阅读说明：本技术 一种脱细胞脐带补片及其制备方法和应用 (Acellular umbilical cord patch and preparation method and application thereof ) 是由 赵金忠 王立人 康育豪 鄢和新 朱雪晶 刘博武 蒋佳 于 2021-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脱细胞脐带补片及其制备方法和应用。本发明的制备方法以人脐带组织制作新型脱细胞细胞外基质补片,对人脐带组织进行脱细胞处理,再经冷冻干燥成型后制备了具有三维多孔海绵样支架的脱细胞脐带补片。本发明的脱细胞脐带补片保留了一定的机械强度和细胞外基质成分,实现完全脱细胞和保留相对完整的胶原纤维结构；脱细胞脐带补片能够避免疾病的传播,同时在脱去细胞后,残留的细胞外基质结构仍富含大量生长因子,能够有效募集周围细胞定植分化。本发明的脱细胞脐带补片呈三维多孔网状结构,孔隙分布较均匀,材料具有一定的机械强度,适合作为促进慢性巨大肩袖损伤修复的新型组织工程材料。(The invention discloses a decellularized umbilical cord patch and a preparation method and application thereof. The preparation method of the invention prepares the novel acellular extracellular matrix patch by using human umbilical cord tissue, carries out acellular treatment on the human umbilical cord tissue, and prepares the acellular umbilical cord patch with the three-dimensional porous sponge-like scaffold after freeze drying and molding. The decellularized umbilical cord patch disclosed by the invention reserves certain mechanical strength and extracellular matrix components, realizes complete decellularization and reserves a relatively complete collagen fiber structure; the acellular umbilical cord patch can avoid the spread of diseases, and meanwhile, after the cells are removed, the residual extracellular matrix structure is still rich in a large number of growth factors, so that the peripheral cells can be effectively recruited for colonization and differentiation. The acellular umbilical cord patch disclosed by the invention is of a three-dimensional porous net structure, the pores are uniformly distributed, and the material has certain mechanical strength and is suitable for serving as a novel tissue engineering material for promoting the repair of chronic huge rotator cuff injury.)

一种脱细胞脐带补片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程材料领域，尤其涉及种脱细胞脐带补片及其制备方法和应用。

背景技术

肩袖撕裂是最常见的中老年患者肩关节疼痛的最常见病因之一。肩袖撕裂后，一旦没有及时进行手术干预，肩袖的裂口会不断扩大，导致腱-骨交界面被破坏，肌腱组织退变消失和肌肉组织脂肪化。肩袖撕裂的范围超过3cm以上的占所有肩袖损伤的20％及术后再次撕裂病例的80％，称为慢性巨大肩袖损伤。慢性巨大肩袖损伤会导致患者出现严重的肩关节功能障碍，如不能内旋、上抬和后举手臂。而慢性巨大肩袖损伤的手术修复效果差，远期预后结果具有不可预测性，因此利用补片进行损伤部位的修复具有比较可靠的前景。

肩袖补片主要放置于大面积肩袖损伤的部位，起到恢复肩袖的力学传导作用作用。高分子不可降解材料构建的肩袖补片力学性能良好，在初期有着良好的力学性能，但随着时间的延长，不可降解材料会逐渐产生蠕变，导致修复失效。可降解肩袖补片可以在降解的同时发挥募集细胞的作用，促进细胞增殖、组织再生及腱-骨界面修复，从而达到促进损伤肩袖再生的功能。

脐带组织的免疫性低，富含大量的细胞因子，该类补片拥有天然的细胞外基质结构，能为募集的细胞提供合适的生长结构，并诱导细胞定向分化，但其力学性能较差，而且存在着疾病传播的风险。

