蛋白质组合物的制造方法
阅读说明:本技术 蛋白质组合物的制造方法 (Method for producing protein composition ) 是由 朝仓哲郎 安部佑之介 石井秀人 于 2019-09-30 设计创作,主要内容包括:一种蛋白质组合物的制造方法,其具备使包含经酯化的蛋白质的原料组合物与酸性或碱性的介质接触而将酯基水解的工序。(A method for producing a protein composition, which comprises a step of contacting a raw material composition containing an esterified protein with an acidic or basic medium to hydrolyze an ester group.)
技术领域
本发明涉及一种蛋白质组合物的制造方法。
背景技术
使用甲酸等酸进行纺丝的方法已被广泛熟知。例如专利文献1中公开了用酸处理包含结构多肽的生物样本的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2004-503204号公报
发明内容
发明想要解决的课题
本发明人等发现,使用以甲酸等羧酸为溶剂的纺丝液(纺丝原液)所制造的蛋白质纤维在纺丝过程中通过蛋白质中的氢氧基与羧酸的脱水缩合反应而形成了酯基。本发明人等还发现,在这样得到的蛋白质纤维中,添加在蛋白质中的酯基会以微量残留于蛋白质表面或内部的甲酸等羧酸为催化剂而进行水解,而导致羧酸游离,游离后的羧酸会引发恶臭等。本发明旨在解决本发明人等新发现的这些课题。
即,本发明的目的在于提供一种除去或降低了蛋白质中所含的酯基的蛋白质组合物及其制造方法、以及酯基除去方法。
用于解决课题的手段
本发明涉及例如以下的各发明。
[1]
一种蛋白质组合物的制造方法,其具备使包含经酯化的蛋白质的原料组合物与酸性或碱性的介质接触而将酯基水解的工序。
[2]
根据[1]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述介质为包含水分的介质,上述包含水分的介质为40℃以上且180℃以下。
[3]
根据[2]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述包含水分的介质为水溶液或水蒸气。
[4]
根据[3]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述包含水分的介质为水溶液,上述水溶液的温度为40℃以上且沸点以下。
[5]
根据[4]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述水溶液为pH12以下的碱性水溶液。
[6]
根据[1]~[5]中任一项所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述蛋白质为结构蛋白质。
[7]
根据[6]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述结构蛋白质为丝心蛋白。
[8]
根据[7]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述丝心蛋白为蛛丝丝心蛋白。
[9]
根据[1]~[8]中任一项所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述经酯化的蛋白质包含甲酸酯。
[10]
根据[1]~[9]中任一项所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述原料组合物为选自由纤维、薄膜、模塑成型体、凝胶、多孔体及粒子构成的组中的至少一种。
[11]
根据[10]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述原料组合物为纤维,上述包含水分的介质为水溶液,
上述制造方法进一步具备使上述纤维与上述水溶液接触而卷曲的卷曲工序。
[12]
根据[10]所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述原料组合物为纤维,上述包含水分的介质为水溶液,
上述制造方法进一步具备使上述纤维与上述水溶液接触而防缩的防缩工序。
[13]
根据[10]~[12]中任一项所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述原料组合物为纤维,上述纤维为线团状。
[14]
根据[10]~[12]中任一项所述的蛋白质组合物的制造方法,其中,上述原料组合物为纤维,上述纤维为布料状。
[15]
一种蛋白质组合物的制造方法,其具备使包含经酯化的蛋白质与酸或碱的原料组合物与水蒸气接触而将酯基水解的工序。
[16]
一种蛋白质组合物,其包含蛋白质,且具有酯基的水解履历。
[17]
根据[16]所述的蛋白质组合物,其中,上述水解履历为通过与酸性或碱性的包含水分的介质接触而将酯基水解的履历,
上述包含水分的介质为40℃以上且180℃以下。
[18]
根据[16]或[17]所述的蛋白质组合物,其中,上述酯基包含于甲酸酯。
[19]
根据[16]~[18]中任一项所述的蛋白质组合物,其中,上述蛋白质组合物进一步具有不可逆收缩的收缩履历。
[20]
根据[16]~[19]中任一项所述的蛋白质组合物,其中,上述蛋白质为结构蛋白质。
[21]
根据[20]所述的蛋白质组合物,其中,上述结构蛋白质为选自由蛛丝丝心蛋白、蚕丝丝心蛋白、角蛋白、胶原蛋白及弹力蛋白构成的组中的至少一种。
[22]
根据[21]所述的蛋白质组合物,其中,上述结构蛋白质为蛛丝丝心蛋白。
[23]
根据[16]~[22]中任一项所述的蛋白质组合物,其中,所述蛋白质组合物为蛋白质纤维。
[24]
根据[23]所述的蛋白质组合物,其中,上述蛋白质组合物为蛋白质纤维,
由下述式(1)定义的收缩率为-5%~+5%,
式(1):收缩率={1-(由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度/制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度)}×100[%]。
[25]
一种酯基除去方法,其具备使包含经酯化的蛋白质的原料组合物与酸性或碱性的包含水分的介质接触的工序。
[26]
根据权利要求25所述的酯基除去方法,其中,上述原料组合物为选自由纤维、薄膜、模塑成型体、凝胶、多孔体及粒子构成的组中的至少一种。
[27]
根据权利要求25或26所述的酯基除去方法,其中,上述蛋白质为结构蛋白质。
发明效果
根据本发明,提供一种除去或降低了蛋白质中所含的酯基的蛋白质组合物的制造方法、以及酯基除去方法。通过对蛋白质组合物进行酯基的水解处理也同时起到蛋白质组合物的防缩处理效果。即,本发明中的蛋白质组合物除去或降低酯基,并且降低了与水分接触时的收缩。
附图说明
[图1]为示出改性丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[图2]为示出改性丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[图3]为示出改性丝心蛋白的结构域序列的一例的示意图。
[图4]为简要示出用于制造原料纤维的纺丝装置的一例的说明图。
[图5]为简要示出用于制造蛋白质纤维的制造装置的一例的说明图。
[图6]为简要示出用于制造蛋白质纤维的制造装置的一例的说明图。
[图7]为简要示出用于制造蛋白质纤维的制造装置的一例的说明图。
[图8]为示出能够设于图7中的高温加热炉的速度调节机构及温度调节机构的说明图。
[图9]为确认了蛋白质纤维的水解处理前后的卷曲状态的照片。
[图10]为相对于蛋白质纤维与水蒸气的接触天数绘制反映了酯基的残存量的吸光度比(P1/P2)而成的图表。P1:1725cm-1(基于酯的C=O的峰)的峰高。P2:1445cm-1(基于蛋白质的酰胺III的峰)的峰高。
[图11]为酯基水解处理前后的蛋白质纤维的FT-IR的光谱图(1730cm-1:基于酯的C=O的峰)。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式进行详细说明。但本发明并不限定于以下的实施方式。
〔蛋白质组合物的制造方法〕
本实施方式中的蛋白质组合物的制造方法具备使包含经酯化的蛋白质(具有酯基的蛋白质)的原料组合物与酸性或碱性(碱性)的介质接触而将酯基水解的工序。
本实施方式中,原料组合物可以为选自由纤维(原料纤维)、薄膜(原料薄膜)、模塑成型体(原料模塑成型体)、凝胶(原料凝胶)、多孔体(原料多孔体)、及粒子(原料粒子)构成的组中的至少一种。
本实施方式中,原料组合物包含经酯化的蛋白质。本说明书中,,“经酯化的蛋白质”表示包含蛋白质的氢氧基与羧酸进行酯键合而形成的酯基的蛋白质。经酯化的蛋白质可以包含甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯等,优选包含甲酸酯。
(蛋白质)
作为本实施方式中的蛋白质(以下,有时也称为“目标蛋白质”。),能够列举天然的蛋白质和重组蛋白质(人造蛋白质)。另外,作为重组蛋白质,能够列举可以以产业规模制造的任意的蛋白质,能够列举例如:能够用于产业的蛋白质、能够用于医疗的蛋白质、结构蛋白质等。作为能够用于产业或医疗的蛋白质的具体例,能够列举:酶、调控蛋白、受体、肽类激素、细胞因子、膜或转运蛋白、用于予防接种的抗原、疫苗、抗原结合蛋白、免疫刺激蛋白、过敏原、全长抗体或抗体片段或者衍生物。结构蛋白质表示在生物体内形成或保持结构、形态等的蛋白质。结构蛋白质可以为丝心蛋白。作为结构蛋白质的具体例,能够列举:蛛丝丝心蛋白、蚕丝丝心蛋白、角蛋白、胶原蛋白、弹力蛋白及节肢蛋白、以及源自这些的蛋白质等。结构蛋白质可以为例如后述的改性丝心蛋白,从能够使保温性、吸湿发热性及/或阻燃性优异的观点出发,优选改性蛛丝丝心蛋白。
改性丝心蛋白为包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的蛋白质。改性丝心蛋白的结构域序列的N端侧及C端侧中任意一者或两者上可以进一步添加有氨基酸序列(N端序列及C端序列)。N端序列及C端序列不限定于此,典型地为具有丝心蛋白中特征性的氨基酸基序的重复的区域,由约100个残基的氨基酸构成。
本说明书中,“改性丝心蛋白”表示人为制造的丝心蛋白(人造丝心蛋白)。改性丝心蛋白可以为其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列不同的丝心蛋白,也可以为其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列相同的丝心蛋白。另外,本说明书中所述的“天然来源的丝心蛋白”也是包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的蛋白质。
“改性丝心蛋白”可以为直接利用天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列的蛋白,也可以为依据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列对该氨基酸序列进行改性而成的蛋白(例如,通过对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行改性而改性氨基酸序列而成的蛋白),另外,还可以为不依赖于天然来源的丝心蛋白而人工地设计及合成的蛋白(例如,通过化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而具有所需的氨基酸序列的蛋白)。
本说明书中,“结构域序列”为产生丝心蛋白特有的结晶区域(典型地,相当于氨基酸序列的(A)n基序。)和非晶区域(典型地,相当于氨基酸序列的REP。)的氨基酸序列,表示式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的氨基酸序列。在此,(A)n基序表示以丙氨酸残基为主的氨基酸序列,氨基酸残基数为2~27。(A)n基序的氨基酸残基数可以为2~20、4~27、4~20、8~20、10~20、4~16、8~16、或10~16的整数。另外,(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于氨基酸残基总数的比只要为40%以上即可,可以为60%以上、70%以上、80%以上、83%以上、85%以上、86%以上、90%以上、95%以上、或100%(表示仅由丙氨酸残基构成。)。结构域序列中存在多个的(A)n基序的至少7个可以仅由丙氨酸残基构成。REP表示由2~200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。REP可以为由10~200个氨基酸残基构成的氨基酸序列,也可以为10~40、10~60、10~80、10~100、10~120、10~140、10~160、或10~180个氨基酸残基构成的氨基酸配列。m表示2~300的整数,可以为8~300、10~300、20~300、40~300、60~300、80~300、10~200、20~200、20~180、20~160、20~140或20~120的整数。存在多个的(A)n基序可以为彼此相同的氨基酸序列,也可以为彼此不同的氨基酸序列。存在多个的REP可以为彼此相同的氨基酸序列,也可以为彼此不同的氨基酸序列。
本实施方式中的改性丝心蛋白可以通过例如对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行例如相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性而得到。氨基酸残基的取代、缺失、插入及/或添加能够通过定点诱变法等本领域技术人员周知的方法来进行。具体而言,能够依据Nucleic Acid Res.10,6487(1982),Methods in Enzymology,100,448(1983)等文献中记载的方法来进行。
天然来源的丝心蛋白为包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的蛋白质,具体而言,可列举例如昆虫或蜘蛛类所产生的丝心蛋白。
