发明内容

为实现上述目的，本发公开了如下的技术内容：

一种用于治疗肝癌的中药方剂（肝癌协定方GAXD），其特征在于它是由下述重量份数的原料组成：

土贝母5份、防己3份、大黄1份、川芎2-3份和黄芪3-5份组成。优选的原料组成：土贝母5份、防己3份、大黄1份、川芎2份和黄芪5份。

本发明进一步公开了治疗肝癌的中药方剂（肝癌协定方GAXD）的制备方法，其特征在于先将大黄加入水一钟半，再加入土贝母、防己、川芎和黄芪，温火熬制20-30分钟，即可。

本发明更进一步公开了用于治疗肝癌中药方剂（肝癌协定方GAXD）在制备抑制肝癌肿瘤生长药物中的应用，特别是在制备抗病毒药物中的应用。

实验结果显示：建立HBV+ HCC移植瘤模型（即裸鼠荷瘤HepG2.2.15细胞）经GAXD灌胃治疗后发现，GAXD治疗组的肿瘤增殖受到明显抑制，且瘤组织和外周血清中的HBV病毒载量和HBV抗原（HBsAg和HBeAg）浓度也明显降低。此外，GAXD治疗组的瘤组织中与肿瘤血管新生相关的关键分子HIF-1a和VEGFA的表达也明显下降。接下来，通过制备GAXD的含药血清与HepG2.2.15细胞共孵育发现，GAXD显著抑制STAT3信号通路，从而发挥抗肿瘤和抗病毒活性。另外研究还发现，GACD对NK细胞的比例和功能活性也发挥调节作用。

本发明主要解决了：STAT3的过度活化在HBV感染后肝脏炎症致癌的过程中发挥重要的作用，因此，STAT3信号蛋白成为治疗HBV相关肝癌的有效的靶点分子。我们观察到“基于STAT3信号通路”的肝癌协定方（GAXD）在抑制肿瘤增殖的同时清除HBV病毒，在抑制肿瘤血管新生的同时又能正向调节NK细胞的功能，进而影响乙肝相关肝癌治疗。

重点考察了：肝癌协定方（GAXD）对HBV+ HCC全面的治疗效果：（1）抑瘤效果，（2）抗病毒效果，（3）抗肿瘤血管新生效果，（4）对肿瘤免疫的调节效果（主要是NK细胞）。

主要的难点在于：我国是肝癌的高发区，特别是HBV所致的肝癌病人众多。这些HBV相关肝癌患者，其肝脏中同时存在着性质截然不同的两种疾病—恶性肿瘤和病毒性肝炎，两者往往相互影响，恶性循环，也因此具有恶性程度高，发展迅速，治疗后易复发和转移的特点。

因此针对HBV相关肝癌患者，抗病毒治疗和抗癌治疗必须同时进行，不能偏废。但目前针对此类患者首选的临床治疗方案（包括肝移植，肝切术，介入治疗等），由于复发率高，结果并不理想；化疗药物（奥沙利铂联合氟尿嘧啶）和靶向药物（索拉菲尼等）对肝癌患者获益也十分有限；与此同时，研究发现，即使治疗中联用抗病毒的核酸类药物在治疗中的实际效用也未见明显增加。因此，HBV相关肝癌迫切需要寻找新的治疗靶点，治疗方法和方案。

近年来，中医药以其整体治疗的思路和辩证施治的方式，并且具有组分及靶点较多，对免疫系统的调节作用明显，副作用小，叠加及协同作用好的特点，得到了医疗界和更多研究学者的广泛关注。因此，我们也在积极将中医药的治疗应用于乙肝相关肝癌，并逐步深入的阐明其作用机制。

