具体实施方式

以下，对本发明所涉及的内容进行详细说明。以下所记载的构成要件的说明是基于本发明所涉及的代表性实施方式来进行的，但本发明并不限定于这种实施方式。

在本发明中，使用“～”来表示的数值范围是指将“～”的前后所记载的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。在本发明中阶段性记载的数值范围内，在某一数值范围内记载的上限值或下限值可以替换为其他阶段性记载的数值范围的上限值或下限值。并且，在本发明中记载的数值范围内，在某一数值范围内记载的上限值或下限值可以替换为实施例中所示的值。

在本发明中，2个以上的优选的方式的组合为更优选的方式。

在本发明中，关于组合物中的各成分的量，在组合物中存在多个相当于各成分的物质的情况下，只要无特别说明，则是指在组合物中存在的该多个物质的总量。

在本发明中，“肽”是指2个以上的氨基酸通过肽键键合而形成的化合物的统称。

在本发明中，“多肽”是指10个以上的氨基酸进行肽键合而形成的化合物的统称。在氨基酸为10个以上的情况下，“肽”和“多肽”能够以相同的含义使用。

在本发明中，“蛋白质”是指分子量为5000以上的多肽。在分子量为5000以上的情况下，“蛋白质”和“多肽”能够以相同的含义使用。

在本发明中，蛋白质的重均分子量(Mw)及数均分子量(Mn)以Da(道尔顿)为单位表示。

并且，关于本发明中的重均分子量(Mw)及数均分子量(Mn)，只要无特别说明，则为通过使用了Shodex Asahipak GS-620 7G-p内径7.5mm长度50cm(SHOWA DENKO K.K.制造)的柱的凝胶渗透层析(有时也称为“GPC”或“凝胶渗透色谱”。)分析装置(HLC-8220GPC，TOSOH CORPORATION制造)，利用溶剂：100mM磷酸缓冲液(pH＝6.9)、示差折射仪进行检测，并作为标准物质而使用普鲁兰进行换算而得的分子量。

在本发明中，“粘性”是指在与将珍珠养殖用材料进行插核时的操作性的关系中使用的“粘结性”或“粘附性”。

在本发明中，“珍珠的珠层”是指珍珠层的厚度，珍珠层可以是单层，也可以是多层。珍珠层的厚度可以根据珍珠的截面的厚度来测定。珍珠层的厚度能够通过从所收获的珍珠的质量减去养殖前的珍珠核的质量而得的值来确认，该值越大，则表示珍珠层越厚。并且，珍珠层越厚，则可以说珍珠的珠层越优异。

在本发明中，“白度”可由从事于珍珠养殖的专家通过肉眼来判断并求出，但是也能够使用测定设备来求出。

在本发明中，“优质的珍珠”表示至少满足上述“珍珠层厚”的珍珠。

在本发明中，“斑点”是指相较于珍珠外表面的整体颜色呈蓝色、灰色或棕色的部位。在本发明中，“划痕”是指形成于珍珠的表面上的突起及凹痕。

(珍珠养殖用材料)

本发明所涉及的珍珠养殖用材料包含选自由珍珠核及外套膜组成的组中的至少1个，选自由上述珍珠核及外套膜组成的组中的至少1个含有内毒素量为10EU/g以下的蛋白质(以下，也称为“低内毒素蛋白质”。)。

在使用含有低内毒素蛋白质的珍珠核和/或包含外套膜的珍珠养殖用材料进行珍珠养殖的情况下，能够提高珍珠的珠层厚的优质的珍珠的得率。并且，能够提高白度高的优质的珍珠的得率。

珍珠养殖为如下方法：通常，在能够生产珍珠的母贝体内，将外套膜的组织片(外套膜片)及珍珠核外科插入到母贝的繁殖巢内，上述组织片覆盖核的周围而形成“珍珠袋”，从形成珍珠袋的上述外套膜的上皮细胞分泌分泌物，由此在珍珠核的表面形成珍珠层来制作珍珠。

尤其，插核是将作为异物的其他种类贝壳切削成球形而得的珍珠核插入到贝壳体内的手术，对于母贝而言是巨大的负担。由于该插核技术的优劣左右插核之后的贝的死亡率、所获得的珍珠有无斑点及划痕等珍珠的品质，因此插核可以说是重要的工艺。

珍珠的斑点及划痕是由珍珠核与珍珠层之间的有机物引起的，作为斑点及划痕的原因据说是，例如，在珍珠袋中内含血细胞、繁殖细胞等具有色素的组织片、以及发炎的上皮细胞分泌的有机物质等。(Kouseisha-kouseikaku Corporation出版，淡路雅彦·古丸明·松原大辅编辑“珍珠研究的最前沿对高品质珍珠生产的展望”p33)

为了改善贝的存活率及优质的珍珠的比率，提出了用能够期待改善贝的活体与作为异物的珍珠核之间的活体相容性的物质(例如，肽、纤连蛋白、壳聚糖、聚乳酸)包覆(涂覆)珍珠核(例如，参考专利文献2)、为了对认为是炎症反应的原因之一的细菌进行杀菌，在上述涂覆中添加抗菌素的技术(例如，参考专利文献1)等。虽然通过上述技术珍珠品质得到改进，但是其等级不足，未得到广泛使用。