作为昆虫所产生的丝心蛋白,可列举例如:家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyxmandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、樟蚕(Eriogynapyretorum)、蓖麻蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、双黑目天蚕蛾(Caligura japonica)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)、琥珀蚕(Antheraea assama)等蚕所产生的蚕丝蛋白、及雀蜂(Vespa simillima xanthoptera)的幼虫所吐出的蜂丝蛋白。
作为昆虫所产生的丝心蛋白的更具体的例子,可列举例如:蚕·丝心蛋白L链(GenBank登录号M76430(碱基序列)、及AAA27840.1(氨基酸序列))。
作为蜘蛛类所产生的丝心蛋白,可列举例如:大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛及野岛园蛛(Araneus nojimai)等属于园蛛属(Araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛及类青新园蛛等属于新园蛛属(Neoscona属)的蜘蛛、棕类岬蛛等属于岬蛛属(Pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛及对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(Cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛及乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(Gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛及六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(Ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛及横纹金蛛等属于金蛛属(Argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(Arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(Acusilas属)的蜘蛛、摩鹿加云斑蛛、方格云斑蛛及全色云斑蛛等属于云斑蛛属(Cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(Poltys属)的蜘蛛、八疣尘蛛、四突尘蛛、圆腹尘蛛及黑尾尘蛛等属于尘蛛属(Cyclosa属)的蜘蛛、及日本壮头蛛等属于壮头蛛属(Chorizopes属)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白;以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸及鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(Tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛及小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(Leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇及斑络新妇等属于络新妇属(Nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(Menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(Dyschiriognatha属)的蜘蛛、黑寡妇蜘蛛、红背蜘蛛、几何寇蛛及间斑寇蛛等属于冠蛛属(Latrodectus属)的蜘蛛、及属于育儿网蛛属(Euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白。作为蛛丝蛋白,可列举例如:MaSp(MaSp1及MaSp2)、ADF(ADF3及ADF4)等牵引丝蛋白、MiSp(MiSp1及MiSp2)等。
作为蜘蛛类所产生的蛛丝蛋白的更具体的例子,可列举例如:fibroin-3(adf-3)[来自Araneus diadematus](GenBank登录号AAC47010(氨基酸序列)、U47855(碱基序列))、fibroin-4(adf-4)[来自Araneus diadematus](GenBank登录号AAC47011(氨基酸序列)、U47856(碱基序列))、dragline silk protein spidroin 1[来自Nephila clavipes](GenBank登录号AAC04504(氨基酸序列)、U37520(碱基序列))、major ampullate spidroin1[来自Latrodectus hesperus](GenBank登录号ABR68856(氨基酸序列)、EF595246(碱基序列))、dragline silk protein spidroin 2[来自Nephila clavata](GenBank登录号AAL32472(氨基酸序列)、AF441245(碱基序列))、major ampullate spidroin 1[来自Euprosthenops australis](GenBank登录号CAJ00428(氨基酸序列)、AJ973155(碱基序列))、及major ampullate spidroin 2[Euprosthenops australis](GenBank登录号CAM32249.1(氨基酸序列)、AM490169(碱基序列))、minor ampullate silk protein 1[Nephila clavipes](GenBank登录号AAC14589.1(氨基酸序列))、minor ampullate silkprotein 2[Nephila clavipes](GenBank登录号AAC14591.1(氨基酸序列))、minorampullate spidroin-like protein[Nephilengys cruentata](GenBank登录号ABR37278.1(氨基酸序列)等。
作为天然来源的丝心蛋白的更具体的例子,能够进一步列举NCBI GenBank中注册了序列信息的丝心蛋白。例如,能够通过从NCBI GenBank中注册的序列信息中包含INV作为DIVISION的序列中提取出在DEFINITION记载了spidroin、ampullate、fibroin、“silk及polypeptide”、或“silk及protein”作为关键字的序列、从CDS中提取出记载了特定的product的字符串、从SOURCE中提取出了在TISSUE TYPE中记载了特定的字符串的序列来确认。
本实施方式中的改性丝心蛋白可以为改性蚕丝(silk)丝心蛋白(对蚕所产生的丝蛋白的氨基酸序列进行改性而成的蛋白),也可以为改性蛛丝丝心蛋白(对蜘蛛类所产生的蛛丝蛋白的氨基酸序列进行改性而成的蛋白),也可以为丝胶除去蚕丝(silk)丝心蛋白(所谓的再生蚕丝丝心蛋白)。丝胶除去丝氨酸(silk)丝心蛋白为除去了覆盖蚕丝丝心蛋白的丝胶、及其他脂肪成分等而纯化后的蛋白。作为改性丝心蛋白,优选改性蛛丝丝心蛋白。
作为改性丝心蛋白的具体的例子,可列举:来自由蜘蛛的大壶状腺产生的大吐丝管牵引丝蛋白质的改性丝心蛋白(第一改性丝心蛋白)、具有降低了甘氨酸残基的含量的结构域序列的改性丝心蛋白(第二改性丝心蛋白)、具有降低了(A)n基序的含量的结构域序列的改性丝心蛋白(第三改性丝心蛋白)、降低了甘氨酸残基的含量及(A)n基序的含量的改性丝心蛋白(第四改性丝心蛋白)、具有包含局部疏水性指数较大的区域的结构域序列的改性丝心蛋白(第五改性丝心蛋白)、以及具有降低了谷氨酰胺残基的含量的结构域序列的改性丝心蛋白(第六改性丝心蛋白)。
作为第一改性丝心蛋白,可列举包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。在第一改性丝心蛋白中,(A)n基序的氨基酸残基数优选3~20的整数,更优选4~20的整数,进一步优选8~20的整数,更进一步优选10~20的整数,更进一步优选4~16的整数,特别优选8~16的整数,最优选10~16的整数。作为第一改性丝心蛋白,式1中,构成REP的氨基酸残基的数量优选为10~200个残基,更优选10~150个残基,进一步优选为20~100个残基,更进一步优选为20~75个残基。作为第一改性丝心蛋白,式1:[(A)n基序-REP]m所示的氨基酸序列中所含的甘氨酸残基、丝氨酸残基及丙氨酸残基的总残基数相对于氨基酸残基数整体优选为40%以上,更优选为60%以上,进一步优选为70%以上。
第一改性丝心蛋白可以为包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的氨基酸序列的单元,且C端序列为与序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列或序列号1~3中任一项所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
序列号1所示的氨基酸序列与由ADF3(GI:1263287、NCBI)的氨基酸序列的C端的50个残基的氨基酸构成的氨基酸序列相同,序列号2所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的C端起除去20个残基后的氨基酸序列相同,序列号3所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的C端除去29个残基后的氨基酸序列相同。
作为第一改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(1-i)序列号4(recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1)所示的氨基酸序列、或与(1-ii)序列号4所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。序列同一性优选为95%以上。
序列号4所示的氨基酸序列为使在N端添加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的ADF3的氨基酸序列中以使第1~13个重复区域增加至大致2倍,并且翻译在第1154个氨基酸残基终止的方式产生变异而成的氨基酸序列。序列号4所示的氨基酸序列的C端的氨基酸序列与序列号3所示的氨基酸序列相同。
(1-i)的改性丝心蛋白可以为由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白。
在第二改性丝心蛋白中,其结构域序列具有与天然来源的丝心蛋白相比降低了甘氨酸残基的含量的氨基酸序列。第二改性丝心蛋白可以具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于至少REP中的一个或多个甘氨酸残基被取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。
第二改性丝心蛋白可以为下述蛋白:其结构域序列具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于选自REP中的GGX及GPGXX(其中,G表示甘氨酸残基,P表示脯氨酸残基,X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)中的至少一个基序序列中至少一个或多个该基序序列中的一个甘氨酸残基被取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。
在第二改性丝心蛋白中,上述的甘氨酸残基被取代为其他的氨基酸残基的基序序列的比例相对于总基序序列可以为10%以上。
第二改性丝心蛋白可以具有如下氨基酸序列:包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列,将从上述结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C端为止的序列而成的序列中的全部REP中所含的由XGX(其中,X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数设为z,将从上述结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C端为止的序列而成的序列中的总氨基酸残基数设为w时,z/w为30%以上、40%以上、50%以上或50.9%以上。(A)n基序中的相对于氨基酸残基总数的丙氨酸残基数可以为83%以上,优选为86%以上,更优选为90%以上,进一步优选为95%以上,更进一步优选为100%(表示仅由丙氨酸残基构成)。
第二改性丝心蛋白优选为通过将GGX基序的一个甘氨酸残基取代为其他的氨基酸残基而提高了由XGX构成的氨基酸序列的含有比例的蛋白。在第二改性丝心蛋白中,结构域序列中的由GGX构成的氨基酸序列的含有比例优选为30%以下,更优选为20%以下,进一步优选为10%以下,更进一步优选为6%以下,更进一步优选为4%以下,特别优选为2%以下。结构域序列中的由GGX构成的氨基酸序列的含有比例能够通过与由下述XGX构成的氨基酸序列的含有比例(z/w)的计算方法相同的方法来计算。
下面,进一步详细说明z/w的计算方法。首先,在包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的丝心蛋白(改性丝心蛋白或天然来源的丝心蛋白)中,自从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的全部REP中提取出由XGX构成的氨基酸序列。构成XGX的氨基酸残基的总数为z。例如,在提取出50个由XGX构成的氨基酸序列的情况下(无重复),z为50×3=150。另外,例如,在由XGXGX构成的氨基酸序列的情况那样存在两个XGX中所含的X(中央的X)的情况下,扣除重复量来进行计算(XGXGX的情况下为5个氨基酸残基)。w为从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的总氨基酸残基数。例如,在图1所示的结构域序列的情况下,w为4+50+4+100+4+10+4+20+4+30=230(除去了位于最C端侧的(A)n基序。)。接着,通过z除以w,能够算出z/w(%)。
