具体实施方式

本发明公开了一种血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过利用UPLC-Orbitrap HRMS进行分离和鉴定注射用血塞通(冻干)中三七皂苷的含量并对其三七皂苷的色谱行为和质谱的裂解规律进行全面的分析。充分利用质谱的高能碰撞解离参数，对二级碎片进行解析、归属并总结质谱的裂解规律和已知的文献对比，从而判断未知化合物的结构特征。本发明对血塞通注射剂的物质基础进行系统性研究，为血塞通的进一步开发利用提供基础性研究资料，并对其系统研究皂苷类成分的药效物质基础并明确与功能主治的相关性，对血塞通中有效成分的二次开发具有指导意义。

本发明物质基础数据库建立方法包括以下步骤：

1)三七皂苷的提取与分离

取实验药材样品10g，用纯化水溶解上D101大孔树脂，用水、30％、50％、70％、90％Me2OH洗脱，分别得到50％的乙醇部位(4.1g)，70％的乙醇部位(2.3g)，90％的乙醇部位(2.0g)。50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱得三个部位(Fr.1-Fr.3)；Fr.1经MCI柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱得两个流分(Fr.1.1-1.2)。Fr1.1通过50％乙醇反复重结晶得结晶体12；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，甲醇水(40％-65％)梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得化合物11、化合物13和化合物15；Fr.2经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：18：0.5-80：20：0.1)梯度洗脱得2个流分(Fr：2.1-2.2)；Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得化合物10：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物4和5；Fr.3通过RP-ODS反相柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得结晶体1和9；

70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱得Fr.4-Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱分离和Sephadex LH-20柱色谱纯化得到化合物3；Fr.5经ODS反相柱色谱，甲醇水(65％-85％)梯度洗脱得2个流分(Fr.5.1-5.2)；Fr.5.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物8：Fr.5.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物6和7。Fr.6经MDS反相柱色谱，55％甲醇-水溶液洗脱，再经甲醇反复重结晶得结晶体2；90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(100：1-50：50)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物14和15；

2)皂苷单体的结构鉴定

从项下2中分离得到RSZG-1～RSZG-15的15种皂苷成分，对13C NMR、1H NMR进行分析，分别鉴定为三七皂苷R1(RSZG-1)、人参皂苷Rg1(RSZG-2)、人参皂苷Re(RSZG-3)、20(S)-人参皂苷Rf(RSZG-4)、20(S)-人参皂苷Rh1(RSZG-5)、20(S)-人参皂苷Rg2(RSZG-6)、人参皂苷Rb1(RSZG-7)、20(S)-人参皂苷F1(RSZG-8)、人参皂苷Rb2(RSZG-9)、人参皂苷Rc(RSZG-10)、人参皂苷Rb3(RSZG-11)、人参皂苷Rd(RSZG-12)、人参皂苷Rk3(RSZG-13)、人参皂苷Rh4(RSZG-14)、人参皂苷Rg3(RSZG-15)；

3)液质分析方法的建立

3.1色谱条件

色谱条件：色谱柱(Brige Shield RP18(4.6mm×250mm，5μm))；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B。流速为1mL/min；进样量10μL；

3.2质谱条件

工作模式：ESI^-，Full MS/dd-MS²(TopN)模式，扫描范围：m/z 150～2000，分辨率：70000；

离子源参数：鞘气流速(Sheath gas flow rate)65arb，辅助气流速(Aux gasflow rate)20arb，吹扫气流速(Sweep gas flow rate)4arb，喷雾电压(Spray voltage)2.5kV，毛细管(离子传输管)温度(Capillary temperature)300℃，S-lens电压(S-lens RFlevel)50V，加热温度(Heater temperature)500℃；

4)分析用溶液的制备

4.1对照品溶液的制备

分别称取以上15个对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度约为100μg/mL的储备液：分别精密吸取各储备液适量，加入甲醇定容于5mL容量瓶中；

4.2样品制备

称取供试品5mg至10mL容量瓶中，用70％甲醇溶解，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液超声5min即得；