发明人等为了进一步提高珍珠核与贝的活体的相容性，着眼于从细菌中释放而在杀菌之后也仍残留并且进入活体内时会成为异物反应的起因的内毒素。内毒素为构成革兰氏阴性菌的细胞壁的脂多糖，已知通过极少量进入哺乳类的血液中，也会引起发热等各种活体反应，但是关于对贝等软体动物的影响，没有明确的报告。

发明人等将被尽可能减少了内毒素的蛋白质包覆(涂覆)的核和/或外套膜用于插核，其结果，发现了珍珠的珠层厚，价值更高的优质的珍珠的得率的提高。并且，发现了珍珠的斑点及划痕得到减少，除此之外，容易提高白度更高的优质的珍珠的得率。

虽然可获得上述效果的理由尚不明确，但是作为假设推测如下。

据推测，若将被减少了内毒素的蛋白质包覆(涂覆)的核和/或外套膜用于插核，则可提高母贝与珍珠核的相容性，由此(1)早期形成珍珠袋，早期开始珍珠层的形成，因此卷变厚，珍珠品质得到提高。(2)据推测，在免疫反应受到抑制而形成的珍珠袋中，从外套膜的组织片分泌的碳酸钙等用于形成珍珠层的分泌物的分泌效率得到提高，因此卷变厚，珍珠品质得到提高。

除此之外，据推测，通过提高母贝与珍珠核的相容性而早期形成珍珠袋，减少繁殖细胞被卷入珍珠层中的概率，从而容易减少斑点及划痕。并且，据推测，在免疫反应受到抑制而形成的珍珠袋中，不易产生黑色素等有机物质且容易减少斑点。

以下，对构成本发明所涉及的珍珠养殖用材料的各结构进行说明。

＜＜蛋白质＞＞

本发明所涉及的珍珠养殖用材料包含珍珠核及外套膜，选自由珍珠核及外套膜组成的组中的至少1个含有内毒素量为10EU/g以下的蛋白质(低内毒素蛋白质)。

在使用选自由含有低内毒素蛋白质的珍珠核及外套膜组成的组中的至少1个来进行珍珠养殖的情况下，能够提高珍珠层厚的优质的珍珠的得率。

从进一步提高珍珠层厚的优质的珍珠的得率的观点出发，作为内毒素量，优选为8EU/g以下，更优选为6EU/g以下，进一步优选为2.5EU/g以下，尤其优选实质上不含内毒素。

本发明所涉及的珍珠养殖用材料中的珍珠核及外套膜还可以含有内毒素量超过10EU/g的蛋白质。

在本说明书中，“EU/g”表示内毒素的定量单位，是指根据美国药典规定的标准内毒素的生物活性确定的值，并表示内毒素为1FU/ml≈0.1ng/ml。

在本发明中，关于内毒素量，能够通过使用了溶解试剂(鲎试剂)(产品名称；“PYROGENT^TM-5000”，LONZA公司制造)的动力学比浊法进行测定来定量。

从进一步提高优质的珍珠的得率的观点出发，本发明所涉及的珍珠养殖用材料优选包含含有内毒素量为10EU/g以下的蛋白质的珍珠核。

作为将珍珠核及外套膜中所包含的蛋白质的内毒素量设为10EU/g以下的方法，并无特别限制，例如，可以使用吸附法、超滤等公知的方法来减少及去除作为原料的天然明胶等蛋白质中所包含的内毒素。

并且，低内毒素蛋白质可以是源自基因重组体真核生物的蛋白质。关于低内毒素蛋白质，从可在没有内毒素的环境下获得蛋白质的观点出发，与从有可能包含内毒素的天然的明胶等蛋白质中纯化的低内毒素蛋白质相比，优选为源自基因重组体真核生物的蛋白质。

作为基因重组体真核生物的宿主，可举出酵母菌、蚕、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、昆虫细胞，但是从相对容易获取高产菌株及构建大量生产系统的观点出发，优选为酵母菌。

在珍珠核及外套膜中，珍珠核及外套膜的表面的至少一部分被低内毒素蛋白质包覆即可。

从进一步提高优质的珍珠的得率的观点出发，作为相对于珍珠核或外套膜的总表面积的低内毒素蛋白质的包覆比例(包覆率)，优选为20％以上，更优选为30％以上，进一步优选为40％以上，尤其优选为50％以上，最优选为60％以上，非常优选为65％以上。珍珠核或外套膜的整个表面可以被低内毒素蛋白质包覆。

关于本发明所涉及的珍珠养殖用材料所包含的珍珠核及外套膜，从进一步提高优质的珍珠的得率的观点出发，相对于珍珠核或外套膜的总表面积的蛋白质的包覆量优选为20pg/mm²以上，更优选为50pg/mm²～10000pg/mm²，进一步优选为50pg/mm²～500pg/mm²。

关于珍珠核或外套膜的表面积中的低内毒素蛋白质的包覆量，在溶解及水解珍珠核或外套膜的表面的低内毒素蛋白质之后，利用液相色谱质谱(LC/MS：LiquidChromatography Mass Spectrometry)对通过水解获得的蛋白质中所包含的氨基酸的量进行定量，并根据与通过对未包覆蛋白质的珍珠核或外套膜进行水解处理而获得的氨基酸的差来求出。

