一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片及制作方法
阅读说明：本技术 一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片及制作方法 (Microfluidic chip for adsorbing nucleic acid based on chitosan and manufacturing method ) 是由 弥胜利 陈百良 徐菲 黄嘉骏 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片及制作方法,该芯片包括流道层,流道层中设置有核酸提取流道,核酸提取流道为表面修饰有一层壳聚糖的PMMA流道,当向PMMA流道注入核酸溶液时,PMMA流道表面的壳聚糖在核酸溶液的第一液体环境下吸附核酸,当向PMMA流道注入洗脱液时,PMMA表面的壳聚糖在洗脱液的第二液体环境下解吸核酸,洗脱得到核酸,从而实现核酸的提取。该微流控芯片可以通过流道直接实现核酸的抓取和洗脱,不需要嵌入磁珠也不要设计微阵列,这大大降低了芯片的制造成本以及流体的控制难度,其结构简单,控制方便,能够实现快速的核酸提取,并且不会引入会对后续扩增产生影响的化学物质。(A micro-fluidic chip for adsorbing nucleic acid based on chitosan and a manufacturing method thereof are disclosed, the chip comprises a flow channel layer, a nucleic acid extraction flow channel is arranged in the flow channel layer, the nucleic acid extraction flow channel is a PMMA flow channel with a layer of chitosan modified on the surface, when nucleic acid solution is injected into the PMMA flow channel, the chitosan on the surface of the PMMA flow channel adsorbs the nucleic acid in a first liquid environment of the nucleic acid solution, when eluent is injected into the PMMA flow channel, the chitosan on the surface of the PMMA flow channel desorbs the nucleic acid in a second liquid environment of the eluent, and the nucleic acid is eluted to obtain the nucleic acid, so that the extraction of the nucleic acid is realized. This micro-fluidic chip can directly realize snatching and eluting of nucleic acid through the runner, need not imbed the magnetic bead and also need not design the microarray, this greatly reduced the manufacturing cost of chip and fluidic control degree of difficulty, its simple structure, control is convenient, can realize quick nucleic acid and draw to can not introduce the chemical substance that can produce the influence to follow-up amplification.)
技术领域
本发明涉及核酸提取装置，特别是涉及一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片及制备方法。
背景技术
