调理液为实验组；以加入5mL西吡氯铵含漱液、高露洁含漱液的菌悬液作为阳性对照；以加入5mL无菌水的PBS菌悬液为空白对照；将上述菌悬液同时置于恒温培养箱中，定时取样，每隔1h取样，直至8h，再在4℃，4000r/min条件下，离心10min，测定上清液蛋白含量即胞外可溶性蛋白含量。参照总蛋白定量测定试剂盒说明进行测定。重复试验3次，计算平均值。
2.3本发明调理液对口腔菌群的体内作用
2.3.1材料与方法
2.3.1.1材料
中药口腔调理液：按实施例21方法制备
2.3.1.2研究对象
19名健康成年人，年龄20～60周岁，受试者健康情况良好，意识清醒，具有正常吞吐行为能力，无自身免疫疾病等严重系统性疾病，3个月内未接受口腔治疗及使用抗生素，非妊娠期或哺乳期妇女。该研究得到天津中医药大学医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。
2.3.2研究方法
2.3.2.1样本采集
受试者于第一天及应用受试样品(本发明实施例22调理液、调理液空白辅料溶液、不用任何受试样品)一周后第八天晨起后刷牙漱口之前取30mL生理盐水含漱30s收集于50mL无菌管内，置于-20℃冰箱中低温冻实，在冰袋保护下转移至-80℃冰箱中冷冻保存(转移时间不超过4个小时)。将样本送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行口腔微生物16SrDNA和ITS高通量测序(运输时间不超过4个小时)。应用受试样品为本发明制备的调理液、调理液空白辅料溶液及不用任何受试样品的分别记为本发明调理液组、空白辅料组及未干预组，其中空白辅料组及未干预组志愿者为自述无口腔问题者。
2.3.2.2测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7)对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；Raw Tags经过过滤处理得到高质量的Tags数据(CleanTags)。参照QIIME(V1.9.1)的Tags质量控制流程，进行如下操作：a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为<＝19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tags长度过滤：Tags经过截取后进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75％的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过UCHIME算法与数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。
2.3.2.3生物信息学分析
本研究根据所扩增的16S和ITS区域特点，基于Illumina NovaSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法，构建小片段文库进行双末端测序。经过Reads拼接过滤，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示样品物种构成；进一步的α多样性分析(Alpha Diversity)可以挖掘样品之间的差异。
(1)OTU聚类和物种注释
利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对所有样品的全部Effective Tags进行聚类，默认以97％的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs，筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。用Mothur方法与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库对OTUs代表序列进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得在kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各分类水平中各样本的群落组成。使用MUSCLE(Version3.8.31)软件进行比对，得到OTUs代表序列的系统发生关系。最后以样品中数据量最少的为标准对各样品的数据进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析是基于均一化处理后的数据。
(2)样品复杂度分析(Alpha Diversity)
Alpha Diversity用于分析样本内的微生物群落多样性。首先对不同样品在97％一致性阈值下的Alpha Diversity分析指数(shannon)进行统计，分析样本物种多样性的复杂性。
(3)物种丰度聚类分析
根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平(门、纲、目、科、属、种)下组间的差异物种，默认展示种水平的结果。
2.3.2.4数据统计分析
实验结果以x±s表示，组间通过SPSS 25.0软件分析，本发明调理液使用前后细菌的丰度数据对比采用配对t检验对数据进行分析，组间差异显著性判断采用方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05差异具有统计学意义，P＜0.01具有极显著性差异。
3.实验结果
3.1本发明调理液对口腔菌群的体外作用
本发明调理液与空白辅料及市售漱口水对致病菌C.albicans、F.nucleatum与益生菌W.cibaria、S.salivarius的影响