更详细而言，能够通过下述方法来求出。

(1)表面蛋白质的洗提

例如，准备10个珍珠核或外套膜，将珍珠核或外套膜浸渍于10mL左右的20℃的水中并静置18小时，从而制备养殖材料样品溶液。

(2)表面蛋白质的水解

利用离心蒸发器对养殖材料样品溶液进行浓缩，加入6mol/L(N)盐酸1mL并使其再次溶解，在110℃下静置22小时。

(3)蛋白质的再次溶解

在将上述6mol/L(N)盐酸通过氮气并使其挥发之后，再进一步加入0.02mol/L(N)稀盐酸0.2mL。

(4)通过液相色谱质谱法(LC/MS)对氨基酸进行定量

使用液相色谱质谱(LC/MS)装置(Waters Corporation制造，UPLC/MS(SQD))，在以下条件下对样品中所包含的氨基酸进行定量，并求出与空白核或外套膜(不含低内毒素蛋白质的珍珠核或外套膜)中的氨基酸量的差。

柱：Imtakt Corporation，Intrade amino acid 75

MS电喷雾(ESI)(正模式)

所定量的氨基酸的种类能够根据蛋白质的种类来适当地选择，在作为低内毒素蛋白质而使用产品名称为cellnest(Fujifilm Corporation制造)的情况下，优选对脯氨酸(Pro)进行定量。

作为在本发明所涉及的珍珠核及外套膜中含有低内毒素蛋白质的方法(以下，也称为“涂覆方法”。)，例如，制备后述珍珠养殖用材料组合物的溶液(以下，也称为“涂覆液”。)，并通过公知的涂覆方法涂覆于珍珠核或外套膜上即可。

作为涂覆方法，并无特别限制，例如，可举出将珍珠核或外套膜浸渍于涂覆液中的方法、向珍珠核或外套膜的表面喷射涂覆液的方法、用含涂覆液的刷子涂覆珍珠核或外套膜的表面的方法等。

上述涂覆液中所包含的低内毒素蛋白质的浓度并无特别限制，例如，相对于涂覆液的总质量，优选为0.0001质量％～1质量％，可更优选为0.0005质量％～0.5质量％。

本发明所涉及的珍珠养殖用材料中所包含的低内毒素蛋白质可以是进行了冷冻干燥的冷冻干燥体。在低内毒素蛋白质为冷冻干燥体的情况下，优选为与后述活化剂一起进行了冷冻干燥的冷冻干燥体。

本发明所涉及的珍珠养殖用基材中所包含的低内毒素蛋白质优选包含胶原蛋白的氨基酸序列的至少一部分，更优选包含胶原蛋白的胶原蛋白域(即为形成三链螺旋的域，以下，也简称为“胶原蛋白域”。)的氨基酸序列。

在上述胶原蛋白域中还包含可以由1个以上的氨基酸分离的后述GXY三联体的重复序列及1个以上的RGD基序。

相对于低内毒素蛋白质的氨基酸序列全长，源自胶原蛋白的氨基酸序列(例如，序列号1的氨基酸序列)的区域所占的区域的比例(总比例)优选为50％以上，更优选为60％以上，进一步优选为70％以上，尤其优选为80％以上，最优选为90％以上，非常优选为95％以上。

作为胶原蛋白的来源，并无特别限制，可以源自任意生物种。也可以是源自2种以上的生物种的胶原蛋白。作为胶原蛋白的来源，例如，可举出鱼(罗非鱼)、牛、猪、人等。

如上所述，胶原蛋白可以是牛皮、猪皮或鱼皮等中所包含的天然胶原蛋白，但是优选不溶于水等溶剂。因此，在提取胶原蛋白的情况下，例如需要使用蛋白质水解酶、基于加热的凝胶化等处理，因此所获得的胶原蛋白的分子量分布广泛。并且，通常，市售的明胶具有数万～数百万的分子量分布，因此，即使用一般的方法提取天然胶原蛋白，多分散度小于20的可能性低。

在本发明所涉及的一实施方式中，低内毒素蛋白质可以使用通过使用尺寸排除色谱法等分级方法，对从源自牛皮、猪皮或鱼皮的天然的胶原蛋白源中提取的胶原蛋白，仅分离纯化在特定的分子量范围内的蛋白质分子来获得的蛋白质。

在本发明所涉及的另一实施方式中，低内毒素蛋白质能够通过由导入了包含后述GXY三联体的重复序列且包含1个以上的RGD基序的蛋白质的基因的重组细胞生产而获得。此时，作为导入低内毒素蛋白质的基因的宿主细胞，能够使用大肠杆菌等细菌的细胞、S.cerevisiae等酵母的细胞、或蚕等昆虫的细胞，但是从减少内毒素量的观点出发，优选为酵母细胞，低内毒素蛋白质更优选为源自基因重组体酵母的蛋白质。

表达载体可以根据宿主和导入的蛋白质的尺寸从公知的载体中选择适合的载体来使用。在由重组细胞生产的情况下，能够获得分子量的均匀性高的蛋白质。

作为胶原蛋白的类型，并无特别限制，可以是任意类型的胶原蛋白。例如，作为胶原蛋白，可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、VIII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、X型胶原蛋白、XI型胶原蛋白、XII型胶原蛋白、XIII型胶原蛋白、XIV型胶原蛋白、XV型胶原蛋白、XVI型胶原蛋白、XVII型胶原蛋白、XVIII型胶原蛋白、XIX型胶原蛋白、XX型胶原蛋白、XXI型胶原蛋白、XXII型胶原蛋白、XXIII型胶原蛋白、XXIV型胶原蛋白、XXV型胶原蛋白、XXVI型胶原蛋白、XXVII型胶原蛋白或XXVIII型胶原蛋白等。

