一种抗肿瘤载药纳米复合材料
阅读说明：本技术 一种抗肿瘤载药纳米复合材料 (Anti-tumor drug-loading nano composite material ) 是由 聂雯 于 2020-03-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗肿瘤载药纳米复合材料,属于抗肿瘤药物领域。本发明的载药纳米复合材料是以两亲性聚合物作为载体,将阿霉素和α-倒捻子素包裹于疏水内核制备而成。本发明的纳米复合物内部的阿霉素和α-倒捻子素发挥协同增效作用,能明显抑制胶质瘤细胞增殖、促进胶质瘤细胞的凋亡,并能明显抑制瘤体周围血管生成,抗肿瘤效果优良。(The invention discloses an anti-tumor drug-loaded nano composite material, and belongs to the field of anti-tumor drugs. The drug-loaded nano composite material is prepared by taking amphiphilic polymer as a carrier and coating adriamycin and alpha-mangostin on a hydrophobic core. The adriamycin and the alpha-mangostin in the nano composite of the invention play a synergistic effect, can obviously inhibit the proliferation of glioma cells, promote the apoptosis of glioma cells, and obviously inhibit the angiogenesis around tumor bodies, and has excellent anti-tumor effect.)
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域。
背景技术
神经胶质瘤(Glioma)，简称胶质瘤，是起源于神经上皮细胞的肿瘤，是成人中最常见的恶性原发性脑癌之一。神经母细胞瘤(Neuroblastoma)是胶质瘤中的最具侵袭能力的类型，占胶质瘤的一半。此外，高达30％的系统性肿瘤发生脑转移。尽管数十年来持续不断的努力和外科治疗，放疗和化学疗法的进步，目前的疗法仍然有限，导致预后不良。治疗后，只能延长几个月的生存期，无法治愈。诊断后五年内，超过65％的患者死亡，治疗后复发率高。鉴于整体治疗效果不理想，尤其是单一治疗方法，需要更有效的治疗方法来治疗恶性神经胶质瘤。
阿霉素(Dox)是一种蒽环类药物，自1960年代以来一直用作癌症治疗的一线化疗药物。它的机制是抑制DNA合成并破坏DNA，激活各种信号通路，促进细胞凋亡或坏死。但是，它也对正常组织和器官(如心脏和大脑)有毒。此外，药物渗透也会引起副作用，其严重程度取决于其剂量。由于Dox对正常组织的毒性，其临床应用受到很大限制。因此，近年来，人们努力研究Dox的递送系统以减少前者对正常细胞的毒性和副作用。
两亲性聚合物(Amphiphilic polymer)，即在同一分子链中既含有亲水链段和又含有亲油链段的聚合物。它们在亲水环境下能自组装形成核-壳结构(疏水性内核和亲水性壳体)胶束，能包裹疏水性药物，可用作疏水性药物的载体，以提高药物的运输效率和半衰期。甲氧基聚(乙二醇)-聚(ε-己内酯)(MPEG-PCL)是一种由聚己内酯(PCL)和聚乙二醇(PEG)聚合形成的两亲性聚合物，聚乙二醇带有一个甲氧基。其结构式如下：
式中PEG重复单元数(即聚合度)为n，PCL重复单元数为m。
研究表明，使用MPEG-PCL搭载Dox可以增强后者的抗肿瘤(黑色素瘤)活性，并降低其心肌毒性(Improved antitumor activity and reduced myocardial toxicity ofdoxorubicin encapsulated in MPEG-PCL nanoparticles.Oncology Reports,35(6),3600–3606.doi:10.3892/or.2016.4748)。但经过发明人的实验，将其应用于胶质瘤的治疗，效果仍不够理想。