在此,对天然来源的丝心蛋白中的z/w进行说明。首先,如上所述,通过例示了NCBIGenBank中注册了氨基酸序列信息的丝心蛋白的方法进行确认,结果提取出了663种丝心蛋白(其中,来自蜘蛛类的丝心蛋白为415种)。在所提取出的全部的丝心蛋白中,根据包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列,且丝心蛋白中的由GGX构成的氨基酸序列的含有比例为6%以下的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列,通过上述的计算方法,计算z/w。其结果,天然来源的丝心蛋白中的z/w均低于50.9%(最高为50.86%)。
在第二改性丝心蛋白中,z/w优选为50.9%以上,更优选为56.1%以上,进一步优选为58.7%以上,更进一步优选为70%以上,更进一步优选为80%以上。z/w的上限没有特别限制,可以为例如95%以下。
第二改性丝心蛋白能够通过例如下述方法进行改性而得到:从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中取代编码甘氨酸残基的碱基序列的至少一部分以编码其他的氨基酸残基。此时,作为所改性的甘氨酸残基,可以选择GGX基序及GPGXX基序中的一个甘氨酸残基,另外,也可以进行取代以使z/w为50.9%以上。另外,也可以通过例如根据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列设计满足上述方案的氨基酸序列,并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸来得到。在任意一个情况下,均可以在除相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中将REP中的甘氨酸残基取代为其他的氨基酸残基的改性之外,进一步进行相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性。
作为上述的其他的氨基酸残基,只要其为甘氨酸残基以外的氨基酸残基,则没有特别限制,优选缬氨酸(V)残基、亮氨酸(L)残基、异亮氨酸(I)残基、蛋氨酸(M)残基、脯氨酸(P)残基、苯丙氨酸(F)残基及色氨酸(W)残基等疏水性氨基酸残基、谷氨酰胺(Q)残基、天冬酰胺(N)残基、丝氨酸(S)残基、赖氨酸(K)残基及谷氨酰胺酸(E)残基等亲水性氨基酸残基,更优选缬氨酸(V)残基、亮氨酸(L)残基、异亮氨酸(I)残基、苯丙氨酸(F)残基及谷氨酰胺(Q)残基,进一步优选谷氨酰胺(Q)残基。
作为第二改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(2-i)序列号6(Met-PRT380)、序列号7(Met-PRT410)、序列号8(Met-PRT525)或者序列号9(Met-PRT799)所示的氨基酸序列、或与(2-ii)序列号6、序列号7、序列号8或者序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
下面,对(2-i)的改性丝心蛋白进行说明。序列号6所示的氨基酸序列是将相当于天然来源的丝心蛋白的序列号10(Met-PRT313)所示的氨基酸序列的REP中的全部GGX取代为GQX而成的。序列号7所示的氨基酸序列是使序列号6所示的氨基酸序列中从N端侧向C端侧使(A)n基序每隔两个产生缺失,并进一步在C端序列的近前处插入一个[(A)n基序-REP]而成的。序列号8所示的氨基酸序列是在序列号7所示的氨基酸序列的各(A)n基序的C端侧插入两个丙氨酸残基,并进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基取代为丝氨酸(S)残基,以与序列号7的分子量大致相同的方式使C端侧的一部分氨基酸缺失而成的。序列号9所示的氨基酸序列是序列号7所示的氨基酸序列中所存在的20个结构域序列的区域(其中,该区域的C端侧的多个氨基酸残基被取代。)重复四次而成的序列的C端添加有规定的铰链序列和His标签序列而成的。
序列号10所示的氨基酸序列(相当于天然来源的丝心蛋白)中的z/w的值为46.8%。序列号6所示的氨基酸序列、序列号7所示的氨基酸序列、序列号8所示的氨基酸序列、及序列号9所示的氨基酸序列中的z/w的值分别为58.7%、70.1%、66.1%及70.0%。另外,序列号10、序列号6、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的锯齿比率(将于后文叙述)1:1.8~11.3中的x/y的值分别为15.0%、15.0%、93.4%、92.7%及89.8%。
(2-i)的改性丝心蛋白可以为由序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(2-ii)的改性丝心蛋白可以包含与序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(2-ii)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(2-ii)的改性丝心蛋白中,优选地,将与序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且REP中所含的由XGX(其中,X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数设为z,将上述结构域序列中的REP的总氨基酸残基数设为w时,z/w为50.9%以上。
第二改性丝心蛋白可以在N端及C端中任意一者或两者上包含标签序列。由此,可以进行改性丝心蛋白的分离、固定化、检测及可视化等。
作为标签序列,能够列举例如:利用与其他分子的特异性亲和性(结合性、亲和力)的亲和力标签。作为亲和力标签的具体例,能够列举组氨酸标签(His标签)。His标签为4~10个左右组氨酸残基排列而成的短肽,其具有与镍等金属离子特异性结合的性质,因此,能够用于利用金属螯合层析(chelating metal chromatography)分离改性丝心蛋白。作为标签序列的具体例,可列举例如:序列号11所示的氨基酸序列(包含His标签序列及铰链序列的氨基酸序列)。
另外,也能够利用与谷胱甘肽特异性结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、与麦芽糖特异性结合的麦芽糖结合蛋白质(MBP)等标签序列。
此外,也能够使用利用抗原抗体反应的“表位标签”。通过将显示抗原性的肽(表位)作为标签序列添加,能够结合针对该表位的抗体。作为表位标签,能够列举:HA(流感病毒的血凝素的肽序列)标签、myc标签、FLAG标签等。通过利用表位标签,能够以高特异性容易地纯化改性丝心蛋白。
此外,也能够使用用特定的蛋白酶切除标签序列后的蛋白。通过对经由该标签序列吸附的蛋白质进行蛋白酶处理,也能够回收切除标签序列后的改性丝心蛋白。
作为包含标签序列的改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(2-iii)序列号12(PRT380)、序列号13(PRT410)、序列号14(PRT525)或者序列号15(PRT799)所示的氨基酸序列、或与(2-iv)序列号12、序列号13、序列号14或者序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
序列号16(PRT313)、序列号12、序列号13、序列号14及序列号15所示的氨基酸序列为分别在序列号10、序列号6、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的N端添加有序列号11所示的氨基酸序列(包含His标签序列及铰链序列)而成的氨基酸序列。
(2-iii)的改性丝心蛋白可以为由序列号12、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(2-iv)的改性丝心蛋白包含与序列号12、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(2-iv)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(2-iv)的改性丝心蛋白中,优选地,将与序列号12、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且REP中所含的由XGX(其中,X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数设为z,将上述结构域序列中的REP的总氨基酸残基数设为w时,z/w为50.9%以上。
第二改性丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白质生产系中所生产的蛋白质释放至宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列能够根据宿主的种类适当地设置。
第三改性丝心蛋白中,其结构域序列具有与天然来源的丝心蛋白相比降低了(A)n基序的含量的氨基酸序列。第三改性丝心蛋白的结构域序列可以具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于缺失了至少一个或多个(A)n基序的氨基酸序列。
第三改性丝心蛋白可以具有相当于从天然来源的丝心蛋白中使10~40%的(A)n基序缺失的氨基酸序列。
第三改性丝心蛋白中,其结构域序列可以具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于从N端侧向C端侧至少每1~3个(A)n基序中一个(A)n基序缺失的氨基酸序列。
第三改性丝心蛋白中,其结构域序列可以具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于从N端侧向C端侧至少依次重复产生了两个连续的(A)n基序的缺失、及一个(A)n基序的缺失的氨基酸序列。
第三改性丝心蛋白中,其结构域序列可以具有相当于从N端侧向C端侧至少使(A)n基序每隔两个产生缺失的氨基酸序列。
第三改性丝心蛋白可以具有如下氨基酸序列:包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列,且,将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x,将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时,x/y为20%以上、30%以上、40%以上或50%以上,其中,从N端侧向C端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较后,将氨基酸残基数较少的REP的氨基酸残基数设为1时,另一个REP的氨基酸残基数的比为1.8~11.3。(A)n基序中的相对于氨基酸残基总数的丙氨酸残基数可以为83%以上,优选为86%以上,更优选为90%以上,进一步优选为95%以上,更进一步优选为100%(表示仅由丙氨酸残基构成)。
参考图1,对x/y的计算方法进行更详细地说明。图1中示出从改性丝心蛋白中除去N端序列及C端序列后的结构域序列。该结构域序列具有从N端侧(左侧)起为(A)n基序-第一REP(50个氨基酸残基)-(A)n基序-第二REP(100个氨基酸残基)-(A)n基序-第三REP(10个氨基酸残基)-(A)n基序-第四REP(20个氨基酸残基)-(A)n基序-第五REP(30个氨基酸残基)-(A)n基序这样的序列。
从N端侧向C端侧依次选择相邻的两个[(A)n基序-REP]单元,并使其不重复。此时,可以存在未被选择的[(A)n基序-REP]单元。图1中示出了模式1(第一REP与第二REP的比较、及第三REP与第四REP的比较)、模式2(第一REP与第二REP的比较、及第四REP与第五REP的比较)、模式3(第二REP与第三REP的比较、及第四REP与第五REP的比较)、模式4(第一REP与第二REP的比较)。需要说明的是,此外还存在其他选择方法。
接着,针对各模式,将所选择的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元中的各REP的氨基酸残基数进行比较。通过求出将氨基酸残基数更少的一者设为1时另一者的氨基酸残基数的比来进行比较。例如,在第一REP(50个氨基酸残基)与第二REP(100个氨基酸残基)比较的情况下,将氨基酸残基数更少的第一REP设为1时,第二REP的氨基酸残基数为比100/50=2。同样地,在第四REP(20个氨基酸残基)与第五REP(30个氨基酸残基)比较的情况下,将氨基酸残基数更少的第四REP设为1时,第五REP的氨基酸残基数的比为30/20=1.5。
图1中,用实线示出了将氨基酸残基数更少的一者设为1时,另一者的氨基酸残基数的比为1.8~11.3的[(A)n基序-REP]单元的组。本说明书中,将该比称为锯齿比率。用虚线示出了将氨基酸残基数更少的一者设为1时,另一者的氨基酸残基数的比低于1.8或超过11.3的[(A)n基序-REP]单元的组。
在各模式中,将用实线表示的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的全部氨基酸残基数相加(不仅是REP,还有(A)n基序的氨基酸残基数。)。并且,对相加得到的合计值进行比较,将该合计值最大的模式的合计值(合计值的最大值)设为x。在图1所示的例子中,模式1的合计值最大。
接着,通过x除以结构域序列的总氨基酸残基数y,能够算出x/y(%)。
第三改性丝心蛋白中,x/y优选为50%以上,更优选为60%以上,进一步优选为65%以上,更进一步优选为70%以上,更进一步优选为75%以上,特别优选为80%以上。x/y的上限没有特别限制,例如可以为100%以下。在锯齿比率为1:1.9~11.3的情况下,x/y优选为89.6%以上,在锯齿比率为1:1.8~3.4的情况下,x/y优选为77.1%以上,在锯齿比率为1:1.9~8.4的情况下,x/y优选为75.9%以上,在锯齿比率为1:1.9~4.1的情况下,x/y优选为64.2%以上。