快速可靠的病原体检测对食品安全、水质、临床分析和生物恐怖主义防御等领域有着至关重要的意义。传统微生物学方法需要进行细胞或细菌的培养，耗时较长且效率很低，并且仅适用于可以在实验室条件下生长的生物体。因此，涉及实时检测的聚合酶链反应(PCR)技术是一种现在应用更广泛的技术。但是，许多获取的样本(例如全血、尿液等)中核酸的浓度较低，并且含有很多会对扩增产生干扰的杂质(如蛋白质、无机盐等)，直接扩增无法得到理想的结果。因此在进行扩增之前需要对大多数样本进行预处理和核酸提取。常用的核酸提取试剂盒往往依靠实验室条件，操作流程较为复杂，不适合用于现场诊断，同时气密性差，容易产生交叉污染等问题。
微流控芯片作为一种新型的研究工具，其不仅在实验室内的生化分析中起到至关重要的作用，还被开发到可以用于各种场景下的现场检测。相比于传统的实验室检测方法，基于微流控芯片的检测所用样本量小，需要的人工操作较少，因而大大减少了检测时长和过程中的样本消耗。
需要说明的是，在上述
背景技术
部分公开的信息仅用于对本申请的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述背景技术的缺陷，提供一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片及制作方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片，包括流道层，所述流道层中设置有核酸提取流道，所述核酸提取流道为表面修饰有一层壳聚糖的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料的PMMA流道，当向所述PMMA流道注入核酸溶液时，所述PMMA流道表面的壳聚糖在所述核酸溶液的第一液体环境下吸附核酸，当向所述PMMA流道注入洗脱液时，所述PMMA表面的壳聚糖在所述洗脱液的第二液体环境下解吸核酸，洗脱得到核酸，从而实现核酸的提取。
进一步地：
所述壳聚糖是通过EDC-NHS交联反应修饰到紫外照射的所述PMMA流道上。
是通过将经过紫外照射的PMMA流道浸泡在以MES缓冲液为溶剂的EDC-NHS和壳聚糖混合溶液中，EDC与PMMA表面的羧基反应产生中间物酯，由NHS保持其稳定的所述中间物与壳聚糖的氨基反应从而将壳聚糖固定在流道表面。
所述微流控芯片为指压式驱动结构，所述指压式驱动结构包括进液口、指压腔室、连通所述指压腔室和大气的通气口、带有堰结构的阀门、液体存储腔室、所述核酸提取流道以及出液口，其中所述进液口、所述阀门、所述液体存储腔室依次连接并设置有三组，每组分别用于注入核酸溶液、洗涤液和洗脱液，且每组均连接到所述核酸提取流道的入口，所述核酸提取流道的出口连接所述出液口，每组中的所述指压腔室与所述阀门相连，利用手指按压所述指压腔室造成的气压差变化控制液体的流动和所述阀门的开合，所述液体存储腔室用于暂时存储从所述进液口注入的液体。
所述微流控芯片为从上至下依次包括盖板、气道层、薄膜层以及所述流道层的四层结构，所述指压腔室形成在所述气道层上，所述阀门形成在所述气道层、所述薄膜层和所述流道层上，所述薄膜层在气压差的作用下变形以实现阀门的开启或关闭。
所述盖板、所述气道层、所述薄膜层均采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性材料。
所述四层之间使用螺栓紧固密封。
一种所述的基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片的制作方法，包括如下步骤：
成型具有PMMA流道的流道层；
用紫外线照射所述流道层；
将所述PMMA流道浸泡在以MES缓冲液为溶剂的EDC-NHS和壳聚糖混合溶液中，EDC与PMMA表面的羧基反应产生中间物酯，所述中间物由NHS保持稳定，所述中间物与壳聚糖的氨基反应从而将壳聚糖固定在流道表面。
还包括如下步骤：
成型PDMS材料的盖板、气道层和薄膜层，经过烘烤、氧等离子体、孵育和密封处理之后，与所述流道层通过螺栓紧固。
一种使用所述的基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片的核酸提取方法。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种用于核酸提取的微流控芯片，其流道层中设置有核酸提取流道，所述核酸提取流道为PMMA材料，表面修饰有一层壳聚糖，当向PMMA流道注入核酸溶液时，PMMA流道表面的壳聚糖在所述核酸溶液的第一液体环境下吸附核酸，当向所述PMMA流道注入洗脱液时，所述PMMA表面的壳聚糖在所述洗脱液的第二液体环境下解吸核酸，洗脱得到核酸，从而实现核酸的提取。其提取原理利用了壳聚糖在酸性环境下会吸附核酸的机理。本发明的微流控芯片可以通过流道直接实现核酸的抓取和洗脱，不需要嵌入磁珠也不要设计微阵列，这大大降低了芯片的制造成本以及流体的控制难度，其结构简单，控制方便，能够实现快速的核酸提取，其加工成本较低，适合于大量生产，并且既不需要引入磁珠也不会引入会影响后续扩增的化学物质。该芯片成本低于现有的商业用试剂盒并拥有与之类似的提取效果，可以广泛应用于核酸分子快速诊断领域。