上述胶原蛋白的氨基酸序列可以是构成该胶原蛋白的多种多肽中的任意亚型氨基酸序列。例如，在I型胶原蛋白的情况下，可以是I型胶原蛋白α1链的氨基酸序列或I型胶原蛋白α2链的氨基酸序列，在V型胶原蛋白的情况下，可以是V型胶原蛋白α1链的氨基酸序列、V型胶原蛋白α2链的氨基酸序列或V型胶原蛋白α3链的氨基酸序列。

其中，若为天然胶原蛋白，则从获取性的观点出发，若为基因重组胶原蛋白，则从制造实绩的观点出发，胶原蛋白的氨基酸序列优选为I型胶原蛋白的氨基酸序列，更优选为I型胶原蛋白α1链的氨基酸序列。

低内毒素蛋白质优选为包含序列号1的氨基酸序列的多肽，更优选为由序列号1的氨基酸序列构成的多肽。

珍珠核或外套膜所含有的低内毒素蛋白质可以是1种多肽，也可以是2种以上的多肽的组合。

另外，序列号2所示的人I型胶原蛋白α1链的氨基酸序列在1464个氨基酸的全长中仅包含两个位置的RGD序列(745位～747位及1093位～1095位)。在将基于人I型胶原蛋白α1链的氨基酸序列制作的蛋白质用作本发明所涉及的蛋白质的情况下，通过将RGD序列的个数变更为上述叙述的优选的范围，可获得更优选的具有细胞粘附促进能力的蛋白质。

并且，认为，通过去除存在于分子的两端，且有助于胶原蛋白分子之间的缔合的端肽，分子之间的缔合受到抑制，插核时的操作性进一步提高。

从上述观点出发，本发明所涉及的珍珠养殖用材料中所包含的低内毒素蛋白质可以包含多个(优选为4个～20个，更优选为6个～16个)例如序列号2的氨基酸中的包含745位的Arg～747位的Asp的20个氨基酸长度～60个氨基长度的区域。此时，多个区域各自可以相同，也可以不同(即，在745位～747位的RGD周边的区域中虽然重复，但是边界点不同)，即使直接相接，也可以在其之间夹有1个以上的其他氨基酸残基。

优选各区域分别独立地为包含722位的Gly～755位的Gly的区域的34个氨基酸长度～50个氨基酸长度的区域。并且，从重组细胞内的表达效率、在水中的溶解性及潮解的抑制的观点出发，总氨基酸长度优选为200个氨基酸长度～800个氨基酸长度，更优选为300个氨基酸长度～600个氨基酸长度。

更具体而言，本发明所涉及的珍珠养殖用材料中所包含的低内毒素蛋白质可以是序列号1所示的蛋白质。该蛋白质为571个氨基酸长度的蛋白质，其中，包含12个包含序列号2中的745位的Arg～747位的Asp的数十个氨基酸左右的区域。

构成低内毒素蛋白质的蛋白质优选包含可以被1个以上的氨基酸分离的GXY三联体的重复序列及1个以上的RGD基序，多分散度小于20。

-GXY三联体-

在本发明中，“GXY三联体”表示从N末端侧至C末端侧存在“G(甘氨酸)”、“X(除了G以外任意氨基酸)”及“Y(除了G以外的任意氨基酸)”的3个氨基酸的氨基酸序列的单位。

在此，“X”及“Y”分别独立地表示除了G以外的任意氨基酸。“X”和/或“Y”优选为“P(脯氨酸)”和/或“4-羟基脯氨酸”。

相对于本发明所涉及的蛋白质的氨基酸序列全长，GXY三联体所占的区域的比例(总比例)优选为50％以上，更优选为60％以上，进一步优选为70％以上，尤其优选为80％以上，最优选为90％以上，非常优选为95％以上。

并且，GXY三联体可以在低内毒素蛋白质的氨基酸序列全长上重复。

在低内毒素蛋白质中，在存在GXY三联体的情况下，具有与活体亲和性高的胶原蛋白蛋白质近似的结构。因此，认为，在将选自由含有低内毒素蛋白质的珍珠核及外套膜组成的组中的至少1个进行插核的情况下，优质的珍珠的得率得到提高。

在本发明中，“GXY三联体”可以在GXY三联体之间不含氨基酸而串联连接，也可以在GXY三联体之间包含1个以上的氨基酸。优选“GXY三联体”在GXY三联体之间不含氨基酸而串联连接。

-RGD基序-

在本发明中，“RGD基序”表示从N末端侧至C末端侧存在“R(精氨酸)”、“G(甘氨酸)”及“D(天冬氨酸)”的3个的氨基酸的基序。认为，由于“RGD基序”干预细胞粘附，因此例如在插入含有低内毒素蛋白质的珍珠核的情况下，外套膜细胞相对于珍珠核的表面的扩展得到促进，可生成斑点等少的优质的珍珠。