在第三改性丝心蛋白为结构域序列中存在多个的(A)n基序的至少7个仅由丙氨酸残基构成的改性丝心蛋白的情况下,x/y优选为46.4%以上,更优选为50%以上,进一步优选为55%以上,更进一步优选为60%以上,更进一步优选为70%以上,特别优选为80%以上。x/y的上限没有特别限制,只要为100%以下即可。
在此,对天然来源的丝心蛋白中的x/y进行说明。首先,如上所述,利用例示出NCBIGenBank注册了氨基酸序列信息的丝心蛋白的方法进行确认后,结果提取出663种丝心蛋白(其中,来自蜘蛛类的丝心蛋白为415种)。在所提取出的全部丝心蛋白中,根据式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列构成的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列,利用上述的计算方法计算x/y。其结果,天然来源的丝心蛋白中的x/y均低于64.2%(最高为64.14%)。
第三改性丝心蛋白例如可以通过从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中使编码(A)n基序的序列的一个或多个产生了缺失以使x/y为64.2%以上而得到的。另外,也可以通过例如设计相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中使一个或多个(A)n基序产生了缺失以使x/y为64.2%以上的氨基酸序列,并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。在任意一个情况下,均可以除相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中使(A)n基序缺失的改性之外,进一步进行相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性。
作为第三改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(3-i)序列号17(Met-PRT399)、序列号7(Met-PRT410)、序列号8(Met-PRT525)或者序列号9(Met-PRT799)所示的氨基酸序列、或与(3-ii)序列号17、序列号7、序列号8或者序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
下面,对(3-i)的改性丝心蛋白进行说明。序列号17所示的氨基酸序列为从相当于天然来源的丝心蛋白的序列号10(Met-PRT313)所示的氨基酸序列中使从N端侧向C端侧使(A)n基序每隔两个产生缺失,并进一步在C端序列的近前处插入一个[(A)n基序-REP]而成的氨基酸序列。序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列如第二改性丝心蛋白中所说明那样。
序列号10所示的氨基酸序列(相当于天然来源的丝心蛋白)的锯齿比率1:1.8~11.3中的x/y的值为15.0%。序列号17所示的氨基酸序列、及序列号7所示的氨基酸序列中的x/y的值均为93.4%。序列号8所示的氨基酸序列中的x/y的值为92.7%。序列号9所示的氨基酸序列中的x/y的值为89.8%。序列号10、序列号17、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列中的z/w的值分别为46.8%、56.2%、70.1%、66.1%及70.0%。
(3-i)的改性丝心蛋白可以为由序列号17、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(3-ii)的改性丝心蛋白包含与序列号17、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(3-ii)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(3-ii)的改性丝心蛋白中,优选地,与序列号17、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x,将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时,x/y为64.2%以上,其中,从N端侧向C端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较后,将氨基酸残基数较少的REP的氨基酸残基数设为1时,另一个REP的氨基酸残基数的比为1.8~11.3(锯齿比率为1:1.8~11.3)。
第三改性丝心蛋白可以在N端及C端中任意一者或两者上包含上述的标签序列。
作为包含标签序列的改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(3-iii)序列号18(PRT399)、序列号13(PRT410)、序列号14(PRT525)或者序列号15(PRT799)所示的氨基酸序列、或与(3-iv)序列号18、序列号13、序列号14或者序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
序列号18、序列号13、序列号14及序列号15所示的氨基酸序列为分别在序列号17、序列号7、序列号8及序列号9所示的氨基酸序列的N端添加有序列号11所示的氨基酸序列(包含His标签序列及铰链序列)而成的氨基酸序列。
(3-iii)的改性丝心蛋白可以为由序列号18、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(3-iv)的改性丝心蛋白包含与序列号18、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(3-iv)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(3-iv)的改性丝心蛋白中,优选地,将与序列号18、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加的合计值的最大值设为x,将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时,x/y为64.2%以上,其中,从N端侧向C端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较后,将氨基酸残基数较少的REP的氨基酸残基数设为1时,另一个REP的氨基酸残基数的比为1.8~11.3。
第三改性丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白质生产系中所生产的蛋白质释放至宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列能够根据宿主的种类适当地设置。
第四改性丝心蛋白中,其结构域序列具有与天然来源的丝心蛋白相比除降低了(A)n基序的含量之外,还降低了甘氨酸残基的含量的氨基酸序列。第四改性丝心蛋白的结构域序列可以具有相当于与天然来源的丝心蛋白相比除缺失了至少一个或多个(A)n基序之外,进一步将REP中的至少一个或多个甘氨酸残基取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。即,第四改性丝心蛋白为兼具上述的第二改性丝心蛋白和第三改性丝心蛋白的特征的改性丝心蛋白。具体的方案等如第二改性丝心蛋白、及第三改性丝心蛋白中所述。
作为第四改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(4-i)序列号7(Met-PRT410)、序列号8(Met-PRT525)、序列号9(Met-PRT799)、序列号13(PRT410)、序列号14(PRT525)或者序列号15(PRT799)所示的氨基酸序列、或与(4-ii)序列号7、序列号8、序列号9、序列号13、序列号14或者序列号15所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。包含序列号7、序列号8、序列号9、序列号13、序列号14或序列号15所示的氨基酸序列的改性丝心蛋白的具体的方案如上所述。
第五改性丝心蛋白可以为如下蛋白:其结构域序列具有包含局部疏水性指数较大的区域的氨基酸序列,该氨基酸序列相当于与天然来源的丝心蛋白相比,REP中的一个或多个氨基酸残基被取代为疏水性指数较大的氨基酸残基、及/或REP中插入有一个或多个疏水性指数较大的氨基酸残基。
局部疏水性指数较大的区域优选由连续的2~4个氨基酸残基构成。
上述的疏水性指数较大的氨基酸残基优选为选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)及丙氨酸(A)的氨基酸残基。
在第五改性丝心蛋白中,除相当于与天然来源的丝心蛋白相比,REP中的一个或多个氨基酸残基被取代为疏水性指数较大的氨基酸残基、及/或REP中插入有一个或多个疏水性指数较大的氨基酸残基的改性之外,可以进一步具有相当于与天然来源的丝心蛋白相比取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性。
第五改性丝心蛋白能够通过例如从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中将REP中的一个或多个亲水性氨基酸残基(例如,疏水性指数为负的氨基酸残基)取代为疏水性氨基酸残基(例如,疏水性指数为正的氨基酸残基)、及/或在REP中插入一个或多个疏水性氨基酸残基而得到。另外,也能够通过例如设计相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中将REP中的一个或多个亲水性氨基酸残基取代为疏水性氨基酸残基、及/或REP中插入有一个或多个疏水性氨基酸残基的氨基酸序列,并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸来得到。在任意一个情况下,均可以在除相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中将REP中的一个或多个亲水性氨基酸残基取代为疏水性氨基酸残基、及/或在REP中插入有一个或多个疏水性氨基酸残基的改性之外,进一步进行相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性。
第五改性丝心蛋白可以具有下述氨基酸序列:在包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列,且从上述结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的全部REP中,将连续4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中所含的氨基酸残基的总数设为p,将从上述结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的氨基酸残基的总数设为q时,p/q为6.2%以上。
关于氨基酸残基的疏水性指数,使用公知的指数(Hydropathy index:Kyte J,&Doolittle R(1982)“A simple method for displaying the hydropathic character ofa protein”,J.Mol.Biol.,157,pp.105-132)。具体而言,各氨基酸的疏水性指数(hydropathy index,以下,也记作“HI”。)如下述表1所示。
[表1]
氨基酸
HI
氨基酸
HI
异亮氨酸(Ile)
4.5
色氨酸(Trp)
-0.9
缬氨酸(Val)
4.2
酪氨酸(Tyr)
-1.3
亮氨酸(Leu)
3.8
脯氨酸(Pro)
-1.6
苯丙氨酸(Phe)
2.8
组氨酸(His)
-3.2
半胱氨酸(Cys)
2.5
天冬酰胺(Asn)
-3.5
蛋氨酸(Met)
1.9
天冬氨酸(Asp)
-3.5
丙氨酸(Ala)
1.8
谷氨酰胺(Gln)
-3.5
甘氨酸(Gly)
-0.4
谷氨酸(Glu)
-3.5
苏氨酸(Thr)
-0.7
赖氨酸(Lys)
-3.9
丝氨酸(Ser)
-0.8
精氨酸(Arg)
-4.5
下面,进一步详细说明p/q的计算方法。计算中使用从式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列中除去从位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列(以下,称为“序列A”)。首先,在序列A中所含的全部REP中,计算连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值。疏水性指数的平均值通过连续的4个氨基酸残基中所含的各氨基酸残基的HI的总和除以4(氨基酸残基数)而求得。疏水性指数的平均值针对全部的连续4个氨基酸残基而求得(各氨基酸残基用于计算1~4个平均值。)。接着,确定连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域。即使在某个氨基酸残基相当于多个“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”的情况下,该某个氨基酸残基也作为1个氨基酸残基包含于区域中。并且,该区域中所含的氨基酸残基的总数为p。另外,序列A中所含的氨基酸残基的总数为q。
例如,在“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”提取了20处的情况下(无重复),在连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中包含20个连续的4个氨基酸残基(无重复),p为20×4=80。另外,例如,在两个“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”重复存在一个氨基酸残基的情况下,在连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中包含7个氨基酸残基(p=2×4-1=7。“-1”表示扣除重复量。)。例如,在图2所示的结构域序列的情况下,“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”无重复地存在7个,因此,p为7×4=28。另外,例如,在图2所示的结构域序列的情况下,q为4+50+4+40+4+10+4+20+4+30=170(不包含存在于C端侧的最后的(A)n基序)。接着,p除以q,由此能够算出p/q(%)。在图2的情况下,28/170=16.47%。