本发明更加详细的描述如下：

本发明的药物组成：肝癌协定方（GAXD）以土贝母（5钱）、防己（3钱）、大黄（1钱）、川芎（2钱）和黄芪（5钱），五味中药组合搭配。其中：

剂量1：土贝母5钱、防己3钱、大黄1钱、川芎2钱和黄芪5钱

剂量2：土贝母5钱、防己3钱、大黄1钱、川芎2钱和黄芪3钱

剂量3：土贝母3钱、防己3钱、大黄1钱、川芎2钱和黄芪5钱

实验发现剂量1的在HBV相关肝癌中的抗肿瘤效果最佳。

本发明所述各药物的作用如下：

土贝母：清热化痰，散结拔毒。

防己：利水消肿，祛风止痛。

大黄：泻热毒，破积滞，行瘀血。泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经。

川芎： 活血行气，祛风止痛。

黄芪：补气益气、升阳固表、托毒消肿、利水生肌,

熬制方法：先将大黄加入水一钟半，再加入土贝母、防己、川芎和黄芪，温火熬制。

本发明的基础实验结果如下：

申请人团队，检测肝癌协定方（GAXD）在乙肝相关肝癌移植瘤模型上的治疗效果，并初步检测了肝癌协定方（GAXD）对NK细胞比例和活性的影响，主要成果如下：

（1）肝癌协定方（GAXD）在移植瘤的模型上有效抑制肿瘤生长

申请人通过接种瘤块的方式，即裸鼠腋下荷瘤HepG2.2.15细胞，2周后处死，取瘤块，将瘤块分成1´1´1mm³大小的小瘤块，再接种到新的裸鼠的腋下，建立了HBV相关肝癌细胞系HepG2.2.15的移植瘤模型（Fig.1A）。瘤块接种10天后，随机分4组：对照组（Untreatedgroup）、阳性对照组（S31-201 group）、GAXD低剂量组（6g/Kg）和GAXD中剂量组（12g/Kg）。瘤块接种13天后根据分组情况进行治疗。结果发现，肝癌协定方（GAXD）治疗组的移植瘤模型有明显的抑瘤作用，且治疗效果与剂量相关（Fig.1B&C）。这说明，肝癌协定方（GAXD）在乙肝相关肝癌中发挥治疗作用。

（2）GAXD在移植瘤的模型上有效清除病毒；

申请人检测了不同治疗组瘤块组织和裸鼠外周血清中的HBV病毒滴度，发现GAXD治疗组HBV病毒载量明显降低，且病毒载量与剂量相关（图.2A&B）。与此同时，也检测了不同治疗组裸鼠外周血清中HBV抗原（HBsAg和HBeAg）的表达水平。结果表明GAXD治疗组裸鼠外周血清中的HBV抗原也明显减少（图2.2C&D）。这些结果说明，GAXD在乙肝相关肝癌治疗中发挥抗病毒作用。

（3）GAXD在移植瘤的模型上有效抑制血管增生

血管再生是肿瘤发生和发展的重要因素，特别在HBV诱导肝癌发生的过程中发挥重要的作用。申请人通过免疫组化技术检测了不同治疗组瘤块组织中与肿瘤血管生成相关分子HIF-1a和VEGFA的表达。发现GAXD治疗组的瘤组织中HIF-1a和VEGFA表达明显降低（Fig.3A&B）。这些结果说明，GAXD在乙肝相关肝癌治疗中发挥抗肿瘤血管的作用。

（4）GAXD抑制STAT3信号通路的活化

申请人在HepG2.2.15细胞的移植瘤裸鼠模型中观察到了GAXD与STAT3抑制剂S31-201类似的治疗效果，但是GAXD的分子机制还不清楚。因此，申请人将GAXD的含药血清与HepG2.2.15细胞共孵育培养6h后，提取蛋白，使用Western-blot技术分析了于乙肝相关肝癌发生和发展密切相关的几条信号通路，包括PI3K，MAPK和STAT3。结果发现GAXD明显抑制STAT3蛋白的磷酸化水平，而对PI3K和MAPK信号通路中的关键信号分子的表达影响不明显（Fig.4A&B&C）。这说明，GAXD在乙肝相关肝癌治疗中通过抑制STAT3信号通路发挥作用。

以上研究成果表明，临床经方GAXD在裸鼠移植瘤模型上表现出同STAT3抑制剂S31-201类似的治疗效果：兼顾抗肿瘤和抗病毒，且GAXD抑制了STAT3信号通路的活化。已知沉默肝癌细胞中的STAT3可以激活肝癌微环境中NK细胞的活性，从而逆转肿瘤诱导的免疫耐受，因此，我们推测GAXD可能会逆转肿瘤微环境中NK细胞的功能低下，并接下来初步检测了GAXD对NK细胞比例和活性的影响。

（5）GAXD增加外周血NK细胞的比例和活性

申请人分离裸鼠外周血淋巴细胞，利用CD3和DX5 抗体对NK 细胞进行特异性标记。结果发现GAXD治疗组的NK细胞的比例和活化分子CD69的表达水平升高（Fig.5A&B）；MTT法检测到NK细胞对敏感细胞系YAC-1的杀伤率明显增加（Fig.5C）。这说明， GAXD对NK细胞的比例和功能活性有调节作用。

上述研究就也充分证明中药复方不仅仅通过STAT3信号通路抑制HBV+肝癌细胞体外生长和病毒复制，在体内实验中GAXD对NK细胞的比例和活性有调节作用。