另外，在与蛋白质的关系中使用的“基序”是指在功能上或结构上具有特征的氨基酸序列。

在低内毒素蛋白质中，可以包含1个～100个“RGD基序”，可优选包含5个～75个“RGD基序”，可更优选包含10个～50个“RGD基序”，可进一步优选包含10个～25个“RGD基序”。

并且，相对于构成低内毒素蛋白质的氨基酸10个～100个，优选以1个的比例包含“RGD基序”，相对于构成低内毒素蛋白质的氨基酸20个～75个，更优选以1个的比例包含“RGD基序”，相对于构成低内毒素蛋白质的氨基酸30个～60个，进一步优选以1个的比例包含“RGD基序”，相对于低内毒素蛋白质的构成氨基酸45个～55个，更优选以1个的比例包含“RGD基序”。

通过在低内毒素蛋白质中以上述范围包含RGD基序，细胞粘附促进能力提高，从而能够有助于优质的珍珠的得率。

“GXY三联体”与“RGD基序”能够以重叠的方式存在。即，GXY三联体的第一个G可以是RGD基序的第二个G。

低内毒素蛋白质的重均分子量优选为30kDa(千道尔顿)～200kDa，更优选为30kDa～100kDa，进一步优选为40kDa～75kDa，尤其优选为50kDa～60kDa。若低内毒素蛋白质的重均分子量在上述范围内，则对水的良好的溶解性与由于吸湿引起的潮解的抑制之间的平衡优异。

从对水的良好的溶解性与由于吸湿引起的潮解的抑制之间的平衡优异的观点出发，低内毒素蛋白质的数均分子量优选为15kDa～100kDa，更优选为20kDa～80kDa，进一步优选为30kDa～60kDa，尤其优选为40kDa～50kDa。

-多分散度-

从进一步提高优质的珍珠的得率，且插核时的操作性优异的观点出发，低内毒素蛋白质的多分散度优选小于20，更优选小于10，进一步优选小于5，尤其优选小于2。

认为，若低内毒素蛋白质的多分散度在上述范围内，则在母贝中使珍珠核与外套膜组织之间的活体组织等级上的相互作用均等，从而优质珍珠的得率进一步提高。并且，在上述相互作用中，相较于极性亲水基团彼此的键，优先形成由分子之间的相互作用产生的键，因此认为阻碍作为粘性的主要原因的空气中的水分的吸湿，插核时的操作性更优异。

在本发明中，多分散度是指将重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)而得的值(Mw/Mn)。

＜珍珠核＞

本发明所涉及的珍珠养殖用材料包含珍珠核。珍珠核通常通过与外套膜一起插入到母贝中，从外套膜的上皮细胞分泌以碳酸钙作为主要成分的分泌物，从而在珍珠核的表面形成珍珠层。

作为珍珠核的材料，只要在珍珠核的表面形成珍珠层，则并无特别限制，可举出淡水双壳贝，即丽蚌属(Genus Lamprotula)、瓦巴斯什猪脚贻贝(Fusconaia flava)、黑鬼头贝(Fusconaia ebenus)等。并且，作为珍珠核的材料，可以将聚丙烯、聚碳酸酯等树脂、玻璃、石英、碳酸钙等陶瓷等作为材料。

作为珍珠核的大小(最大直径)，可以根据目标珍珠的尺寸来适当地选择，例如可以为4mm～10mm。

作为珍珠核的形状，并无特别限制，可以为球形、半球形、椭圆形、茧形、圆盘形、星形、眼泪形、不定形等。

＜外套膜＞

本发明所涉及的珍珠养殖用材料包含外套膜。外套膜为贝的外套膜小片(以下，有时也称为“外套膜片”。)，通过与珍珠核一起插入到母贝中，从外套膜的上皮细胞分泌以碳酸钙作为主要成分的分泌物，从而在珍珠核的表面形成珍珠层。

作为用于制作外套膜的贝，并无特别限制，可举出马氏珠母贝、大翼珍珠贝、白蝶贝、黑蝶贝、螺；虾夷鲍鱼、海螺、大凤螺、天王赤旋螺、椰子涡螺等淡水贝；池蝶蚌、三角帆蚌、褶纹冠蚌等。外套膜可以源自与母贝相同种类的贝，也可以源自与母贝不同种类的贝。

在本发明中，“与母贝不同种类的贝”不仅包含分类学上的种类与母贝的种类不同的贝，虽然在分类学上与母贝为同一分类，但是品种或系统不同的贝也包含在“与母贝不同种类的贝”中。

在使用源自与母贝不同种类的贝的外套膜(以下，也称为“异种外套膜”。)的情况下，作为母贝与异种外套膜的组合，例如，可举出：母贝为马氏珠母贝且异种外套膜为大翼珍珠贝的组合；母贝为马氏珠母贝且异种外套膜为上述螺的组合；及母贝为马氏珠母贝且异种外套膜为上述淡水贝的组合等。

作为将本发明所涉及的珍珠养殖用材料进行插核的母贝的种类，并无特别限制，可举出与用于制作外套膜的贝相同的贝，任何贝均能够优选使用。

外套膜的大小可以根据珍珠核的尺寸来适当地选择，例如，可以为2mm～4mm见方(2mm×2mm～4mm×4mm)左右的大小。

(插入珍珠核的方法)