在第五改性丝心蛋白中,p/q优选为6.2%以上,更优选为7%以上,进一步优选为10%以上,更进一步优选为20%以上,更进一步优选为30%以上。p/q的上限不受特别限制,可以为例如45%以下。
第五改性丝心蛋白能够通过例如以满足上述的p/q的条件的方式,将REP中的一个或多个亲水性氨基酸残基(例如,疏水性指数为负的氨基酸残基)取代为疏水性氨基酸残基(例如,疏水性指数为正的氨基酸残基)、及/或在REP中插入一个或多个疏水性氨基酸残基,将克隆出的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列改性于包含局部疏水性指数较大的区域的氨基酸序列来得到。另外,还可以通过例如根据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列设计满足上述的p/q的条件的氨基酸序列,并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。在任意一个情况下,均可以在除相当于与天然来源的丝心蛋白相比REP中的一个或多个氨基酸残基被取代为疏水性指数较大的氨基酸残基、及/或REP中插入有一个或多个疏水性指数较大的氨基酸残基的改性之外,进一步进行相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的改性。
作为疏水性指数较大的氨基酸残基,没有特别限制,优选异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)及丙氨酸(A),更优选缬氨酸(V)、亮氨酸(L)及异亮氨酸(I)。
作为第五改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(5-i)序列号19(Met-PRT720)、序列号20(Met-PRT665)或者序列号21(Met-PRT666)所示的氨基酸序列、或与(5-ii)序列号19、序列号20或者序列号21所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
下面,对(5-i)的改性丝心蛋白进行说明。序列号19所示的氨基酸序列是对于序列号7(Met-PRT410)所示的氨基酸序列除去C端侧的端末的结构域序列,每隔一个REP分别插入两处由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI),并进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基取代为丝氨酸(S)残基,且使C端侧的一部分氨基酸缺失而成的。序列号20所示的氨基酸序列是对于序列号8(Met-PRT525)所示的氨基酸序列每隔一个REP分别插入一个由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而成的。序列号21所示的氨基酸序列是对于序列号8所示的氨基酸序列每隔一个REP分别插入两处由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而成的。
(5-i)的改性丝心蛋白可以为由序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(5-ii)的改性丝心蛋白包含与序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(5-ii)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(5-ii)的改性丝心蛋白中,优选地,在具有与序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的全部REP中,在将连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中所含的氨基酸残基的总数设为p,将从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的氨基酸残基的总数设为q时,p/q为6.2%以上。
第五改性丝心蛋白可以在N端及C端中任意一者或两者上包含标签序列。
作为包含标签序列的改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(5-iii)序列号22(PRT720)、序列号23(PRT665)或者序列号24(PRT666)所示的氨基酸序列、或与(5-iv)序列号22、序列号23或者序列号24所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
序列号22、序列号23及序列号24所示的氨基酸序列为分别在序列号19、序列号20及序列号21所示的氨基酸序列的N端添加有序列号11所示的氨基酸序列(包含His标签序列及铰链序列)而成的氨基酸序列。
(5-iii)的改性丝心蛋白可以为由序列号22、序列号23或序列号24所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(5-iv)的改性丝心蛋白包含与序列号22、序列号23或序列号24所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(5-iv)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
在(5-iv)的改性丝心蛋白中,优选地,在与序列号22、序列号23或序列号24所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性,且从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的全部REP中,将连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中所含的氨基酸残基的总数设为p,将从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的氨基酸残基的总数设为q时,p/q优选为6.2%以上。
第五改性丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白质生产系中所生产的蛋白质释放至宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列能够根据宿主的种类适当地设置。
第六改性丝心蛋白具有与天然来源的丝心蛋白相比降低了谷氨酰胺残基的含量的氨基酸序列。
第六改性丝心蛋白优选在REP的氨基酸序列中包含选自GGX基序及GPGXX基序中的至少一个基序。
在第六改性丝心蛋白的REP中包含GPGXX基序的情况下,GPGXX基序含有率通常为1%以上,可以为5%以上,优选为10%以上。GPGXX基序含有率的上限没有特别限制,可以为50%以下,也可以为30%以下。
本说明书中,“GPGXX基序含有率”为通过以下的方法而算出的值。
在包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的丝心蛋白(改性丝心蛋白或天然来源的丝心蛋白)中,在从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列中所含的全部REP中,将该区域中所含的GPGXX基序的个数的总数乘以3得到的数(即,相当于GPGXX基序中的G及P的总数)设为s,将从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列,并进一步除去(A)n基序后的全部REP的氨基酸残基的总数设为t,此时,作为s/t计算GPGXX基序含有率。
计算GPGXX基序含有率时,由于“从位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列”(相当于REP的序列)中具有与丝心蛋白的特征性的序列的相关性较低的序列,在m较小的情况下(即,结构域序列较短的情况下),会影响GPGXX基序含有率的计算结果,因此,为了排除该影响,将“从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列”作为对象。需要说明的是,在“GPGXX基序”位于REP的C端的情况下,即使在“XX”为例如“AA”的情况下,也作为“GPGXX基序”处理。
图3为示出改性丝心蛋白的结构域序列的示意图。参考图3对GPGXX基序含有率的计算方法进行具体地说明。首先,在图3所示的改性丝心蛋白的结构域序列(“[(A)n基序-REP]m-(A)n基序”类型。)中,全部的REP包含于“从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列”(图3中,由“区域A”所示的序列。)中,因此,用于计算s的GPGXX基序的个数为7,s为7×3=21。同理,全部的REP包含于“从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列”(图3中,由“区域A”所示的序列。)中,因此,从该序列中进一步除去(A)n基序后的全部REP的氨基酸残基的总数t为50+40+10+20+30=150。接着,通过s除以t,能够算出s/t(%),在图3的改性丝心蛋白的情况下,21/150=14.0%。
在第六改性丝心蛋白中,谷氨酰胺残基含有率优选为9%以下,更优选为7%以下,进一步优选为4%以下,特别优选为0%。
本说明书中,“谷氨酰胺残基含有率”为通过以下的方法而算出的值。
在包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的丝心蛋白(改性丝心蛋白或天然来源的丝心蛋白)中,在从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列(相当于图5的“区域A”的序列。)中所含的全部REP中,将该区域中所含的谷氨酰胺残基的总数设为u,将从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列,并进一步除去(A)n基序后的全部REP的氨基酸残基的总数设为t,此时,作为u/t计算谷氨酰胺残基含有率。计算谷氨酰胺残基含有率时,将“从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列”作为对象的理由与上述的理由相同。
在第六改性丝心蛋白中,其结构域序列可以具有相当于与天然来源的丝心蛋白相比缺失了REP中的一个或多个谷氨酰胺残基、或将其取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。
“其他的氨基酸残基”只要为谷氨酰胺残基以外的氨基酸残基即可,优选为疏水性指数大于谷氨酰胺残基的氨基酸残基。氨基酸残基的疏水性指数如表1所示。
如表1所示,作为疏水性指数大于谷氨酰胺残基的氨基酸残基,能够列举选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、脯氨酸(P)及组氨酸(H)的氨基酸残基。其中,更优选为选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)及丙氨酸(A)的氨基酸残基,进一步优选为选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)及苯丙氨酸(F)的氨基酸残基。
在第六改性丝心蛋白中,REP的疏水性度优选为-0.8以上,更优选为-0.7以上,进一步优选为0以上,更进一步优选为0.3以上,特别优选为0.4以上。REP的疏水性度的上限没有特别限制,可以为1.0以下,也可以为0.7以下。
本说明书中,“REP的疏水性度”为通过以下的方法而算出的值。
在包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的丝心蛋白(改性丝心蛋白或天然来源的丝心蛋白)中,在从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列(相当于图3的“区域A”的序列。)中所含的全部REP中,在将该区域的各氨基酸残基的疏水性指数的总和设为v,将从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列,并进一步除去(A)n基序后的全部REP的氨基酸残基的总数设为t,此时,作为v/t计算REP的疏水性度。计算REP的疏水性度时,将“从结构域序列中除去自位于最C端侧的(A)n基序至结构域序列的C端为止的序列而成的序列”作为对象的理由与上述的理由相同。
在第六改性丝心蛋白中,其结构域序列除相当于与天然来源的丝心蛋白相比缺失了REP中的一个或多个谷氨酰胺残基、及/或将REP中的一个或多个谷氨酰胺残基取代为其他氨基酸残基的改性之外,还可以进一步具有相当于取代、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改性。
第六改性丝心蛋白通过例如能够从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中使REP中的一个或多个谷氨酰胺残基缺失、及/或将REP中的一个或多个谷氨酰胺残基取代为其他氨基酸残基而得到。另外,也能够通过例如设计相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中缺失REP中的一个或多个谷氨酰胺残基、及/或将REP中的一个或多个谷氨酰胺残基取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列,并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。
作为第六改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含(6-i)序列号25(Met-PRT888)、序列号26(Met-PRT965)、序列号27(Met-PRT889)、序列号28(Met-PRT916)、序列号29(Met-PRT918)、序列号30(Met-PRT699)、序列号31(Met-PRT698)、序列号32(Met-PRT966)、序列号41(Met-PRT917)或者序列号42(Met-PRT1028)所示的氨基酸序列的改性丝心蛋白、或包含与(6-ii)序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号41或者序列号42所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