发明内容

本发明的目的是针对现脐带组织类补片的不足，提供一种脱细胞脐带补片及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种脱细胞脐带补片的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将经过前处理的脐带片段浸入TBS缓冲液中，置于脱色摇床上室温震荡12-24h；弃去所述TBS缓冲液，然后加入1％Triton X-100高渗溶液，置于脱色摇床上室温震荡12-24h；然后弃去所述高渗溶液，加入含0.03％SDS的TBS缓冲液，置于脱色摇床上室温继续震荡12-24h；

步骤二，弃去所述含0.03％SDS的TBS缓冲液，采用TBS缓冲液冲洗所述脐带片段，室温摇床10-15分钟，重复3-5次，再加入新的TBS缓冲液，置于脱色摇床上室温继续震荡12-24h；弃去所述TBS缓冲液，加入双蒸水冲洗所述脐带片段，室温摇床10-15分钟，重复3-5次，收集清洗过的脐带片段；

步骤三，将清洗过的所述脐带片段置于-20℃低温冰箱保存；采用冷冻干燥机，先预冷30min后，将冻存的所述脐带片段抽真空冻干12-24h；包装密封，即得所述脱细胞脐带补片。

进一步地，所述制备方法还包括质检步骤：

将步骤二得到的所述脐带片段，即脱细胞细胞外基质补片材料进行细胞核的荧光染色，在荧光显微镜下确认是否没有残留的细胞核；

将检测后没有残留细胞核的脱细胞细胞外基质补片材料切成40～50μm的薄片，于所述薄片的表面喷金处理，然后扫描电镜下观察，观察所述薄片的胶原结构是否破坏，若无破坏，则证明成功制备了具有三维多孔海绵样支架的所述脱细胞脐带补片。

进一步地，步骤一中，所述前处理具体步骤为：取新鲜脐带迅速置于无菌离心管中并转移到无菌操作台，使用含1％双抗的1xPBS缓冲液清洗至表面无明显血污；使用手术刀将清洗后的脐带切成长度为4-6cm的小段，沿长轴剖开脐带，小心剔除2根脐动脉和1根脐静脉；将小段脐带展开成片状，再用所述1xPBS缓冲液清洗残留血污，得到脐带片段。

进一步地，所述TBS缓冲液为0.01mol/LTris-HCl，pH＝8.0缓冲液。

进一步地，密封包装的所述脱细胞脐带补片保存于0-4℃的冰箱内，辐照灭菌。

进一步优选地，所述辐照灭菌的辐照条件为25k Gray。

本发明的第二方面是提供一种上述制备方法制备的脱细胞脐带补片。

进一步地，使用前需要在所述脱细胞脐带补片的表面均匀地打若干个孔洞。

进一步优选地，使用前需要在所述脱细胞脐带补片的表面匀地打9个直径为0.5mm的圆形孔洞。

本发明的第三方面是提供上述脱细胞脐带补片在慢性巨大肩袖损伤修复中的应用。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的以人脐带组织制作新型脱细胞细胞外基质补片的方法，对人脐带组织进行脱细胞处理，再经冷冻干燥成型后制备了具有三维多孔海绵样支架的脱细胞脐带补片。

本发明的脱细胞脐带补片保留了一定的机械强度和细胞外基质成分，实现完全脱细胞和保留相对完整的胶原纤维结构；脱细胞脐带补片能够避免疾病的传播，同时在脱去细胞后，残留的细胞外基质结构仍富含大量生长因子，能够有效募集周围细胞定植分化。

本发明的脱细胞脐带补片呈三维多孔网状结构，孔隙分布较均匀，材料具有一定的机械强度，适合作为促进慢性巨大肩袖损伤修复的新型组织工程材料。

附图说明

图1为本发明脱细胞脐带补片冠状面的电镜图；

图2为本发明脱细胞脐带补片羊膜面的电镜图；

图3为本发明脱细胞脐带补片华通胶面的电镜图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种脱细胞脐带补片的制备，包括如下步骤：