本发明所涉及的插入珍珠核的方法可以是使用本发明所涉及的珍珠养殖用材料将珍珠核插入(以下，有时也称为“再次插核”。)到已取出珍珠的母贝的珍珠袋中的方法。

作为在母贝形成珍珠的方法，并无特别限制，可以通过一般的珍珠的养殖方法来形成，也可以在后述人工环境下形成。

本发明所涉及的插入珍珠核的方法例如还能够适用于在试管内或反应器内、细胞培养液中等体外(in vitro)的系统中形成珍珠，并在取出了该珍珠的母贝的珍珠袋中插核的方法中。此时，取出珍珠的母贝与再次插核的母贝可以是相同种类，也可以是不同种类。

在本发明所涉及的插入珍珠核的方法中，作为母贝，并无特别限制，可举出已叙述的用于制作外套膜的贝。并且，作为再次插核的母贝，并无特别限制，除了马氏珠母贝、白蝶贝、黑蝶贝等海水贝以外，还可举出三角帆蚌等淡水贝，还能够优选适用于任一种贝。

并且，本发明所涉及的制作珍珠的方法可以是使用通过本发明所涉及的再次插核方法进行了插核的母贝来制作珍珠的方法。

作为制作珍珠的方法，并无特别限制，可以通过一般的珍珠的养殖方法来制作珍珠，也可以在人工环境、例如试管内或反应器内、细胞培养液中等体外的系统中制作。

并且，作为本发明所涉及的珍珠养殖用材料的一实施方式，可以使用本发明所涉及的珍珠养殖用材料，将不含内毒素量为10EU/g以下的蛋白质的外套膜插入到母贝中。

＜珍珠养殖用材料组合物＞

本发明所涉及的珍珠养殖用材料组合物包含本发明所涉及的珍珠养殖用材料。通过使用本发明所涉及的珍珠养殖用材料组合物进行珍珠养殖，能够提高优质的珍珠的得率。

作为珍珠养殖用材料组合物的形状，并无特别限制，可以是液态，也可以是固态，还可以是半固态。

关于本发明所涉及的珍珠养殖用材料组合物，在不损害本发明所涉及的效果的范围内，可以包含赋形剂、溶剂、NaCl等无机盐、缓冲剂；HEPES、PBS等、增稠剂、pH调节剂、稳定剂、光吸收剂、抗生素；青霉素系化合物、头孢烯系化合物、大环内酯系化合物、四环素系化合物、新喹诺酮系化合物等着色剂；酚红、曙红等添加剂。

作为上述溶剂，并无特别限制，可举出水、醇化合物、大豆油、橄榄油等动植物油、矿物油及合成油等。

其中，从与低内毒素蛋白质的相溶性优异的观点出发，作为溶剂，优选水。

作为上述赋形剂，并无特别限制，可举出麦芽糖、肌醇、甘露糖醇、乳糖、蔗糖、海藻糖等糖化合物、苯丙氨酸等氨基酸化合物、羟丙基纤维素等纤维素衍生物及硬脂酸镁等有机酸盐等。

在珍珠养殖用材料组合物的形状为固态的情况下，可以将低内毒素蛋白质溶解于适当地选择的适合的溶解液中之后，涂布于选自珍珠核及外套膜中的至少1个而得。

作为上述溶解液，例如，优选生理食盐水、各种缓冲液、葡萄糖、肌醇、甘露糖醇、乳糖等糖类溶液及乙二醇、聚乙二醇等乙二醇化合物。

并且，在本发明所涉及的珍珠养殖用材料组合物中所包含的低内毒素蛋白质为冷冻干燥体的情况下，优选珍珠养殖用材料组合物还包含适合的溶解液、例如消毒水、生理食盐水、葡萄糖液、电解质溶液或氨基酸溶液等液体。

作为本发明所涉及的珍珠养殖用材料组合物中所包含的成分，优选为减少了内毒素量的成分。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明只要不超出其要旨则并不限定于以下实施例。另外，只要无特别说明，则“份”及“％”为质量基准。

关于涂覆溶液1～涂覆溶液7，以下述方式进行了制备。以下使用的cellnest人I型胶原蛋白样重组肽(产品名称；cellnest，Fujifilm Corporation制造，冷冻干燥体)的内毒素量为已叙述的内毒素量的测定方法(LONZA公司的“PYROGENT^TM-5000”；动力学比浊法)中的检测极限值以下(2.5EU/g以下)。

以下使用的cellnest人I型胶原蛋白样重组肽(以下，也简称为“胶原蛋白样肽”。)具有如下结构，即，从人I型胶原α1链中，将包含细胞粘附性高的RGD序列的部位切成4种模式的片段而进行连接，并进一步将其连接3个。更具体而言，由具有序列号1中所记载的氨基酸序列且重复有GXY三联体的571个氨基酸构成，包含12个RGD基序。

并且，关于以下使用的胶原蛋白样肽的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、多分散度(Mw/Mn)及粘度，按照以下方法进行了测定。

将cellnest人I型胶原蛋白样重组肽(Fujifilm Corporation制造)的水溶液(对冷冻标样进行解冻之后)在40℃下加热30分钟来使胶原蛋白样肽完全溶解之后，用100mM的磷酸缓冲液进行稀释，以使水溶液中的蛋白质的浓度成为0.2质量％，然后，用0.45μm的过滤器进行过滤而制备了样品溶液。