下面,对(6-i)的改性丝心蛋白进行说明。序列号25所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列(Met-PRT410)中的QQ全部取代为VL而成的。序列号26所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为TS,且将剩余的Q取代为A而成的。序列号27所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为VL,且将剩余的Q取代为I而成的。序列号28所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为VI,且将剩余的Q取代为L而成的。序列号29所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为VF,且将剩余的Q取代为I而成的。
序列号30所示的氨基酸序列是将序列号8所示的氨基酸序列(Met-PRT525)中的QQ全部取代为VL而成的。序列号31所示的氨基酸序列是将序列号8所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为VL,且将剩余的Q取代为I而成的。
序列号32所示的氨基酸序列是将序列号7所示的氨基酸序列(Met-PRT410)中存在的20个结构域序列的区域重复两次而成的序列中的QQ全部取代为VF,且将剩余的Q取代为I而成的。
序列号41所示的氨基酸序列(Met-PRT917)是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为LI,且将剩余的Q取代为V而成的。序列号42所示的氨基酸序列(Met-PRT1028)是将序列号7所示的氨基酸序列中的QQ全部取代为IF,且将剩余的Q取代为T而成的。
序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号41及序列号42所示的氨基酸序列的谷氨酰胺残基含有率均为9%以下(表2)。
[表2]
改性丝心蛋白
谷氨酰胺残基含有率
GPGXX基序含有率
REP的疏水性度
Met-PRT410(序列号7)
17.7%
27.9%
-1.52
Met-PRT888(序列号25)
6.3%
27.9%
-0.07
Met-PRT965(序列号26)
0.0%
27.9%
-0.65
Met-PRT889(序列号27)
0.0%
27.9%
0.35
Met-PRT916(序列号28)
0.0%
27.9%
0.47
Met-PRT918(序列号29)
0.0%
27.9%
0.45
Met-PRT699(序列号30)
3.6%
26.4%
-0.78
Met-PRT698(序列号31)
0.0%
26.4%
-0.03
Met-PRT966(序列号32)
0.0%
28.0%
0.35
Met-PRT917(序列号41)
0.0%
27.9%
0.46
Met-PRT1028(序列号42)
0.0%
28.1%
0.05
(6-i)的改性丝心蛋白可以为由序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号41或序列号42所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(6-ii)的改性丝心蛋白可以包含与序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号41或序列号42所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(6-ii)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
(6-ii)的改性丝心蛋白的谷氨酰胺残基含有率优选为9%以下。另外,(6-ii)的改性丝心蛋白的GPGXX基序含有率优选为10%以上。
第六改性丝心蛋白可以在N端及C端中任意一者或两者上包含标签序列。由此,可以进行改性丝心蛋白的分离、固定化、检测及可视化等。
作为包含标签序列的改性丝心蛋白的更具体的例子,能够列举包含与(6-iii)序列号33(PRT888)、序列号34(PRT965)、序列号35(PRT889)、序列号36(PRT916)、序列号37(PRT918)、序列号38(PRT699)、序列号39(PRT698)、序列号40(PRT966)、序列号43(PRT917)或者序列号44(PRT1028)所示的氨基酸序列的改性丝心蛋白、或包含与(6-iv)序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号43或者序列号44所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列的改性丝心蛋白。
序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号43及序列号44所示的氨基酸序列为分别在序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号41及序列号42所示的氨基酸序列的N端添加有序列号11所示的氨基酸序列(包含His标签序列及铰链序列)而成的氨基酸序列。由于仅在N端添加有标签序列,因此,谷氨酰胺残基含有率没有变化,序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号43及序列号44所示的氨基酸序列的谷氨酰胺残基含有率均为9%以下(表3)。
[表3]
改性丝心蛋白
谷氨酰胺残基含有率
GPGXX基序含有率
REP的疏水性度
PRT888(序列号33)
6.3%
27.9%
-0.07
PRT965(序列号34)
0.0%
27.9%
-0.65
PRT889(序列号35)
0.0%
27.9%
0.35
PRT916(序列号36)
0.0%
27.9%
0.47
PRT918(序列号37)
0.0%
27.9%
0.45
PRT699(序列号38)
3.6%
26.4%
-0.78
PRT698(序列号39)
0.0%
26.4%
-0.03
PRT966(序列号40)
0.0%
28.0%
0.35
PRT917(序列号43)
0.0%
27.9%
0.46
PRT1028(序列号44)
0.0%
28.1%
0.05
(6-iii)的改性丝心蛋白可以为由序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号43或序列号44所示的氨基酸序列构成的蛋白。
(6-iv)的改性丝心蛋白包含与序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号43或序列号44所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列。另外,(6-iv)的改性丝心蛋白也是包含式1:[(A)n基序-REP]m、或式2:[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所示的结构域序列的蛋白质。上述序列同一性优选为95%以上。
(6-iv)的改性丝心蛋白的谷氨酰胺残基含有率优选为9%以下。另外,(6-iv)的改性丝心蛋白的GPGXX基序含有率优选为10%以上。
第六改性丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白质生产系中生产的蛋白质释放至宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列能够根据宿主的种类适当地设置。
改性丝心蛋白可以为兼备第一改性丝心蛋白、第二改性丝心蛋白、第三改性丝心蛋白、第四改性丝心蛋白、第五改性丝心蛋白、及第六改性丝心蛋白所具有的特征中的至少两个以上特征的改性丝心蛋白。
改性丝心蛋白可以为亲水性改性丝心蛋白,也可以为疏水性改性丝心蛋白。“疏水性改性丝心蛋白”是求得构成改性丝心蛋白的全部氨基酸残基的疏水性指数(HI)的总和,接着该总和除以氨基酸残基总数而得到的值(平均HI)0以上的改性丝心蛋白。疏水性指数如表1所示。另外,“亲水性改性丝心蛋白”是指上述平均HI低于0的改性丝心蛋白。
作为疏水性改性丝心蛋白,能够列举例如:上述的第六改性丝心蛋白。作为疏水性改性丝心蛋白的更具体的例子,可列举包含下述氨基酸序列的改性丝心蛋白:序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33或序列号43所示的氨基酸配列、序列号35、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41或序列号44所示的氨基酸配列。
作为亲水性改性丝心蛋白,能够列举:上述的第一改性丝心蛋白、第二改性丝心蛋白、第三改性丝心蛋白、第四改性丝心蛋白、及第五改性丝心蛋白。作为亲水性改性丝心蛋白的更具体的例子,可列举包含下述氨基酸配列的改性丝心蛋白:序列号4所示的氨基酸配列、序列号6、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸配列、序列号13、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸配列、序列号18、序列号7、序列号8或序列号9所示的氨基酸配列、序列号17、序列号11、序列号14或序列号15所示的氨基酸配列、序列号19、序列号20或序列号21所示的氨基酸配列。
(蛋白质的制造方法)
蛋白质也可以通过例如利用宿主表达核酸的方法来生产,其中,该宿主是被表达载体转化而成的,该表达载体具有编码该蛋白质的核酸序列和可操作地连接于该核酸序列的一个或多个调控序列。
编码蛋白质的基因的制造方法不受特别限制。能够通过例如利用编码天然的结构蛋白质的基因,通过聚合酶链式反应(PCR)等进行扩增并克隆的方法、或化学合成的方法来制造基因。基因的化学合成方法也不受特别限制,例如,能够基于从NCBI的网络数据库等中获得的结构蛋白的氨基酸序列信息,将由AKTA oligopilot plus 10/100(GE HEALTHCAREJAPAN株式会社)等自动合成的寡核苷酸用PCR等连接的方法来化学合成基因。此时,为了方便蛋白质的纯化及/或确认,也可以合成用于编码蛋白质的基因,该蛋白质由在上述的氨基酸序列的N端添加有由起始密码子及His10标签构成的氨基酸序列而成的氨基酸序列构成。
调控序列为控制宿主中的蛋白质的表达的序列(例如,启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等),能够根据宿主的种类适当地选择。作为启动子,可以使用在宿主细胞中起作用,并可以诱导表达蛋白质的诱导型启动子。诱导型启动子是能够通过存在诱导物质(表达诱导剂)、不存在阻遏分子、或升高或者降低温度、渗透压或者pH值等物理因素来控制转录的启动子。
表达载体的种类为质粒载体、病毒载体、粘粒载体、fosmid载体、人工染色体载体等,能够根据宿主的种类适当地选择。作为表达载体,优选使用可以在宿主细胞中独立复制、或可以向宿主的染色体中整合,并在能够转录编码蛋白的核酸的位置处含有启动子的载体。
作为宿主,原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞及植物细胞等真核生物均能够优选使用。
作为原核生物的优选例子,能够列举:属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属及假单胞菌属等的细菌。作为属于埃希氏菌属的微生物,能够列举例如大肠杆菌等。作为属于短芽孢杆菌属的微生物,能够列举例如土壤短芽孢杆菌等。作为属于沙雷氏菌属的微生物,能够列举例如液化沙雷氏菌等。作为属于芽孢杆菌属的微生物,能够列举例如草芽孢杆菌等。作为示于微杆菌属的微生物,能够列举例如嗜氨微杆菌等。作为属于短杆菌属的微生物,能够列举例如叉开短杆菌等。作为属于棒杆菌属的微生物,能够列举例如产氨棒杆菌等。作为属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物,能够列举例如恶臭假单胞菌等。
在将原核生物作为宿主的情况下,作为导入编码重组蛋白的核酸的载体,能够列举例如:pBTrp2(Boehringer Mannheim公司制造)、pGEX(Pharmacia公司制造)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
作为真核生物的宿主,能够列举例如酵母及丝状真菌(霉菌等)。作为酵母,能够列举例如:属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属等的酵母。作为丝状真菌,能够列举例如:属于曲霉属、青霉属、木霉(Trichoderma)属等的丝状真菌。
在将真核生物作为宿主的情况下,作为导入编码蛋白质的核酸的载体,能够列举例如:YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等。作为提高述宿主细胞导入表达载体的方法,只要为提高述宿主细胞导入DNA的方法,则均能够使用。能够列举例如:使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)〕、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、乙酸锂法、感受态法等。
作为利用被表达载体转化的宿主表达核酸的方法,除直接表达之外,还能够依据分子克隆第2版中记载的方法等,进行分泌生产、融合蛋白质表达等。
蛋白质能够通过例如将被表达载体转化后的宿主在培养用培养基中培养,使蛋白质在培养用培养基中生成及积蓄,并从该培养用培养基中采集该蛋白质而制造。在培养用培养基中培养宿主的方法能够按照培养宿主时通常所使用的方法来进行。
在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下,作为培养用培养基,只要为含有宿主能够同化的碳源、氮源及无机盐类等,并能够高效地培养宿主的培养基,则可以使用天然培养基及合成培养基的任意一种。