5)三七皂苷中化合物的LC-MS的分析

根据CID裂解所产生的中性丟失碎片，判断皂苷成分所连接糖基种类与数量，同时推断端基位糖基类别；

6)供试品中皂苷类成分的LC-MS分析

除标准物质成分，未知成分根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与文献报道化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为等比对，进行化合物推断；

7)液相色谱-质谱-数据库(LC-MS-Database，LC-MS-DS)的建立

利用Database Manager建立数据库。

本发明提供的血塞通注射剂物质基础数据库的建立方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.三七皂苷的提取与分离

取实验药材样品10g，用纯化水溶解上D101大孔树脂，用水、30％、50％、70％、90％Me2OH洗脱，分别得到50％的乙醇部位(4.1g)，70％的乙醇部位(2.3g)，90％的乙醇部位(2.0g)。

50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱得三个部位(Fr.1-Fr.3)；Fr.1经MCI柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱得两个流分(Fr.1.1-1.2)。Fr1.1通过50％乙醇反复重结晶得结晶体12(18mg)；Fr.1.2经RP-ODS柱色谱，甲醇水(40％-65％)梯度洗脱，再经Sephadex LH-20柱纯化得化合物11(16mg)，13(15mg)；Fr.2经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：18：0.5-80：20：0.1)梯度洗脱得2个流分(Fr：2.1-2.2)。Fr.2.1经Sephadex LH-20柱纯化得化合物10(20mg)：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-1，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物4(16mg)，5(20mg)。Fr.3通过RP-ODS反相柱色谱，甲醇-水(40％-60％)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得结晶体1(21mg)，9(17mg)。

70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱得Fr.4-Fr.6；Fr.4经反复硅胶色谱分离和Sephadex LH-20柱色谱纯化得到化合物3(18mg)。Fr.5经ODS反相柱色谱，甲醇水(65％-85％)梯度洗脱得2个流分(Fr.2.1-2.2)。Fr.2.1经Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物8(17mg)：Fr.2.2经半制备液相色谱，流速1.5mL·min-¹，波长203mm，65％甲醇水纯化得化合物6(20mg)和7(16mg)。Fr.6经MDS反相柱色谱，55％甲醇-水溶液洗脱，再经甲醇反复重结晶得结晶体2(25mg)。

90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯(100：1-50：50)梯度洗脱，再经反复Sephadex LH-20柱色谱纯化得化合物14(20mg)和15(18mg)。

2.皂苷单体的结构鉴定

分别从50％的乙醇部位经MDS柱色谱，甲醇水(30％-90％)梯度洗脱、70％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇-水(100：3：0.1-7：3：0.5)梯度洗脱、90％的乙醇部位经硅胶柱色谱分离得到得到RSZG-1～RSZG-15的15种皂苷成分，对¹³C NMR、¹H NMR进行分析，分别鉴定为三七皂苷R1(RSZG-1)、人参皂苷Rg1(RSZG-2)、人参皂苷Re(RSZG-3)、20(S)-人参皂苷Rf(RSZG-4)、20(S)-人参皂苷Rh1(RSZG-5)、20(S)-人参皂苷Rg2(RSZG-6)、人参皂苷Rb1(RSZG-7)、20(S)-人参皂苷F1(RSZG-8)、人参皂苷Rb2(RSZG-9)、人参皂苷Rc(RSZG-10)、人参皂苷Rb3(RSZG-11)、人参皂苷Rd(RSZG-12)、人参皂苷Rk3(RSZG-13)、人参皂苷Rh4(RSZG-14)、人参皂苷Rg3(RSZG-15)。

3.液质分析方法的建立

3.1色谱条件

色谱条件：色谱柱(Brige Shield RP18(4.6mm×250mm，5μm))；流动相：0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0min，18％B；10min，18％B；28min，26％B；51min，30％B；67min，39％B；85min，64％B。流速为1mL/min；进样量10μL。

3.2质谱条件

工作模式：ESI^-，Full MS/dd-MS²(TopN)模式，扫描范围：m/z 150～2000，分辨率：70000。

离子源参数：鞘气流速(Sheath gas flow rate)65arb，辅助气流速(Aux gasflow rate)20arb，吹扫气流速(Sweep gas flow rate)4arb，喷雾电压(Spray voltage)2.5kV，毛细管(离子传输管)温度(Capillary temperature)300℃，S-lens电压(S-lens RFlevel)50V，加热温度(Heater temperature)500℃。