α-倒捻子素(α-Mangostin，α-m)是从热带植物山竹中的一种具有抗肿瘤作用的次生代谢产物。研究表明α-m对胰腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、脑瘤等肿瘤具有抑制作用，有望应用于胶质瘤的治疗。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种治疗胶质瘤的载药纳米复合材料，该纳米复合材料使用两亲性聚合物同时搭载Dox和α-m，能显著提高抗肿瘤效果。
本发明的技术方案如下：
一种载药纳米复合材料，所述载药纳米复合材料是以两亲性聚合物作为载体，将阿霉素和α-倒捻子素包裹于疏水内核制备而成；
阿霉素与α-倒捻子素重量比为16∶(1～16)；
α-倒捻子素与载体的重量比为(1～10)∶100。
如前述的纳米复合材料，所述两亲性聚合物是MPEG-PCL。
如前述的纳米复合材料，所述MPEG-PCL其结构式如下所示：
式中n为15～110的整数，m为23～110的整数；
优选的，n为15、23、45或110；
进一步优选的，n为15，m为45。
如前述的纳米复合材料，所述复合材料的制备方法如下：
1)将α-倒捻子素和MPEG-PCL以重量比(1～10)∶100溶解到同一丙酮溶液中，减压蒸发去除丙酮，加水使α-倒捻子素和MPEG-PCL完成自组装，形成α-m/M胶束；
2)在α-m/M胶束中加入缓冲液稳定其pH在7.4，加入阿霉素水溶液，使阿霉素被自组装到α-m/M胶束核心，即得；
步骤2)中阿霉素水溶液中所含阿霉素与步骤1)中α-倒捻子素的重量之比为16∶(1～16)。
如前述的纳米复合材料，所述制备方法中，步骤1)的α-倒捻子素和MPEG-PCL的重量比为1∶16。
如前述的纳米复合材料，所述制备方法中，步骤2)中阿霉素水溶液中所含阿霉素与步骤1)中α-倒捻子素的重量之比为16∶7；
前述纳米复合材料在制备抗肿瘤药物中的用途。
如前述的用途，所述肿瘤为胶质瘤。
一种抗肿瘤药物或抗肿瘤联合用药物，所述药物的抗肿瘤活性成分为α-倒捻子素和阿霉素。
α-倒捻子素和阿霉素在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤联合用药物中的用途。
进一步的，所述肿瘤为胶质瘤。
本发明的复合材料能明显抑制胶质瘤细胞增殖、促进胶质瘤细胞的凋亡，并能明显抑制瘤体周围血管生成；该效果优于单独使用Dox(以MPEG-PCL为载体)与α-倒捻子素(以MPEG-PCL为载体)效果的简单叠加，表明其内部的Dox与α-倒捻子素产生了协同增效作用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：通过Langevin动力学模拟揭示了MPEG-PCL共聚物，α-m和Dox的相互作用模式(骨架图)。(A)与α-m和Dox复合的MPEG-PCL共聚物的初始构象。左，右上和右下分别代表MPEG-PCL共聚物α-m和Dox。MPEG-PCL共聚物中的两个末端重原子使用“球形”样式突出显示。构象(B)，(C)，(D)，(E)和(F)分别对应于以100ps，200ps，300ps，400和500ps收集的纳米复合材料的快照。
图2：通过Langevin动力学模拟揭示了MPEG-PCL共聚物，α-m和Dox的相互作用模式。描绘的纳米复合材料具有固体表面。(A)与α-m和Dox复合的MPEG-PCL共聚物的初始构象。左，右上和右下分别代表MPEG-PCL共聚物α-m和Dox。构象(B)，(C)，(D)，(E)和(F)分别对应于以100ps，200ps，300ps，400和500ps收集的纳米复合材料的快照。
图3：纳米复合材料的表征。(A)用α-m和Dox封装的MPEG-PCL胶束的结构模型；(B)MPEG-PCL胶束的TEM图像；(C)用α-ma和dox包裹的MPEG-PCL胶束的尺寸分布光谱；(D)用α-m和Dox封装的MPEG-PCL胶束的Zeta电位。
图4：通过MTT测定法对纳米复合材料的C6和Gl261细胞活力。将C6(A)和G1261(B)细胞分别以不同浓度的α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M处理24小时，48小时和72小时。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图5：通过MTT测定纳米复合材料处理的U87细胞活力。用不同浓度的α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M处理U87细胞24小时，48小时和72小时。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图6：G1期细胞周期停滞。