作为碳源,只要为上述转化微生物能够同化的物质即可,能够使用例如:葡萄糖、果糖、蔗糖、及含有这些的糖蜜、淀粉及淀粉水解物等碳水化合物、乙酸及丙酸等有机酸、以及乙醇及丙醇等醇类。作为氮源,能够使用例如:氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵及磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕及豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物。作为无机盐类,能够使用例如:磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜及碳酸钙。
大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养能够在例如振荡培养或深部通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度为例如15~40℃。培养时间通常为16小时~7天。培养中的培养用培养基的pH优选保持为3.0~9.0。培养用培养基的pH的调节能够使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙及氨等来进行。
另外,培养期间,可以根据需要向培养用培养基中添加氨苄青霉素及四环素等抗生素。在培养被使用诱导型启动子作为启动子的表达载体转化后的微生物时,也可以根据需要向培养基中添加诱导剂。例如,在培养被使用lac启动子的表达载体转化后的微生物时,可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等,在培养被使用trp启动子的表达载体转化后的微生物时,可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
表达后的蛋白质的分离及纯化能够通过通常所使用的的方法来进行。例如,在该蛋白质在细胞内以溶解状态表达的情况下,培养结束后,通过离心分离回收宿主细胞,并将其悬浮于水系缓冲液之后,通过超声波破碎机、French press、manton-gaulin匀浆器及戴诺研磨机(dyno-mill)等将宿主细胞破碎,得到无细胞提取液。通过将该无细胞提取液离心分离得到上清,单独或组合使用通常用于蛋白质的分离纯化的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、二乙胺基乙基(DEAE)-琼脂糖、使用DIAION HPA-75(三菱化成公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法、等电聚焦电泳等电泳法等方法,能够从上清中得到纯化标准品。
另外,在蛋白质在细胞内形成不溶体而表达的情况下,同样在回收宿主细胞之后,将其破碎并进行离心分离,由此作为沉淀级分回收蛋白质的不溶体。回收的蛋白质的不溶体能够被蛋白质改性剂可溶化。该操作之后,能够通过与上述相同的分离纯化法得到蛋白质的纯化标准品。在该蛋白质被分泌至细胞外的情况下,能够从培养上清中回收该蛋白质。即,能够通过利用离心分离等手法处理培养物而取得培养上清,并通过使用与上述相同的分离纯化法从该培养上清中得到纯化标准品。
(原料组合物的制造方法)
本实施方式中,原料组合物的制造方法不受特别限定,可以为例如包含以下的各工序的方法。
[溶解工序]
溶解工序为将蛋白质溶解于溶剂(例如,甲酸等羧酸)而得到蛋白质溶液的工序。
溶解工序中,作为溶解的蛋白质(以下,也称为“以下,目标蛋白质”。),可以使用纯化后的蛋白质,也可以使用表达蛋白质(重组蛋白质)的宿主细胞中的蛋白质。纯化后的蛋白质可以为由表达蛋白质的宿主细胞纯化而成的蛋白质。在将宿主细胞中的蛋白质作为目标蛋白质并使之溶解的情况下,使宿主细胞与溶剂接触,从而将该宿主细胞中的蛋白质溶解于溶剂。宿主细胞只要为表达目标蛋白质的细胞即可,例如可以为无损的细胞,也可以为进行了破坏处理等处理之后的细胞。另外,还可以为已经进行了简单的纯化处理的细胞。
作为由表达蛋白质的宿主细胞纯化蛋白质的方法,其不受特别限定,能够使用例如专利第6077570号公报及专利第6077569号公报中记载的方法等。
在溶解工序中使用甲酸等羧酸作为溶剂的情况下,通过使蛋白质中的氢氧基与羧酸进行脱水缩合反应来形成经酯化的蛋白质。作为羧酸,能够使用例如:甲酸、乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、苯甲酸等单羧酸;癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、蜡酸、褐煤酸、蜂花酸及三十六烷酸等饱和脂肪族羧酸;十一烯酸、油酸、反油酸、鲸蜡油酸、芥酸、反芜酸、山梨酸、亚油酸、亚麻酸、花生四稀酸、丙炔酸及硬脂炔酸等不饱和脂肪族羧酸;以及草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一酸、巴拉西酸、马来酸、富马酸及戊烯二酸等二羧酸。羧酸也可以采用酸酐或酰氯的形式。
溶解工序可以在室温下实施,也可以保持在各种加热温度而使蛋白质溶解于溶剂。加热温度的保持时间不受特别限定,可以为10分钟以上,若考虑到产业化生产,则优选10~120分钟,更优选10~60分钟,进一步优选10~30分钟。加热温度的保持时间可以在使蛋白质充分溶解,且夹杂物(目标蛋白质以外的物质)的溶解较少的条件适当地设置。
为了溶解蛋白质而添加的溶剂的添加量只要为能够溶解蛋白质的量,则不受特别限定。
在溶解纯化后的蛋白质的情况下,作为溶剂的添加量,以溶剂的体积(mL)与蛋白质(包含蛋白质的干燥粉末)的重量(g)的比(体积(mL)/重量(g))计,可以为1~100倍、1~50倍、1~25倍、1~10倍、1~5倍。
在溶解表达蛋白质的宿主细胞中的蛋白质的情况下,作为溶剂的添加量,以溶剂(mL)与宿主细胞的重量(g)的比(体积(mL)/重量(g))计,可以为1~100倍、1~50倍、1~25倍、1~10倍、1~5倍。
溶剂可以包含有无机盐。通过向溶剂中添加无机盐,可以提高蛋白质的溶解性。
作为能够添加于溶剂的无机盐,能够列举:碱金属卤化物、碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐、硫氰酸盐、高氯酸盐等。
作为碱金属卤化物,能够列举例如:溴化钾、溴化钠、溴化锂、氯化钾、氯化钠、氯化锂、氟化钠、氟化钾、氟化铯、碘化钾、碘化钠、碘化锂等。
作为碱土金属卤化物,能够列举例如:氯化钙、氯化镁、溴化镁、溴化钙、碘化镁、碘化钙等。
作为碱土金属硝酸盐,能够列举例如:硝酸钙、硝酸镁、硝酸锶、硝酸钡等。
作为硫氰酸盐,能够列举例如:硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸胍等。
作为高氯酸盐,能够列举例如:高氯酸铵、高氯酸钾、高氯酸钙、高氯酸銀、高氯酸钠、高氯酸镁等。
这些无机盐可以单独使用一种,也可以并用两种以上。
作为优选的无机盐,可列举碱金属卤化物及碱土金属卤化物。作为优选的无机盐的具体例,能够列举氯化锂、氯化钙等。
无机盐的添加量(含量)相对于溶剂的总质量可以为0.5质量%以上且10质量%以下、或0.5质量%以上且5质量%以下。
蛋白质溶液可以根据需要除去不溶物。即,原料组合物的制造方法可以在溶解工序后根据需要包含从蛋白质溶液中除去不溶物的工序。作为从蛋白质溶液中除去不溶物的方法,可列举:离心分离、鼓式过滤器、压滤机等过滤器过滤等一般方法。在利用过滤器过滤的情况下,能够通过并用寅式盐、硅藻土等过滤助剂及预涂剂等来更高效地从蛋白质溶液中除去不溶物。
蛋白质溶液可以包含蛋白质及溶解其的溶剂(溶解用溶剂)。蛋白质溶液可以在溶解工序中包含与蛋白质共同含有的夹杂物。蛋白质溶液可以为原料组合物的成型用溶液。
蛋白质溶液中的蛋白质的含量相对于蛋白质溶液总量可以为5质量%以上且35质量%以下、5质量%以上且50质量%以下、10质量%以上且40质量%以下或15质量%以上且35质量%以下。
添加有酯基的蛋白质的生成方法不受特别限定,可以为通过在上述的溶解工序使用甲酸等羧酸作为溶剂来生成的方法,也可以为除了在上述的溶解工序中生成的方法以外的方法。作为这种方法,可以为例如:在使丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸等具有氢氧基的蛋白质与选自由羧酸、酸酐、及酰氯构成的组中的至少一种进行反应的工序中生成的方法。
[成型工序]
成型工序为使用蛋白质溶液来成型原料组合物的工序。作为原料组合物的形状,其不受特别限定,能够列举例如:纤维、薄膜、模塑成型体、凝胶、多孔体、粒子等。
蛋白质溶液优选根据所成型的原料组合物的用途来调节蛋白质的浓度及粘度。
作为调节蛋白质溶液中的蛋白质的浓度的方法,不受特别限定,可列举例如:通过利用蒸馏使溶剂挥发来提高蛋白质浓度的方法、在溶解工序中使用高蛋白质浓度的方法、或使溶剂的添加量相对于蛋白质的量较少的方法等。
适合纺丝的粘度一般在40℃下为1000~50,000cP(厘泊),粘度能够使用例如京都电子工业公司制造的商品名“EMS粘度计”来测定。在蛋白质溶液的粘度不在上述的范围内的情况下,可以将蛋白质溶液的粘度调节为能够纺丝的粘度。粘度的调节能够使用上述的方法等。溶剂可以包含有上述所示例的优选的无机盐。
在上述所成型的原料组合物为原料(原料纤维)的情况下,可以根据需要将蛋白质溶液中的蛋白质含量(浓度)调节为可以纺丝的浓度及粘度。调节蛋白质的浓度及粘度的方法不受特别限定。另外,作为纺丝方法,可列举湿法纺丝等。若将调节至适合纺丝的浓度及粘度的蛋白质溶液作为纺丝液而赋予给凝固液,则蛋白质凝固。此时,通过将蛋白质溶液作为丝状的液体赋予给凝固液,能够使蛋白质凝固为丝状,从而形成纱线(未拉伸纱)。未拉伸纱的形成能够依据例如专利第5584932号公报中记载的方法来进行。
以下,将示出湿法纺丝的例子,但纺丝的方法不受特别限定,也可以为干湿法纺丝等。
湿法纺丝-拉伸
(a)湿法纺丝
凝固液只要为能够脱溶剂的溶液即可。凝固液优选使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数1~5的低级醇或丙酮。凝固液可以含有水。从纺丝的稳定性的观点出发,凝固液的温度优选5~30℃。
将蛋白质溶液作为丝状的液体而赋予的方法不受特别限定,可列举例如从纺丝用的喷头挤压(喷出)至脱溶剂槽的凝固液的方法。通过使蛋白质凝固得到未拉伸纱。将蛋白质溶液挤压(喷出)至凝固液时的挤压(喷出)速度能够根据喷头的直径及蛋白质溶液的粘度等适当地设置,例如在具有直径0.1~0.6mm的喷嘴的注射泵的情况下,从纺丝的稳定性的观点出发,挤压(喷出)速度可以为每孔0.2~6.0mL/h、也可以每孔1.4~4.0mL/h。装有凝固液的脱溶剂槽(凝固液槽)的长度不受特别限定,例如长度可以为200~500mm。通过蛋白质的凝固而形成的未拉伸纱的拾取速度可以为例如1~14m/min,滞留时间可以为例如0.01~0.15min。从脱溶剂的效率的观点出发,未拉伸纱的拾取速度可以为1~3m/min。通过蛋白质的凝固而形成的未拉伸纱可以进一步在凝固液中进行拉伸(预拉伸),但从抑制用于凝固液的低级醇蒸发的观点出发,也可以将凝固液保持为低温,以未拉伸的状态从凝固液中拾取。
(b)拉伸
也可以包括将通过上述方法得到的未拉伸纱进一步拉伸的工序。拉伸可以为一段拉伸,也可以为二段以上的多段拉伸。若以多段拉伸,则能够使分子多段取向,也能够提高总拉伸倍率,故而,适合高韧性的纤维的制造。
在原料组合物为薄膜(原料薄膜)的情况下,可以根据需要调节为能够使蛋白质溶液薄膜化的浓度及粘度。作为使原料组合物薄膜化的方法,其不受特别限定,可列举如下方法:将蛋白质溶液以规定的厚度涂布在对溶剂具有耐性的平板上,形成涂膜,并从涂膜中除去溶剂,由此得到规定厚度的薄膜。
作为形成规定厚度的薄膜的方法,可列举例如流延法。在通过流延法形成薄膜的情况下,能够使用刮板涂布、刮刀涂布器等夹具在平板上以数微米以上的厚度流延蛋白质溶液以形成流延膜,然后通过减压干燥或向脱溶剂槽浸渍脱除溶剂,由此得到原料薄膜(多肽薄膜)。原料薄膜的形成能够依据专利第5678283号公报中记载的方法来进行。
在原料组合物为模塑成型体(原料模塑成型体)的情况下,形成原料模塑成型体的方法不受特别限定。例如,能够将干燥蛋白质粉末导入加压成型机之后,使用手动压机等进行加压及加热,由此使干燥蛋白质粉末达到所需的温度,从而得到原料模塑成型体。另外,原料模塑成型体的形成能够依据专利文献(日本特愿2017-539869,PCT/JP2016/076500)中所记载的方法来进行。
在原料组合物为凝胶(原料凝胶)的情况下,形成原料凝胶的方法不受特别限定。例如,能够通过使干燥蛋白质溶解于溶解用溶剂而得到多肽的溶液的溶液生成工序与将在该溶液生成工序中生成的溶液取代为水溶性溶剂的工序来得到原料凝胶。此时,能够在溶液生成工序与将溶解用溶剂取代为水溶性溶剂的工序之间加入注入模板而成型为规定形状的工序、或者通过在将该溶解用溶剂取代为水溶性溶剂的工序之后进行切割而制成规定形状。另外,原料凝胶的形成能够依据专利第05782580号中记载的方法来进行。
在原料组合物为多孔体(原料多孔体)的情况下,可以根据需要调节为可以实现多孔化的浓度及粘度。形成原料多孔体的方法不受特别限定。可列举例如:向调节为适合多孔化的浓度及粘度的蛋白质溶液中添加适量的发泡剂并除去溶剂,由此得到原料多孔体的方法、或依据专利第5796147号中记载的方法来进行等。
在原料组合物为粒子(原料粒子)的情况下,形成粒子的方法不受特别限定。原料粒子可以通过例如包含下述工序的方法而得到:使用上述的纺丝液,并将纺丝液中的溶剂取代为水溶性溶剂,由此得到蛋白质的水溶液的工序;及将蛋白质的水溶液干燥的工序。水溶性溶剂是指包含水的溶剂,可列举例如:水、水溶性缓冲液、生理盐水等。取代为水溶性溶剂的工序优选通过下述方法来进行:将纺丝液放入透析膜内并浸渍在水溶性溶剂中,更换水溶性溶剂一次以上。具体而言,更优选将纺丝液放入透析膜中,在纺丝液的100倍以上的量的水溶性溶剂(一次量)中静置3小时,反复更换该水溶性溶剂共计三次以上。透析膜只要能够使蛋白质透过即可,可以为例如纤维素透析膜等。通过反复进行水溶性溶剂的取代,能够使纺丝液中存在的溶剂的量接近零。在取代为水溶性溶剂的工序的后期,也可以不使用透析膜。使蛋白质的水溶液干燥的工序优选使用真空冻干。真空冻干时的真空度优选为200帕斯卡(Pa)以下,更优选为150帕斯卡以下,进一步优选为100帕斯卡以下。冻干后的粒子中的水分率优选为5.0%以下,更优选为3.0%以下。
在原料组合物为纤维(原料纤维)的情况下,原料纤维可以为线团状或布料状。