附图说明
图1为本发明一种实施例的基于壳聚糖吸附提取核酸的微流控芯片的结构示意图；
图2为图1中整体流道的示意图；
图3为图1所示的微流控芯片的透视示意图；
图4为本发明一种实施例的PMMA修饰壳聚糖的流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式做详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。另外，连接既可以是用于固定作用也可以是用于耦合或连通作用。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多该特征。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
参阅图1至图3，本发明实施例提供一种基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片，包括流道层4，所述流道层4中设置有核酸提取流道10，流道10为表面修饰有一层壳聚糖的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料的PMMA流道，当向流道10注入核酸溶液时，流道10表面的壳聚糖在所述核酸溶液的第一液体环境下吸附核酸，当向流道10注入洗脱液时，流道10表面的壳聚糖在所述洗脱液的第二液体环境下解吸核酸，洗脱得到核酸，从而实现核酸的提取。
本发明芯片中将具有能够提取核酸的官能团的壳聚糖整合在芯片的流道上，直接利用流道来提取核酸，不需要嵌入磁珠也不要设计具有微阵列的核酸提取腔室，这大大降低了芯片的制造成本以及流体的控制难度。该芯片提取核酸的机制是基于壳聚糖在不同pH值和盐离子浓度的环境下对核酸的吸附性差异，在整个提取过程中，只需适当改变液体环境中pH值的大小和盐离子的浓度，就可以完成核酸的吸附和解吸，并且洗脱液中不含有乙醇等可能会影响后续扩增步骤的物质。
在优选的实施例中，所述壳聚糖是通过EDC-NHS交联反应修饰到紫外照射的所述PMMA流道上。
在优选的实施例中，是通过将经过紫外照射的PMMA流道浸泡在以MES缓冲液为溶剂的EDC-NHS和壳聚糖混合溶液中，EDC与PMMA表面的羧基反应产生中间物酯，由NHS保持其稳定的所述中间物与壳聚糖的氨基反应从而将壳聚糖固定在流道表面。
参阅图1至图3，在优选的实施例中，所述微流控芯片为指压式驱动结构，所述指压式驱动结构包括进液口5、指压腔室7、连通所述指压腔室7和大气的通气口8、带有堰结构的阀门6、液体存储腔室9、所述核酸提取流道10以及出液口11，其中所述进液口5、所述阀门6、所述液体存储腔室9依次连接并设置有三组，每组分别用于注入核酸溶液、洗涤液和洗脱液，且每组均连接到所述核酸提取流道10的入口，所述核酸提取流道10的出口连接所述出液口11，每组中的所述指压腔室7与所述阀门6相连，利用手指按压所述指压腔室7造成的气压差变化控制液体的流动和所述阀门6的开合，所述液体存储腔室9用于暂时存储从所述进液口5注入的液体。通过采用指压式驱动结构，仅依靠手指按压作为驱动力来对微流体进行控制，而不需要任何外源性的支持设备，从而既方便使用，也节省了相关设备与耗材。
参阅图1和图3，在优选的实施例中，所述微流控芯片为从上至下依次包括盖板1、气道层2、薄膜层3以及所述流道层4的四层结构，所述指压腔室7形成在所述气道层2上，所述阀门6形成在所述气道层2、所述薄膜层3和所述流道层4上，所述薄膜层在气压差的作用下变形以实现阀门6的开启或关闭。阀门6的具体实现方式可采用(但不限于)在先申请CN112195099A公开的结构。
在优选的实施例中，所述盖板1、所述气道层2、所述薄膜层3均采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性材料。
在优选的实施例中，所述四层之间使用螺栓紧固密封。
本发明实施例还提供一种所述的基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片的制作方法，包括如下步骤：
成型具有PMMA流道的流道层；
用紫外线照射所述流道层；
将所述PMMA流道浸泡在以MES缓冲液为溶剂的EDC-NHS和壳聚糖混合溶液中，EDC与PMMA表面的羧基反应产生中间物酯，所述中间物由NHS保持稳定，所述中间物与壳聚糖的氨基反应从而将壳聚糖固定在流道表面。
在优选的实施例中，所述方法还包括如下步骤：
成型PDMS材料的盖板、气道层和薄膜层，经过烘烤、氧等离子体、孵育和密封处理之后，与所述流道层通过螺栓紧固。