(A)细胞周期；(B)(A)中G1期细胞周期的细胞百分比；(C)(A)中S期细胞周期的细胞百分比；(D)(A)中G2/M期细胞周期的细胞百分比；(E)细胞周期相关蛋白的蛋白质印迹。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图7：流式细胞术检测Gl261细胞的凋亡。将G1261细胞与不同浓度的α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M孵育48小时。收集细胞并用Annexin-V和PI染色，流式细胞仪分析。(A)通过流式细胞术测量的凋亡细胞；(B)直方图是(A)中膜联蛋白V阳性和PI阴性细胞的统计数据；将Gl261细胞与α-m/M(0.156μg/ml)，Dox(0.156μg/ml)和α-m-Dox/M(0.156μg/ml+0.156μg/ml)孵育48小时。收集细胞用于蛋白质印迹。(C)凋亡相关蛋白的蛋白质印迹。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图8：通过流式细胞术检测C6细胞凋亡。将C6细胞与不同浓度的α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M孵育48小时。收集细胞并用Annexin-V和PI染色，使用流式细胞术分析。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图9：通过流式细胞术检测U87细胞凋亡。将U87细胞与不同浓度的α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M孵育48小时。收集细胞并用Annexin-V和PI染色，使用流式细胞术分析。误差棒表示平均值±s.e.m.；数据代表3份重复的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图10：线粒体对细胞凋亡的控制。(A)线粒体膜电位的变化(ΔΨm)；(B)直方图是(A)的统计量；(C)凋亡相关蛋白的蛋白质印迹。误差棒表示平均值±s.e.m.数据代表一式三份的培养物中进行的至少两个独立实验。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；双向方差分析和学生t检验。
图11：在斑马鱼肿瘤模型中的抗肿瘤作用。NS，vehicle，α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M处理的Gl261转基因斑马鱼的图像。数据代表至少两个独立的实验，n＝5。NS，生理盐水；vehicle，MPEG-PCL载体，简称“载体”。
图12：在皮下C6神经胶质瘤模型中的抗肿瘤作用。(A)不同组的肿瘤图像；(B)肿瘤生长曲线；(C)肿瘤重量；(D)体重。数据代表至少两个独立实验，n＝5；以学生t检验计算P值，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns：无统计学意义。
图13：在皮下Gl261神经胶质瘤模型中的抗肿瘤作用。(A)不同组的肿瘤图像；(B)肿瘤生长曲线；(C)肿瘤重量；(D)体重。数据代表至少两个独立实验，n＝5；以学生t检验计算P值，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，ns：无统计学意义。
图14：在原位植入神经胶质瘤模型中的抗肿瘤作用。(A)体内光学成像；(B)脑的H&E染色；(C)扩大(A)中的相应位置；(D)不同组的生存曲线检测；(E)体重。数据代表至少两个独立实验，n＝5；以学生t检验计算P值，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图15：Ki67肿瘤组织切片染色。肿瘤组织来自原位植入神经胶质瘤小鼠。(A)Ki67染色切片的图像；(B)Ki67阳性细胞的平均百分比；数据代表至少两个独立实验，n＝3；以学生t检验计算P值，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图16：α-M-Dox/Mon肿瘤增殖，血管生成和凋亡的影响。(A)在不同组的肿瘤组织切片中进行Ki67染色以可视化肿瘤增殖；CD31染色用于分析肿瘤血管生成。进行TUNEL染色以研究肿瘤细胞凋亡；H&E染色用于观察细胞形态。(B)Ki67阳性细胞的平均百分比；(C)CD31阳性血管的平均百分比；(D)Tunel阳性细胞的平均百分比(凋亡指数)。数据代表至少两个独立实验，n＝5；以学生t检验计算P值，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图17：用H&E染色进行的重要器官毒性测定。从小鼠收集心脏，肝，脾，肺和肾的主要器官用于组织学检查。数据代表至少两次独立实验；n＝3。