通过微量肉汤稀释法考察本发明调理液、空白辅料及市售漱口液对口腔菌群的影响，其时间-生长率曲线见图13、图14、图15和图16。
结果显示，与control组相比，本发明调理液对口腔致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌有显著的抑制作用，而对口腔益生菌食窦魏斯氏菌和唾液链球菌的生长基本无影响，因此使用本发明调理液后，可使得口腔内的益生菌占比增加，达到调节口腔菌群平衡的作用，而空白辅料对口腔致病菌抑制作用较弱，对口腔益生菌抑制作用则较强，表明空白辅料不能显现出调节口腔菌群平衡的趋势；其余漱口水对口腔致病菌与益生菌均具有显著的抑制作用，作用口腔后既会使致病菌数量降低也会使益生菌减少，不能达到调节口腔菌群的作用。
3.2本发明调理液及市售漱口水对口腔菌群作用机理研究
3.2.1本发明调理液及市售漱口水对菌细胞壁完整性的影响(AKP酶活力)
各漱口水作用于致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌后菌悬液胞外上清液中的碱性磷酸酶活力变化测定结果见下图17、图18、图19。
由图可以看出，在漱口水作用下的白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌菌体，其胞外上清液中AKP酶活力均有不同程度的升高；而空白对照组菌体上清液中AKP酶活力基本不变，即空白对照组细胞壁完整。中药调理液作用于白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的各时间点，其上清液中AKP酶活力均比阴性对照组AKP酶活力显著升高(P<0.01)，表明本发明调理液中主要功效黄杜天然活性物质组合物破坏致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌细胞壁的完整性的作用较强；与空白对照组相比，经本发明调理液与高露洁漱口水作用后的各时间点的AKP酶活力均具有极显著性差异(P<0.01)，而经空白辅料漱口水作用5h后、西吡氯铵漱口水作用4h后，AKP酶活力显著高于空白对照组(P<0.01)；各组漱口水作用于白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌菌体后，其上清液中AKP酶活力升高最为显著的均为本发明调理液，其次为高露洁漱口水，最不明显的为西吡氯铵漱口水，即通过破坏白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌细胞壁完整性，导致胞外中AKP酶活力增加途径发挥抑菌作用的强弱顺序依次为中药调理液>高露洁漱口水>西吡氯铵漱口水。
3.2.2本发明调理液及市售漱口水对菌细胞膜完整性的影响(菌体胞外上清液中小分子物质钾离子含量)
各漱口水作用于致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌后菌悬液胞外上清液中的钾离子含量变化测定结果见图20、图21、图22。
由图可以看出，在漱口水作用下的白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌菌体，其胞外上清液中钾离子含量均有不同程度的升高；在一定时间范围内，漱口水作用时间越长，钾离子外漏现象越明显；而空白对照组菌体胞外上清液中钾离子含量基本不变，即空白对照组细胞膜完整。本发明调理液作用于白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的各时间点，其胞外上清液中钾离子含量均比阴性对照漱口水组钾离子含量显著升高(P<0.01)，表明本发明调理液中主要功效黄杜天然活性物质组合物破坏致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌细胞膜的完整性的作用较强；与空白对照组相比，经本发明调理液、西吡氯铵漱口水、高露洁漱口水作用后的各时间点的钾离子含量均具有极显著性差异(P<0.01)，但本发明调理液作用下，上清液中初始钾离子含量最高，其上清液中钾离子含量变化最为显著，即本发明调理液通过破坏白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌细胞膜完整性发挥抑菌作用最强。
3.2.3本发明调理液及市售漱口水对菌细胞内容物的影响(菌体胞外上清液中蛋白质含量)
各漱口水作用于致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌后菌悬液胞外上清液中的蛋白质含量变化测定结果见图23、图24、图25。
由图可以看出，在漱口水作用下的白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌菌体，其胞外上清液中蛋白质含量均有不同程度的升高；而空白对照组菌体上清液中蛋白质含量基本不变。随着本发明调理液作用时间的延长，白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌菌体胞外上清液中蛋白质含量升高最明显，作用于白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的各时间点，其胞外上清液中蛋白质含量均比空白辅料漱口水组蛋白质含量显著升高(P<0.05)，表明本发明调理液中主要功效黄杜天然活性物质组合物抑制致病菌白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌蛋白合成的作用较强；与空白对照组相比，经中药调理液作用后的各时间点的蛋白质含量均具有极显著性差异(P<0.01)，西吡氯铵漱口水和高露洁漱口水组作用后的各时间点的蛋白质含量具有显著性差异(P<0.05)；在本发明调理液作用下，上清液中初始蛋白质含量最高，即本发明调理液通过抑制白色念珠菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌蛋白合成途径发挥抑菌作用较强。3.3本发明调理液对口腔菌群的体内作用