使用高速凝胶渗透层析(GPC)分析装置(产品名称；HLC-8220GPC，TOSOHCORPORATION制造)在下述条件下测定上述样品溶液，求出普鲁兰换算的重均分子量(Mw)及数均分子量(Mn)，并根据所获得的重均分子量及数均分子量计算出多分散度(Mw/Mn)。结果如下述。

重均分子量(Mw)；56，494

数均分子量(Mn)；48，787

多分散度(Mw/Mn)；1.16

-GPC测定条件-

柱：Shodex Asahipak GS-620 7G-p内径7.5mm长度50cm(SHOWA DENKO K.K.制造)

洗脱液：100mM磷酸缓冲液(pH＝6.9)

流速：样品：1.0mL/min，参考值：0.1mL/min

柱温度(设定)：40℃

注入量：100μL

检测器：RI/UV(210nm)

分子量校正用蛋白质：普鲁兰(SHOWA DENKO K.K.制造，Shodex P-82)

＜＜涂覆溶液1的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；100mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)，而制备了0.1％的涂覆水溶液1。另外，cellnest人I型胶原蛋白样重组肽具有序列号1的氨基酸序列。

＜＜涂覆溶液2的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；100mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)、内毒素〔Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science Society ofJapan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕，从而制备了上述重组肽的内毒素量为5EU/g的0.1质量％的涂覆水溶液2。

＜＜涂覆溶液3的制备＞＞

在上述涂覆溶液2的制备中，将内毒素〔Pharmaceutical and Medical DeviceRegulatory Science Society of Japan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕变更为表1中所记载的添加量，除此以外，以与上述涂覆溶液2相同的方式，制备了上述重组肽的内毒素量为10EU/g的0.1质量％的涂覆水溶液3。

＜＜涂覆溶液4的制备＞＞

在上述涂覆溶液2的制备中，将内毒素〔Pharmaceutical and Medical DeviceRegulatory Science Society of Japan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕变更为表1中所记载的添加量，除此以外，以与上述涂覆溶液2相同的方式，制备了上述重组肽的内毒素量为30EU/g的0.1质量％的涂覆水溶液4。

＜＜涂覆溶液5的制备＞＞

在上述涂覆溶液2的制备中，将内毒素〔Pharmaceutical and Medical DeviceRegulatory Science Society of Japan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕变更为表1中所记载的添加量，除此以外，以与上述涂覆溶液2相同的方式，制备了上述重组肽的内毒素量设为100EU/g的0.1质量％的涂覆水溶液5。

＜＜涂覆溶液6的制备＞＞

在上述涂覆溶液2的制备中，将内毒素〔Pharmaceutical and Medical DeviceRegulatory Science Society of Japan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕变更为表1中所记载的添加量，除此以外，以与上述涂覆溶液2相同的方式，制备了上述重组肽的内毒素量为1，000EU/g的0.1质量的涂覆水溶液6。

＜＜涂覆溶液7的制备＞＞

在上述涂覆溶液2的制备中，将内毒素〔Pharmaceutical and Medical DeviceRegulatory Science Society of Japan制造，日本药典中所记载的标准品内毒素〕变更为表1中所记载的添加量，除此以外，以与上述涂覆溶液2相同的方式，制备了上述重组肽的内毒素量为10,000EU/g的0.1质量的涂覆水溶液7。

＜＜涂覆核1的制作＞＞

将进行了清洗及灭菌处理的直径为2.3分(约7mm)尺寸的未处理核(珍珠核)完全浸渍于上述制备的涂覆液1中，并在37℃下进行了2小时的振荡搅拌。接着，用金属制滤器(16目)进行过滤之后，在温度25℃、湿度55％的气氛下，干燥24小时，由此制作了涂覆核1。

通过以下方法来测定包覆在上述涂覆核1的表面上的重组肽量的结果，为339pg/mm²。

-重组肽的包覆量的测定方法-

(1)表面蛋白质的洗提

准备至少10个珍珠核或外套膜，将珍珠核或外套膜浸渍于10mL左右的水中并静置18小时，从而制备了养殖材料样品溶液。

(2)表面蛋白质的水解

在养殖材料样品溶液中加入6mol/L(N)盐酸1mL，并在110℃下静置了22小时。

(3)蛋白质的再次溶解

在将6mol/L(N)盐酸通过氮气并使其挥发之后，进一步加入了0.02mol/L(N)稀盐酸0.2mL。

(4)利用LC/MS对氨基酸进行定量

使用LC/MS(型号；UPLC/MS(SQD)，Waters Corporation制造)来对脯氨酸进行定量，求出空白核(不含低内毒素蛋白质的珍珠核)之差，根据事前制作的校准曲线来求出肽量，并求出每1mm²的包覆量。

＜＜涂覆核2～涂覆核7的制作＞＞

在上述涂覆核1的制作中，将涂覆液1变更为上述涂覆液2～涂覆液7，除此以外，以与涂覆核1相同的方式制作了涂覆核2～涂覆核7。

(实施例1-1～实施例1-3及比较例1-1～比较例1-5)