图18：血清生化分析。误差棒表示平均值±s.e.m.。数据代表至少两个独立实验。n＝5。缩写：ALB，白蛋白；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；AMY，淀粉酶；BUN，血液尿素氮；TC，总胆固醇；TBil，总胆红素；LDL，低密度脂蛋白胆固醇；LDH，乳酸脱氢酶；HDL，高密度脂蛋白胆固醇；GLU，葡萄糖；CREA，肌酐；CK，肌酸激酶；TG，甘油三酸酯；TP，总蛋白；UA，尿酸。
图19：血液常规检查。误差线表示平均值±s.e.m.。数据代表至少两个独立实验。n＝5。缩写：HGB，血红蛋白；PLT，血小板；RBC，红细胞；WBC，白细胞。
具体实施方式
实施例1载药纳米复合材料的制备和鉴定
1.制备
α-m和Dox均以自组装的方式被包裹于MPEG-PCL。具体如下：
1)将5mg的α-m和90mg的MPEG-PCL(PEG部分重复单元数量15，PCL部分重复单元数量为45)溶解在2mL的丙酮中，然后在55℃的旋转蒸发器中减压蒸发。然后将6mL水加到上述聚合物和药物混合物中，使α-m和MPEG-PCL自组装，形成核壳结构的α-m/M胶束共8mL；
2)在1.4mL的前述α-m/M胶束中加入0.2mL的10×磷酸盐缓冲液(10×PBS，pH7.4)，同时搅拌，然后缓慢加入0.4mL的Dox水溶液(5mg/mL)，同时持续搅拌，20min后，Dox被自组装到α-m/M胶束核心，得到α-m-Dox/M胶束，即本发明的载药纳米复合材料。
如果需要制备单独搭载Dox的MPEG-PCL胶束(Dox/M胶束)，其制备过程类似前述步骤1)和2)，唯一不同的是要步骤1)中的α-m省略。
2.载药率(DL)与包封率(EE)
通过HPLC方法对纳米复合材料检测各种胶束中药品与vehicle的含量：将10mgα-m/M、Dox/M和α-m-Dox/M胶束分别溶解到0.1mL的甲醇作为样品，使用Waters 2966液相色谱仪进行检测，使用反相C18柱(4.6×150nm，5μm，SunfreAnalysis column)进行分离，其柱温保持在28℃，并选择甲醇-水(70/30，v/v)作为流动相，流速为1mL/min。并以如下方法计算DL和EE：
式(2)中理论载药率为制备时的物料比。
结果显示：α-m-Dox/M胶束中α-m的DL和EE分别为5％和99.5％；Dox的DL和EE分别为5％和93.5％。
3.计算机分子动力学模拟
发明人使用计算机模拟来探索水环境中α-m，Dox和MPEG-PCL共聚物之间的相互作用。
如图1和图2所示，这三者在水性环境中缓慢靠近并相互作用。通过改变位置并调整构象，α-m和Dox在MPEG-PCL表面找到了最合适的组合位置。同时，通过动态调整构象，MPEG-PCL为α-m和Dox提供了合适的结合位点。因此，通过相互协调已经建立了一个稳定的系统。
4.进一步鉴定
纳米复合材料的结构模型如图3A所示。用透射电子显微镜(TEM)分析了被α-m和Dox包裹的MPEG-PCL胶束的形态，可以看出α-m-Dox/M纳米复合材料是直径约25nm的球形结构(图3B)。另外，通过Zetasizer Nano ZSP(Malvem Panalytical，UK)证实了α-m-Dox/M的尺寸分布和ζ电势。如图3C所示，具有球形结构的纳米复合材料的平均流体动力学直径为25.68nm。PDI为0.192，说明具有单峰的窄粒度分散。同时，纳米复合材料的表面电势为负(-1.51mV)(图3D)，这有助于延长体内循环时间。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果进一步说明。实验例中，“联合治疗”即使用α-m-Dox/M进行治疗，α-m/M、Dox/M和α-m-Dox/M的制备方法同实施例1。
实验例1体外抑制胶质瘤细胞
应用MTT法检测不同浓度处理24h、48h和72h后胶质瘤细胞C6、U87和G1261细胞的活力，具体方法如下：
将C6细胞接种到96孔板中并过夜孵育。用不同的药物处理细胞，包括α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M。α-m/M的浓度如下：与Dox/M的浓度相同，为0、0.039、0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml。处理24小时，48小时和72小时后，加入MTT溶液(0.2mg/ml)，并与细胞共孵育2小时。然后通过分光光度法评估细胞代谢MTT的能力。每个样品重复4次。此外，还在包括U87和Gl261在内的其他细胞系中进行了MTT测定。纳米复合材料的剂量和步骤与C6细胞相同。