3.3.1菌群多样性分析---α多样性分析
α多样性分析是指在一个特定区域或生态系统内的多样性，衡量的是群落内部的物种多样性。Shannon指数用来估算微生物多样性，Shannon指数值越大，则表示物种多样性越高，Shannon指数差值(△)可以反映多样性的变化情况。结果见表12，应用本发明调理液前后，其Shannon指数差值(△)与未干预组无显著性差异(P>0.05)，且各志愿者口腔菌群Shannon指数差值变化均在未干预组波动范围内；而空白辅料应用一周前后，其Shannon指数明显降低(△为负)，Shannon指数差值显著低于未干预组(P<0.05)，表明辅料溶液会降低口腔菌群多样性，需要注意的是该辅料成分均为口腔漱口产品的常用组分。实验结果表明本发明调理液作用温和，其中，黄、杜提取物组合物发挥维持口腔微生态多样性稳定的作用，可将口腔菌群多样性维持在正常范围内，对正常的口腔生理功能发挥潜在的保护作用。
表12本发明调理液使用前后口腔微生物菌群的alpha多样性考察
注：△＝shannon指数值(使用后)－shannon指数值(使用前)。
3.3.2菌群结构分析
3.3.3.1基于种水平物种相对丰度分析
研究显示，导致口腔异味发生的最突出的致病菌为莫雷氏菌(Solobacteriummoorei)，可疑致病菌为牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌(Prevotella intermedia)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)等；而诱发牙周(龈)炎的主要致病菌为牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、产黑色素普氏菌(Prevotella melaninogenica)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)等。白色念珠菌是存在于口腔中的诱发口腔溃疡的一种条件致病真菌。研究发现，口腔益生菌唾液链球菌、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)等益生菌对口腔异味相关致病菌具有抑制作用，增加口腔益生菌唾液乳杆菌、罗伊氏乳杆菌以及发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)等多种益生菌的数量对牙周(龈)炎具有治疗作。有研究发现食窦魏斯氏菌与唾液链球菌对白色念珠菌有抑菌活性。
统计结果见图26和图27，应用中药调理液后，牙周(龈)炎相关致病菌牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、福塞斯坦纳菌及产黑色素普氏菌的相对丰度值均有不同程度的降低；口腔异味相关最主要致病菌莫雷氏菌的相对丰度值降低；口腔溃疡相关的条件致病真菌白色念珠菌的相对丰度值显著降低；对于口腔益生菌，除食窦魏斯氏菌相对丰度值轻微降低外，其余口腔益生菌的相对丰度值均有所升高。中药调理液对牙周(龈)炎以及口腔异味、口腔溃疡的主要致病菌均具有抑制作用，同时能上调与上述两种口腔疾病相关的益生菌的占比，提示中药调理液通过调节口腔菌群平衡对牙周(龈)炎、口腔异味及口腔溃疡具有一定的防治作用。
3.3.3.2本发明调理液使用前后志愿者口腔白色念珠菌相对丰度分析
如表13所示，比较使用本发明调理液前后口腔溃疡致病菌白色念珠菌相对丰度的变化。其中，9、10、12志愿者为口腔健康志愿者，白色念珠菌初始相对丰度值低，使用本发明调理液后，白色念珠菌相对丰度无明显变化；8、11患有口腔溃疡，白色念珠菌初始相对丰度值明显较高，使用本发明调理液后，白色念珠菌相对丰度显著降低。结果表明，本发明调理液对正常口腔菌影响较小，但可明显下调异常偏高的条件致病菌相对丰度水平，有利于口腔菌的平衡及异常状态的恢复。
表13本发明调理液使用前后白色念珠菌相对丰度比较
注：Q：使用调理液前，H：使用调理液后
实施例30.产品效果评价
1、实验方法
(1)准备期：试验前14d进行志愿者筛选工作。排除孕妇及哺乳期妇女，精神性疾病患者，正在进行激素治疗、抗生素治疗者。其中男性7例，女性12例；年龄18～80岁，其中口腔异味(口臭)5人、口腔溃疡4人、牙周、牙龈肿痛2人、咽炎不适1人，其它日常清洁7人。
(2)含漱液：实施例21制备得到的液体漱口液，黄芩提取物与杜仲叶提取物折合生药的质量比为1:1、并且两提取物折合生药质量之和占口腔菌群多态性调节剂整体为1.6％(W/V)。
(3)含漱方法：每天含漱3次，于早中晚进食后各含漱1min，每次15mL，含漱后1h内不得进食。试验期间避免食用黏性或高糖食物，不能咀嚼口香糖、饮酒及喝饮料。
(4)试验期：共进行实验病例19例，按照上述使用方法，连续使用7d，观察治疗结果。
2、实验结果
口腔异味(口臭)：5人均消除；
口腔溃疡：在保持口腔清洁的同时，漱口后溃疡处灼痛减轻，使用3-4次后疼痛明显缓解，使用2d后灼痛基本消失，溃疡处颜色变浅，红肿消失，4人口腔溃疡基本痊愈，3日后能够恢复正常刷牙而未产生触碰疼痛；
牙周、牙龈肿痛：用后明显减轻肿痛，同时伴随炎症产生的口臭得到显著减轻；
咽炎：刷牙虽能解决口腔清洁问题，但咽部肿痛、舌苔黏腻不适依然存在，用本发明漱口液后肿痛感减小，舌苔黏腻改善明显。
其他：日常清洁，用于饭后口腔清洁，均口气清晰，口感清甜舒爽，是不便于刷牙等口腔护理的方便选择。
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