使用上述制作的涂覆核1～涂覆核7分别进行了以下养殖实验。对所收获的珍珠进行下述(1)～(3)的评价，并将评价结果记载于表1中。

〔养殖实验〕

准备1组约140个马氏珠母贝母贝(天然贝，2岁)，使用上述制作的涂覆核及外套膜进行了插核养殖。在插核养殖8个月之后从母贝中取出核，收获了珍珠。

(1)产品珍珠得率

从事于珍珠养殖的专家通过肉眼对所收获的珍珠进行一等品、二等品及不良珠的筛选。另外，一等品及二等品的珍珠为优质珍珠，是作为商品而可容许的等级。

将筛选出的一等品及二等品的珍珠数量相对于收获的珍珠数量的比率设为“相对于收获的珍珠数量的得率(得率1)”。并且，将筛选出的一等品及二等品的珍珠数量相对于插核数量的比率设为“相对于插核数量的得率(得率2)”。得率1及得率2的值越大，则产品珍珠得率越良好。

(2)珍珠层的厚度(卷)

从所收获的珍珠的质量中减去事前测定的养殖之前的珍珠核的质量，分别求出所形成的珍珠层的质量，并求出了珍珠层的平均质量。珍珠层的平均质量的值越大，则珍珠层越厚，“卷”越优异。

(3)白度

关于白度，只使用在上述(1)中筛选出的一等品的珍珠进行了评价。上述(1)的专家通过肉眼比较一等品的珍珠和标准珠的白度，根据以下基准，对一等品的珍珠分别进行评价，求出各评价值的平均值并作为白度。白度的值越大，则白度越优异。

-评价标准-

1：珍珠的外观为略带蓝色的奶油色，为了加工成珠宝饰品而需要漂白处理及调色的等级。

2：珍珠的外观为奶油色，虽然为了加工成珠宝饰品而需要漂白处理，但是不需要调色的等级。

3：珍珠的外观为非常浅的奶油色，为了加工成珠宝饰品而均不需要漂白处理、调色的等级。

＜＜涂覆外套膜1～涂覆外套膜7的制作＞＞

在上述制备的涂覆液1中，将切割成2mm见方(2mm×2mm)的外套膜片在25℃下完全浸渍1分钟，从而制作了涂覆外套膜1。

并且，将上述涂覆液1变更为涂覆液2～涂覆液7，除此以外，以与涂覆外套膜1的制作相同的方式，制作了涂覆外套膜2～涂覆外套膜7。

使用所获得的涂覆外套膜1～覆外套膜7和未处理核，进行了与实施例1-1相同的养殖实验。在使用了涂覆外套膜1～涂覆外套膜3的养殖实验中，与实施例1-1同样地，所获得的珍珠的珍珠层厚，卷优异。并且，白度也优异。

另一方面，在使用了涂覆外套膜4～涂覆外套膜7的养殖实验中，与比较例1-1同样地，所获得的珍珠的珍珠层的厚度及白度差。

并且，组合涂覆核1和涂覆外套膜1，进行与实施例1-1相同的养殖实验的结果，与实施例1-1同样地，所获得的珍珠的珍珠层厚，卷优异。并且，白度也优异。

＜＜涂覆溶液21的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；2，000mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)，而制作了1质量％的涂覆水溶液21。

＜＜涂覆溶液22的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；100mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)，而制作了0.025质量％的涂覆水溶液22。

＜＜涂覆溶液23的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；100mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)，而制作了0.0125质量％的涂覆水溶液23。

＜＜涂覆溶液24的制备＞＞

在cellnest人I型胶原蛋白样重组肽；100mg(产品名称；cellnest，FujifilmCorporation制造，冷冻干燥体)中添加注射用水(HIKARI PHARMACEUTICAL CO.，LTD.制造)，而制作了0.0625质量％的涂覆水溶液24。

＜＜涂覆核21～涂覆核24的制作＞＞

在上述涂覆核1的制作中，使用涂覆液21～涂覆液24来代替涂覆液1，除此以外，以与涂覆核1相同的方式制作了涂覆核21～涂覆核24。按照与上述方法相同的步骤测定了包覆在所获得的涂覆核21～涂覆核24的表面上的重组肽量。涂覆核21～涂覆核24中的重组肽的包覆量如下述。

涂覆核21的重组肽的包覆量；20,130pg/mm²

涂覆核22的重组肽的包覆量；147pg/mm²

涂覆核23的重组肽的包覆量；83pg/mm²

涂覆核24的重组肽的包覆量；29pg/mm²

(实施例2-1～实施例2-4)

使用上述制作的涂覆核21～涂覆核24，通过与实施例1-1相同的方法进行养殖实验，使用所收获的珍珠，以与实施例1相同的方式进行了评价。将评价结果记载于表2中。

根据表1及表2中所记载的结果明确可知，本发明所涉及的珍珠养殖用材料中，与比较例的珍珠养殖用材料相比，所获得的珍珠的珍珠层厚，即，“卷”优异。并且，本发明所涉及的珍珠养殖用材料中，与比较例的珍珠养殖用材料相比，“白度”优异，产品数量相对于插核数量及收获的珍珠数量的比例(得率)高。在使用本发明所涉及的珍珠养殖用材料进行珍珠养殖的情况下，可获得优质的珍珠。

于2018年10月12日申请的日本专利申请第2018-193668号的公开，其整体通过参考编入本说明书中。

本说明书中所记载的所有文献、专利申请及技术标准与各文献、专利申请及技术标准通过参考而被具体且分别记载的情况相同程度地，通过参考而被编入本说明书中。