结果表明，Dox/M的单独治疗和α-m-Dox/M的联合治疗以一定浓度范围(0-0.312μg/ml)的时间依赖性和剂量依赖性模式抑制细胞活性。而且，与其他时间相比，处理24小时的细胞的活性没有显着降低。如图4A所示，以0.156μg/mlα-m-Dox/M的浓度联合治疗48小时的C6细胞存活率约为25％，而Dox/M处理的存活率约为70％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001)。上面的组合浓度是达到对细胞活性最大抑制作用的最小剂量。同样，在Gl261细胞中也发现了这一结果(图4B)。但是，对于U87细胞，联合处理72小时后，在相同浓度下效果更好(图5)。所有结果都表明，低剂量(均为0.156μg/ml)的α-m和Dox封装的MPEG-PCL胶束的联合治疗比单独治疗更有效地抑制细胞活性。
实验例2细胞周期阻滞检测
为了研究抑制胶质瘤生长的机制，发明人研究了细胞周期和相关蛋白。具体如下：
将Gl261细胞在含有α-m/M(0.156μg/ml)、Dox/M(0.156μg/ml)或α-m-Dox/M(0.156μg/ml+0.156μg/ml)的培养基中孵育48h，再收集细胞进行PI染色，并进行Westen Blot检测p-Akt(磷酸化Akt)、Akt、p-Fox01(磷酸化Fox01)、Fox01、p53、p21、CKD4、Cyclin D1、CDK2、Cyclin E等蛋白。
结果如图6所示：α-m-Dox/M处理后G1期的细胞比例为87％，而其他组分别为37％(NS组，即生理盐水组，下同)，36.5％(vehicle组，即MPEG-PCL载体组，下同)，30％(α-m/M)和70％(Dox/M)(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M与NS，p＜0.001)。此外，与单药治疗相比，α-m-Dox/M中细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2，细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达明显降低，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)p21和肿瘤抑制因子p53上调更多。此外，α-m-Dox/M治疗后，Akt和FoxO1水平略有升高，而p-FoxO1和p-Akt水平明显降低。
因此，这些结果表明α-m-Dox/M能够阻断胶质瘤细胞的细胞周期，上调肿瘤抑制因子，起到明显的抗肿瘤作用。
实验例3体外凋亡检测
为了进一步验证不同浓度的纳米复合材料的功效，发明人将Dox/M、α-m/M、α-m-Dox/M胶束处理(浓度为0、0.039、0.078、0.156或0.312μg/mL)过的神经胶质瘤细胞用PI和Annexin V-FITC染色，在流式细胞仪下检测坏死和凋亡。发明人还检测了线粒体膜电位(ΔΨm)以及内在凋亡途径(intrinsic apoptotic pathway)中的部分蛋白的表达。
如图7-9所示，用单独用α-m/M处理的凋亡细胞的百分比变化不大，这表明α-m/M对神经胶质瘤细胞影响很小。Dox/M单独和联合治疗(α-m-Dox/M)可促进细胞凋亡，并且细胞凋亡的比例与药物剂量呈正相关。当浓度为0.156μg/ml时，联合治疗组中Gl261细胞的凋亡率为30.14％，Dox/M组中该比例为19.8％，而α-m/M组中该比例为19.8％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001)(图7A-B)。类似地，α-m-Dox/M组的C6细胞凋亡率为31.03％，Dox/M为22.89％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001)(图8)。用α-m-Dox/M处理的凋亡性U87细胞比例为28.29％(Dox/M治疗为21.89％；α-m-Dox/M与Dox/M相比，p＜0.001)(图9)。而且，与单一处理相比，在用α-m-Dox/M处理的细胞中，凋亡相关蛋白胱天蛋白酶(Caspase)8，胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3被更多地激活。这些结果表明纳米复合材料促进神经胶质瘤细胞的凋亡，这与MTT测定的结果一致。