步骤一，取新鲜脐带迅速置于无菌离心管中并转移到无菌操作台，使用含1％双抗的1xPBS缓冲液清洗至表面无明显血污；使用手术刀将清洗后的脐带切成长度为4-6cm的小段，沿长轴剖开脐带，小心剔除2根脐动脉和1根脐静脉；将小段脐带展开成片状，再用上述1xPBS缓冲液清洗残留血污，得到脐带片段；

将经过前处理的脐带片段浸入TBS缓冲液中，置于脱色摇床上室温震荡12-24h；弃去上述TBS缓冲液(0.01mol/LTris-HCl，pH＝8.0)，然后加入1％Triton X-100高渗溶液，置于脱色摇床上室温震荡24h；然后弃去上述高渗溶液，加入含0.03％SDS的TBS缓冲液，置于脱色摇床上室温继续震荡24h；

步骤二，弃去上述含0.03％SDS的TBS缓冲液，15cm大皿中加入50ml TBS缓冲液冲洗上述脐带片段，室温摇床15分钟，重复3次，再加入新的50mL TBS缓冲液，置于脱色摇床上室温继续震荡12-24h；弃去上述TBS缓冲液，15cm大皿中加入50ml双蒸水冲洗上述脐带片段，室温摇床15分钟，重复3次，收集清洗过的脐带片段；

步骤三，将清洗过的上述脐带片段转移在100mm培养皿内，置于-20℃低温冰箱保存(保存时间不宜超过一周)；采用冷冻干燥机，先预冷30min后，将上述冻存的脐带片段连同100mm培养皿，放于冻干机内的托盘上，抽真空，置于其内部冻干24h；包装密封，即得所需脱细胞脐带补片。

密封包装的上述脱细胞脐带补片需要保存于0-4℃的冰箱内，辐照灭菌，上述辐照灭菌的辐照条件为25k Gray。

本实施例还提供了脱细胞脐带补片的质检方法，包括如下步骤：

将上述步骤二得到的上述脐带片段，即脱细胞细胞外基质补片材料进行细胞核的荧光染色，在荧光显微镜下确认是否没有残留的细胞核；

将检测后没有残留细胞核的脱细胞细胞外基质补片材料切成40～50μm的薄片，于上述薄片的表面喷金处理，然后扫描电镜下观察，观察上述薄片的胶原结构是否破坏，若无破坏，则证明成功制备了具有三维多孔海绵样支架的上述脱细胞脐带补片(如图1-3所示)。

应用例

上述脱细胞脐带补片在慢性巨大肩袖损伤修复中的应用，包括如下步骤：

(1)在脱细胞脐带补片表面均匀地打9个直径为0.5mm的圆形孔洞，方便后续肱骨头上髓质激发的骨髓间充质细胞募集到补片上，促进肩袖再生；

(2)患者取沙滩椅位，全麻；术前将肩关节骨性标志用记号笔画出，常规手术消毒，铺巾；

(3)利用穿刺锥通过外侧入路进入肩峰下间隙，建立工作通道，关节镜沿肩峰后侧缘向前进入肩峰下间隙，钝性分离肩峰下间隙内的粘连带；用刨刀和射频等等离子刀清楚肩峰下间隙增生充血的滑膜和粘连带；

(4)在肱骨头上进行髓质激发手术，促进骨髓间充质细胞募集至脱细胞脐带补片；

(5)根据损伤大小选择合适的脱细胞细胞外基质补片；抓钳抓住肩袖组织的边缘，充分进行肩袖组织松解，确保肩袖组织完全覆盖肌腱止点；按照从前向后的方式置入内排锚钉，整理缝线尾端抓出体外，取两枚内排锚钉的缝线，取各一根尾穿过外排的固定孔；同理将剩余两根尾线穿过另一枚外排锚钉内；于肱骨大结节肩袖止点外侧缘附近各打一孔置入锚钉，通过抓钳将脱细胞脐带补片置于肩袖外侧，拉紧缝线，交叉形成网状，将肌腱端压在足印区并将补片与肩袖组织紧密固定；退出关节镜，缝合伤口。

上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。