4.分析用溶液的制备

4.1对照品溶液的制备

分别称取以上15个对照品适量，精密称定，加入甲醇制成浓度约为100μg/mL的储备液：分别精密吸取各储备液适量，加入甲醇定容于5mL容量瓶中。

4.2样品制备

称取供试品5mg至10mL容量瓶中，用70％甲醇溶解，通过0.22μm的微孔滤膜，取续滤液超声5min即得。

5.三七皂苷中化合物的LC-MS的分析

由表1数据可知：

(1)在ESI^-测模式下，所有标准物质与流动相中HCOO^-结合，形成加合离子[M+HCOO^-]^-，在一级质谱作为基峰离子出现。除人参皂苷F1，人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4三个单糖皂苷外，其余皂苷标准物质的一级质谱中同时出现准分子离了[M-H]^-：

(2)Ms2谱中，人参皂苷F1，人参皂苷Rk3，人参皂苷Rh4主要丢失加合离子HCOO^-，产生基峰[M-H]^-，其余皂苷则经过CID裂解产生脱去糖残基(葡萄糖，鼠李糖，木糖，阿拉伯糖)后的碎片离子和皂苷苷元(人参三醇苷元和人参二醇苷元)的碎片离子：

(3)C-20位连接糖基较C-3和C-6位连接糖链易丢失。如人参皂苷Rb2，Rb3和Rc，均先丢失C-20位所连接糖链的末端糖基，分别产生基峰离子m/z 945[M-H-Ara(p)]^-，m/z 945[M-H-Xly]^-，mlz 945[M-H-Ara(f)]^-，表明C-20位羟基较活泼，易于糖苷键的断裂：

(4)根据CID裂解所产生的中性丟失碎片，可判断皂苷成分所连接糖基种类与数量，同时也可推断端基位糖基类别。

6.供试品中皂苷类成分的LC-MS分析

除标准物质成分，未知成分根据高分辨质谱数据预测分子组成，并根据其多级质谱碎片信息推断化合物所连接糖基个数与种类，与文献报道化合物的分子质量、化学结构、保留时间和质谱裂解行为等比对，进行化合物推断。

7液相色谱-质谱-数据库(LC-MS-Database，LC-MS-DS)的建立

7.1色谱参数的选择

流动相的乙腈-0.1％甲酸水溶液系统，可以降低溶剂系统带来的背景和基质干扰；使谱库的建立规范化。

7.2质谱采集参数的选择

中药材中化合物结构变化较多，若将所有化合物筛选最优的条件，将会导致最终结果的匹配度且操作性差。因此，在利用Database Manager建库的过程中，MS方法中的离子源参数以及二级质谱中的参数应当不能改变。

7.3LC-MS-DS检索的可信度评价

为确保数据库检索结果的可信度，本实验的数据库的建立按以下两点判断：①建立MS2方法分别分析未知化合物和标准品，观察保留时间是否相同；②分别提取三七皂苷中的化合物和标准品的MS2的ESI图，并找出定性离子对(母离子与子离子组成)是否相同，这样即使是同分异构体也可以通过MS2进行鉴别。

本实验对已经确证的三七皂苷的化合物利用Mass Frontier 7.0将其结构式模拟敲碎得到的碎片离子与注射用血塞通(冻干)的相对应的化合物进行比对。

7.4利用Database Manager建立数据库

Database Manager模块提供数种组织和处理质谱图、化学结构和库的方法，并在电子数据表格式中包括数据。可以使用模块中高级的数据库查询和检索功能访问快速化合物识别所需的信息。本实验利用该软件的模块创建包含质谱图、MSn质谱树、色谱图、化学结构和扩展化合物特性的自定义库。将15个已有对照品的三七皂苷建立数据库。图1-15为15种化合物的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱。

数据库信息如下：

表1注射用血塞通(冻干)样品中皂苷的结构鉴定

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。