线粒体膜电位(ΔΨm)的变化被认为与内在的凋亡途径有关。在图10A-B中，用α-m-Dox/M处理的ΔΨm骤降(collapsed)的细胞百分比为43.9％，而其他组分别为2.79％(NS)，2.99％(vehicle)，4.47％(α-m/M)和16.06％(Dox/M)(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M与NS，p＜0.001)。此外，观察到抗凋亡蛋白Bcl-2的显着下调，用α-m-Dox/M处理的神经胶质瘤细胞中促凋亡蛋白Bax的上调(图10C)。
这些结果表明，固有的凋亡途径与α-m-Dox/M的抗肿瘤作用有关。
实验例4斑马鱼肿瘤模型中的抗肿瘤实验
为了直接和快速地观察体内药物的治疗效果，将FLK-1启动子EGFP转基因(Tg(FLK-1：EGFP))斑马鱼品系用于抗肿瘤评估。Tg(FLK-1：EGFP)斑马鱼的内皮细胞发出绿色荧光，斑马鱼中的血管呈现出一致且明亮的荧光。将斑马鱼麻醉后，在显微镜下将标记有红色荧光染料的Gl261细胞用显微注射器注射到斑马鱼中。接种24小时后，将MPEG-PCL，α-m/M，Dox/M和α-m-Dox/M分别加入到Holtfreter液中来处理斑马鱼。在第五天，在共聚焦显微镜下拍摄斑马鱼的图像。
如图11所示，联合治疗组的肿瘤体积(红色荧光区域)明显小于单一治疗组。
因此，用α-m和Dox封装的MPEG-PCL胶束的联合处理可抑制斑马鱼模型中肿瘤的生长。
实验例5皮下神经胶质瘤模型中的抗肿瘤和延长生存期实验
本实验例在Gl261和C6皮下模型中研究了纳米复合材料的抗肿瘤活性。
为了建立皮下神经胶质瘤模型，给每只C57BL/6小鼠皮下注射1×106个Gl261细胞，给每只BALB/c裸鼠皮下注射1×107C6细胞。待移植瘤体积为100±10mm3时，小鼠模型随机分成5组，每组16只，分别注射生理盐水(NS组)、MPEG-PCL(vehicle组)、Dox/M(Dox/M组)、α-m/M(α-m/M组)和α-m-Dox/M(α-m-Dox/M组)；其中，MPEG-PCL的剂量为3mg/kg，Dox/M的剂量为3mg/kg，α-m/M的剂量为3mg/kg，α-m-Dox/M的剂量为3mg/kg；注射周期为每3天一次。再通过不同组小鼠的肿瘤体积，肿瘤重量和存活时间评估不同治疗方法的抗肿瘤作用。
在C6模型中，α-m-Dox/M治疗在所有组中抑制肿瘤生长的效果最佳(图12)。治疗后第14天，α-m-Dox/M组的平均肿瘤体积为209cm3(图12A-B)，平均肿瘤重量为0.11g(图12C)；而α-m/M组平均肿瘤体积为1081cm3，平均肿瘤重量为0.81g；Dox/M组平均肿瘤体积为822cm3，平均肿瘤重量为0.55g。另外，单独使用MPEG-PCL载体无抑制肿瘤的作用。
在Gl261模型中可以观察到类似的结果(图13)，治疗后第14天，α-m-Dox/M组的平均肿瘤体积为573cm3，平均肿瘤重量为0.34g；而α-m/M组平均肿瘤体积为2057cm3，平均肿瘤重量为1.12g；Dox/M组平均肿瘤体积为1392cm3，平均肿瘤重量为0.84g。另外，单独使用MPEG-PCL载体无抑制肿瘤的作用。
此外，图12D和图13D中体重没有明显降低(p＞0.05)。
因此，与单药治疗(Dox/M组或α-m/M组)相比，α-m-Dox/M抗肿瘤效果明显更强，效果优于单药治疗的简单叠加；而MPEG-PCL载体无抗肿瘤作用，只起到了载体作用，可见Dox和α-m能在抗肿瘤中起到协同增效的作用。
实验例6原位植入神经胶质瘤模型中的抗肿瘤和延长生存期实验
本实验例在原位植入神经胶质瘤模型中研究了纳米复合材料的抗肿瘤活性。
为了建立原位植入神经胶质瘤模型，使用10μl Hamilton微注射器(Hamilton，Darmstadt，Germany)将悬浮在5μl PBS中的1×103G1261细胞颅内注射到小鼠右纹状体中。在颅内植入之前，通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后固定在Kopf立体定位仪中。细胞移植后第15天开始，每隔2天用药物处理1次，持续2周，其分组方式和剂量同实验例5。