本发明实施例还提供一种使用前述任一实施例的基于壳聚糖吸附核酸的微流控芯片的核酸提取方法。
在一些实施例中，一种以手指按压作为驱动力的用于核酸提取的微流控芯片，芯片整体上分为盖板、气道层、薄膜层和流道层，其结构包括进液口、指压腔室、带有堰结构的阀门模块、液体存储腔室、用于核酸提取的流道和废液收集管道等。指压腔室利用手指按压造成的气压差，从而控制液体的流动和阀门的开合；液体存储腔室用于暂时存储从进液口注入的液体，便于控制液体在芯片中的流动；用于核酸提取的流道采用修饰了壳聚糖的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料，其提取原理利用壳聚糖在酸性环境下会吸附核酸的机理。盖板、气道层、薄膜层三层结构均是使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性材料。四层之间使用螺栓紧固密封。
在一些实施例中，芯片上设有三个进液口，分别对应待提取的核酸原液、洗涤液、洗脱液，将三种液体注入后，会流入液体存储腔室。核酸提取流道具有较大的表面积，且PMMA的表面具有一层壳聚糖，当液体存储腔室的液体进入流道并充分混合后，核酸将会与表面的壳聚糖结合，从而达到核酸提取的效果。
在一些实施例中，当指压腔室未被按下时，注入的液体会流入液体存储腔室。当指压腔室被按下时，左侧的阀门关闭，右侧的阀门开启，存储的液体会流入下个流道。液体无法直接通过这个阀门，当指压腔室按下或松开时，产生的气压差会调整两个阀门的开合状态。
在一些实施例中，一种用于核酸提取的微流控芯片，所述核酸提取的步骤包括：
(1)将待提取的核酸原液、洗涤液、洗脱液分别从三个进液口注入；
(2)按下核酸原液腔室旁的指压腔室，将核酸原液注入所述核酸提取流道，等待一定时间(5-10分钟)使液体和流道充分接触，完成核酸的抓取；
(3)按下洗涤液腔室旁的指压腔室，将洗涤液注入所述核酸提取流道，等待一定时间后继续按压，使洗涤液从核酸提取流道流入出液口，以洗去残存的核酸原液；
(4)按下洗脱液腔室旁的指压腔室，将洗脱液注入所述核酸提取流道，等待一定时间(5-10分钟)后继续按压，使洗脱液从核酸提取流道流入出液口，以获取洗脱得到的核酸；
以下进一步结合附图描述本发明具体实施例。
一种指压便携驱动的核酸提取纯化以及实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片，如图1和图3所示为该核酸检测芯片的结构示意图，芯片包括盖板(1)、气道层(2)、薄膜层(3)以及流道层(4)。
如图2所示，整个芯片的具体结构包含进液口(5)、带有堰结构的阀门(6)、指压腔室(7)、连通指压腔室和大气的通气口(8)、液体存储腔室(9)、用于核酸提取的流道(10)、出液口(11)。
如图4所示，利用EDC-NHS交联反应将壳聚糖修饰到紫外照射的PMMA流道上。
该芯片由三个PDMS层和一个PMMA层制成，包括盖板、气道层、薄膜层以及流道层。PDMS层的模具是通过光刻技术制造的。随后，将SU-8 2100旋涂以获得300μm的厚度。在第一步中，旋涂光致抗蚀剂，然后将其暴露于紫外光下，后经过显影液清洗，获得相应的结构。通过将PDMS前体与固化剂按10：1的比例混合，并在80℃下固化2小时获得气道层。之后，储液室形成直径为4.0mm的通孔。覆盖层是通过将PDMS和固化剂的比例为10：1的混合物旋涂到裸露的硅片上而获得的，并在150℃下固化5分钟。然后，使用平针(19G)在入口处打孔。流道层用PMMA加工制作，加工完成后经过紫外照射30分钟，之后浸泡在以MES缓冲液为溶剂的EDC-NHS和壳聚糖混合溶液中，EDC与PMMA表面的羧基反应产生中间物酯，NHS会使其保持稳定，该中间物会与壳聚糖的氨基反应并将壳聚糖固定在流道表面。随后，PDMS在80℃下烘烤2h。用氧等离子体处理三层120秒，并在65℃下孵育10分钟以密封这三层，之后与PMMA层通过螺栓紧固。
核酸检测步骤具体包括：
(1)使用注射枪向从进液口(5)灌注待提取的核酸原液40μL，按压指压腔室(7)使之进入液体存储腔室(9)和用于核酸提取的流道(10)，等待5-10分钟供核酸与流道充分结合；
(2)使用注射枪向从进液口(5)灌注洗涤液40μL，按压指压腔室(7)使之进入液体存储腔室(9)和用于核酸提取的流道(10)，重复进行三次；
(3)使用注射枪向从进液口(5)灌注洗脱液40μL，按压指压腔室(7)使之进入液体存储腔室(9)和用于核酸提取的流道(10)，等待5-10分钟供洗脱液与流道充分接触，然后从出液口(11)获得洗脱液，进行后续的检测或扩增。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。
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