在原位植入神经胶质瘤模型中，使用生物成像系统观察了不同治疗组的C57BL/6小鼠(图14)。明显的是，α-m与Dox的联合治疗比单独治疗更有效地阻止了肿瘤进展，因为在所有组中，来自肿瘤的荧光强度最弱(图14A)，脑组织的H&E染色也显示出肿瘤体积最小的(图14B)。图14C中的图像为图14B中特定位置的放大图。α-m-Dox/M组的Ki67阳性肿瘤细胞百分比低于10％，而其他组则超过80％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M对α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M对vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M对NS，p＜0.001)(图15)。另外，在接种后第30天，所有接受单独治疗(α-m/M或Dox/M)的小鼠都死亡，但是联合治疗组中的所有小鼠均存活。肿瘤接种后第30天，α-m-Dox/M组小鼠的存活率为70％(图14D)。各组之间的体重没有差异(p＞0.05)(图14E)。
本实验例表明α-m-Dox/M的治疗有效地抑制了神经胶质瘤的原位生长并延长了小鼠的寿命。其在Ki67阳性细胞的抑制能力以及小鼠寿命的延长方面，都显著高于α-m/M与Dox/M的简单叠加，体现了α-m和Dox在抗肿瘤方面的协同增效作用。
实验例7本发明载药纳米复合材料在体内抑制细胞增殖、抑制血管生成和促进凋亡的作用
本实验例实验材料取自实验例5中生理盐水、MPEG-PCL、α-m/M、Dox/M和α-m-Dox/M处理过的C6皮下模型，通过Ki-67抗体的免疫组织化学染色评价体内C6肿瘤细胞的增殖，通过CD31染色来评价肿瘤血管生成，通过Tunel细胞凋亡染色评估体内肿瘤细胞的凋亡。
细胞增殖相关结果如图16A-B所示，不同组的Ki-67阳性细胞平均百分比在NS组为88％，在vehicle组为87.8％，在α-m/M组为77％，在Dox/M组为53.4％，在α-m-Dox/M组为16.8％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M与NS，p＜0.001)。可以看出，α-m-Dox/M中C6增殖的比例显著低于其他组。
该结果表明，α-m-Dox/M的联合治疗可以有效抑制C6细胞的增殖。
血管生成相关结果如图16A和16C所示，其他组的血管数量至少是α-m-Dox/M组的5倍，这意味着联合治疗对抗血管生成具有显著作用(α-m-Dox/M vs.Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M与NS，p＜0.001)。
该结果表明，α-m-Dox/M的联合治疗可以有效抑制血管生成，其效果大大超出了单独使用Dox/M和α-m/M的直接叠加，可见α-m和Dox产生了明显的协同增效作用。
凋亡相关结果如图16A和16D所示，不同组中的细胞凋亡指数分别为：NS(NS)1％，vehicle1.4％，α-m/M 1.5％，Dox/M 2.3％，α-m-Dox 68％(α-m-Dox/M与Dox/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与α-m/M，p＜0.001；α-m-Dox/M与vehicle，p＜0.001；α-m-Dox/M与NS，p＜0.001)。可以清楚地看出，α-m-Dox/ M中细胞凋亡指数的百分比远高于其他组。这些结果与体外结果一致。
因此，α-m-Dox/M的联合治疗可以有效地促进体内细胞凋亡，凋亡指数远高于单独使用α-m/M或Dox/M，可见α-m和Dox产生了明显的协同增效作用。
本实验例的结果进一步表明：α-m-Dox/M对胶质瘤的抑制作用是多方面(抑制细胞增殖、抑制血管生成、促进细胞凋亡)的，且α-m-Dox/M中的α-m/M和Dox/M起到了明显的协同增效作用。
实验例8安全性评价
将实验例6中药物处理过的原位植入胶质瘤模型的心脏，肺，肝，肾和脾的组织制成用于H&E染色的载玻片。所有重要器官均呈现正常的组织形态(图17)。
另外，将从处理过的小鼠收集的血液用于血液常规检查。如图18-19所示，各组参数均在正常范围内，表明各组间无明显毒性。
这些结果表明药物和MPEG-PCL材料均无毒。
综上，本发明的载药纳米复合材料，能通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成，有效治疗胶质瘤，并且α-m-Dox/M中的α-m/M和Dox/M起到了明显的协同增效作用；本发明的载药纳米复合材料还具有良好的安全性。将本发明的复合物用于制备治疗胶质瘤的药物，前景十分良好。
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