原料纤维的纤维直径的下限值可以为例如10μm以上、15μm以上、20μm以上、超过25μm、28μm以上、30μm以上、32μm以上、34μm以上、35μm以上、36μm以上、38μm以上、40μm以上。原料纤维的纤维直径的上限值优选为120μm以下。
原料纤维的纤维直径可以为10μm~120μm、10μm~40μm、10μm~30μm、10μm~20μm、10μm~25μm、15μm~25μm、超过25μm~120μm、30μm~120μm、35μm~120μm、40μm~120μm、45μm~120μm、48μm~120μm、50μm~120μm、55μm~120μm、60μm~120μm、65μm~120μm、55μm~100μm、55μm~80μm、60μm~80μm。通过使纤维直径为10μm以上,能够更加降低通过与水分接触而产生的收缩。通过使纤维直径为120μm以下,能够在形成纤维时更加高效地进行脱溶剂,从而更加提高酯基的水解反应速度。
(蛋白质组合物的制造方法)
本实施方式中的制造方法具备使包含经酯化的蛋白质(具有酯基的蛋白质)的原料组合物与酸性或碱性的介质接触而使酯基水解的工序(以下,也称为“水解工序”)。通过经过酯基的水解工序,能够同时进行原料组合物的收缩处理,进而得到防缩效果。
[水解工序]
本实施方式中,介质可以为包含水分的介质。包含水分的介质可以为水溶液或水蒸气。包含水分的介质可以为酸性或碱性的介质。酸性的介质只要呈现酸性即可,可以为例如pH低于7的酸性水溶液或酸性水蒸气,从抑制分子链的水解及副反应的观点出发,优选pH为1以上的酸性水溶液或酸性水蒸气。碱性的介质只要呈现碱性即可,可以为例如pH大于7的碱性水溶液或碱性水蒸气,从抑制分子链的水解及副反应的观点出发,优选pH为12以下的碱性水溶液或碱性水蒸气。
本实施方式中,包含水分的介质的温度为40℃以上且180℃以下。包含水分的介质的温度可以为例如50℃以上、60℃以上、70℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上或95℃以上。包含水分的介质的温度优选为沸点以下。
本实施方式中,作为实施水解的方法,能够列举例如:使原料组合物(例如,原料纤维)与酸性或碱性的水溶液接触的方法。此时,酸性物质或碱性物质的量相对于蛋白质溶液总量优选0.1质量%以上,更优选1.0质量%以上。
能够用于水解的酸性物质不受特别限定,可以为无机酸或有机酸中的任意一种。作为无机酸,可列举例如:盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及硼酸等。作为有机酸,可列举例如羧酸及磺酸等。作为羧酸,可列举例如:甲酸、乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、苯甲酸等单羧酸;癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、蜡酸、褐煤酸、蜂花酸及三十六烷酸等饱和脂肪族羧酸;十一烯酸、油酸、反油酸、鲸蜡油酸、芥酸、反芜酸、山梨酸、亚油酸、亚麻酸、花生四稀酸、丙炔酸及硬脂炔酸等不饱和脂肪族羧酸;以及草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一酸、巴拉西酸、马来酸、富马酸及戊烯二酸等二羧酸。羧酸也可以采用酸酐或酰氯的形式。作为磺酸,可列举例如:甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸及对甲苯磺酸等。
能够用于水解的碱性物质可溶于水即可,不受特别限定,可以为无机碱或有机碱中的任意一种。无机碱可溶于水即可,不受特别限定。作为无机碱,可列举例如:氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠及碳酸钠等。作为有机碱,可列举例如:氨、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺等烷基胺、氨基乙醇、甲基氨基乙醇、二甲基氨基乙醇、乙基氨基乙醇、二乙基氨基乙醇及二乙醇胺等伯胺~叔胺。
酯基的水解为平衡反应。也可以将与酯基解离时所产生的酸相同种类的酸用作水解所需的酸,但优选不使用这样的酸。
本实施方式中,水解在酸性条件或碱性条件下进行。优选pH为1~6的酸性条件或8~14的碱性条件,能够通过所使用的酸性物质或碱性物质来进行调节。
本实施方式中,在使用碱性水溶液的情况下,由于后述的理由,pH优选大于8,且优选12以下。
在使用碱性水溶液的情况下,羧酸通过水解解离之后,形成羧酸阴离子。此时,会失去亲电性,故而不易产生逆反应。从即使不加热也显示较高的反应性的观点出发,碱性水溶液的pH优选8~14,从水解的反应速度的观点出发,pH更优选大于8。
酯基的水解在酸性或碱性的水溶液中快速进行,故而反应时间没有限制,但从充分除去酯基的观点出发,优选超过1分钟。
本实施方式中,实施水解的温度可以为例如40℃以上、50℃以上、60℃以上、70℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上或95℃以上。实施水解的温度可以为例如180℃以下,优选为沸点以下。
本实施方式中,与包含水分的介质的接触时间可以为例如5分钟以上、10分钟以上、20分钟以上或30分钟以上。与包含水分的介质的接触时间可以为90分钟以下、60分钟以下或40分钟以下。
本实施方式中,从用于水解的水溶液中取出的蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)上残存有酸性物质或碱性物质,该酸性物质或碱性物质可能会导致分子链断裂。为了防止上述分子链的断裂,蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)的制造方法可以进一步具备除去残存的酸性物质或碱性物质的工序。作为除去残存的酸性物质或碱性物质的工序,可列举例如:用水清洗该蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)的工序、中和该蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)的工序等。
本实施方式中,在蛋白质组合物为蛋白质纤维的情况下,水解工序中得到的蛋白质纤维由下述式(1)定义的收缩率可以为-5%~+5%。由下述式(1)定义的收缩率的详细将在后文叙述。
式(1):收缩率={1-(由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度/制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度)}×100[%]。
[收缩工序]
本实施方式中的制造方法可以在上述水解工序之前及/或之后进一步具备使原料组合物(例如,原料纤维)不可逆收缩的工序(以下,也称为“收缩工序”),但也可以通过经水解工序同时进行原料组合物(例如,原料纤维)的收缩(防缩)处理,故而也可以省略上述收缩工序的一者或两者。收缩工序中,可以通过使原料组合物(例如,原料纤维)与水分接触而使原料组合物不可逆收缩,或通过使原料组合物(例如,原料纤维)加热松弛而使原料组合物不可逆收缩。在通过与水分接触而使原料组合物(例如,原料纤维)不可逆收缩的情况下,可以将经不可逆收缩的组合物干燥而使其进一步收缩。
(通过与水分接触来进行的收缩工序(接触工序))
本实施方式中的原料纤维(包含蛋白质的纤维)具有通过与低于沸点的水分接触(湿润)而收缩的特性。因此,通过在收缩工序中使原料纤维与水分接触,能够得到具有不可逆收缩的收缩履历的蛋白质纤维。以下,将通过使原料纤维与水分接触而不可逆收缩的工序称为“接触工序”。
一般认为,接触工序中原料纤维(包含蛋白质的纤维)的不可逆收缩是因例如以下的理由而产生的。即,理由之一起因于原料纤维(包含蛋白质的纤维)的一次结构,另外,另一个理由为例如在由于制造工序中的拉伸等而具有残留应力的原料纤维(包含蛋白质的纤维)中,水渗入纤维间或纤维内,从而缓和了残留应力。
接触工序中,使纺丝后但与水接触前的原料纤维与水分接触,从而将原料纤维制成湿润状态。湿润状态表示原料纤维的至少一部分被水润湿的状态。由此,能够不借助外力而使原料纤维收缩。该收缩是不可逆的。
接触工序中与原料纤维接触的水的温度可以低于沸点。由此,处理性及收缩工序的作业性等提升。另外,从充分缩短收缩时间的观点出发,水的温度的下限值优选为10℃以上,更优选为40℃以上,进一步优选为70℃以上,进一步优选为80℃以上,特别优选为90℃以上。水的温度的上限值优选为沸点以下。
接触工序中,使水与原料纤维接触的方法不受特别限定。作为该方法,可列举例如:将原料纤维浸渍在水中的方法、向原料纤维以常温或加温后的蒸汽等状态喷雾水的方法、及将原料纤维暴露在充满水蒸气的高湿度环境下的方法等。在这些方法中,从在接触工序中谋求有效缩短收缩时间,并且实现加工设备的简化等方面出发,优选将原料纤维浸渍在水中的方法。
若在接触工序中使原料纤维以松弛状态与水分接触,则原料纤维不仅会收缩,还可能会以形成波浪状的方式卷缩。为了防止产生这种卷缩,可以在未使原料纤维松弛的状态下实施接触工序,例如,在以不施加张力的程度将原料纤维沿纤维轴方向拉伸的同时使其与水分接触等。
(干燥工序)
本实施方式中的制造方法可以进一步具备干燥工序。干燥工序为将经过接触工序后的原料纤维(或经过接触工序得到的蛋白质纤维)干燥的工序。干燥可以为例如自然干燥,也可以使用干燥设备强制干燥。作为干燥设备,可以任意使用接触型或非接触型的公知的干燥设备。另外,干燥温度也是只要为例如比使原料纤维中所含的蛋白质分解或使原料纤维受到热损伤的温度更低的温度,则不受任何限定,通常为20~150℃的范围内的温度,优选为50~100℃的范围内的温度。通过使温度在该范围内,能够更快速且高效地干燥纤维,而不会产生纤维的热损伤、或使纤维中所含的蛋白质分解。干燥时间根据干燥温度等适当设置,例如采用可以尽可能排除过干燥对蛋白质纤维的质量及物性等的影响的时间等。
图5为简要示出用于制造蛋白质纤维的制造装置的一例的说明图。图5所示的制造装置40具有下述部件而构成:输出原料纤维的进料辊42、卷绕蛋白质纤维38的络筒44、实施接触工序的水浴46、及实施干燥工序的干燥机48。
更详细而言,进料辊42配置为可以安装原料纤维36的卷绕物,并能够通过图中未示出的电动马达等的旋转连续自动地从原料纤维36的卷绕物中输出原料纤维36。络筒44配置为能够通过图中未示出的电动马达的旋转连续自动地卷绕蛋白质纤维38,其中,该蛋白质纤维38是从进料辊42输出之后经过了接触工序和干燥工序所制造的。需要说明的是,在此,进料辊42输出原料纤维36的速度与络筒44卷绕蛋白纤维38的绕速度可以彼此独立控制。
水浴46与干燥机48在进料辊42和络筒44之间分别并列配置于原料纤维36的传送方向的上游侧和下游侧。需要说明的是,图5所示的制造装置40具有中继辊50及52,这些用于对从进料辊42向络筒44输送的接触工序之前及之后的原料纤维36进行中继。
水浴46具有加热器54,被该加热器54加温后的水47收纳在水浴46内。另外,张力辊56以浸渍在水47中的状态设置在水浴46内。由此,从进料辊42输出的原料纤维36以卷挂在张力辊56的状态浸渍在水浴46内的水47中,同时向络筒44侧输送。需要说明的是,原料纤维36在水47中的浸渍时间根据原料纤维36的输送速度适当控制。
干燥机48具有一对热辊58。一对热辊58可以卷挂离开水浴46内并向络筒44侧输送的原料纤维36。由此,在水浴46内浸渍于水47中的原料纤维36在干燥机48内被一对热辊58加热,并在干燥后,进一步向络筒44输出。
在使用具有这种结构的制造装置40制造蛋白质纤维38时,首先,使用例如图4所示的纺丝装置10将纺丝后的原料纤维36的卷绕物安装在进料辊42上。接着,从进料辊42连续输出原料纤维36,并使其在水浴46内浸渍在水47中。此时,例如预先使络筒44的卷绕速度低于进料辊42的输出速度。由此,原料纤维36以在进料辊42和络筒44之间处于未松弛的状态通过与水47接触而收缩,故而,能够防止产生卷缩。原料纤维36通过与水47接触而不可逆收缩。
接着,将与水47接触后的原料纤维36(或经过与水47接触而制造的蛋白质纤维38)通过干燥机48的一对热辊58加热。由此,能够将与水47接触后的原料纤维36(或经过与水47接触而制造的蛋白质纤维38)干燥,从而使其进一步收缩。此时,也能够控制进料辊42的输出速度与络筒44的卷绕速度的比率以防止蛋白质纤维38的长度产生变化。接着,将得到的蛋白质纤维38卷绕于络筒44,得到蛋白质纤维38的卷绕物。
需要说明的是,也可以使用诸如图6(b)所述的干热板64等仅由简单的热源构成的干燥设备来代替一对热辊58将与水47接触后的原料纤维36干燥。在该情况下,也可以通过与使用一对热辊58作为干燥设备时相同地调节进料辊42的输出速度和络筒44的卷绕速度彼此的相对速度来使蛋白质纤维的长度不变。在此,干燥机构由干热板64构成。另外,干燥机48并不是必须的。
如上所述,通过使用制造装置40,能够自动连续且非常容易地制造目标蛋白质纤维38。
图6为简要示出用于制造蛋白质纤维的制造装置的其他例子的说明图。图6(a)示出该制造装置所具备的实施接触工序的加工装置,图6(b)示出该制造装置所具备的实施干燥工序的干燥装置。图7所示的制造装置具有实施针对原料纤维36的接触工序的加工装置60、及将接触工序后的原料纤维36(或经过接触工序而制造的蛋白质纤维38)干燥的干燥装置62,这些装置形成彼此独立的结构。
更具体而言,图6(a)所示的加工装置60具有如下的结构,即进料辊42、水浴46、及络筒44从原料纤维36的输送方向的上游向下游侧依次并列配置而成。这种加工装置60配置为使从进料辊42输出的原料纤维36浸渍在水浴46内的水47中以使之收缩。接着将得到的蛋白质纤维38卷绕于络筒44。此时,例如,预先使络筒44的卷绕速度低于进料辊42的输出速度。由此,原料纤维36以在进料辊42和络筒44之间松弛的状态下通过与水47接触而收缩,故而,能够防止向纤维施加张力。原料纤维36通过与水47接触而不可逆收缩。
图6(b)所示的干燥装置62具有进料辊42及络筒44、以及干热板64。干热板64配置为干热面66在进料辊42和络筒44之间与蛋白质纤维38接触,并且沿其输送方向延伸。在该干燥装置62中,如上所述,例如也可以通过控制进料辊42的输出速度和络筒44的卷绕速度的比率来使蛋白质纤维38的长度不变。
通过使用具有这种结构的制造装置,在通过加工装置60使原料纤维36收缩而得到蛋白质纤维38之后,能够通过干燥装置62将蛋白质纤维38干燥。
需要说明的是,也可以从图6(a)所示的加工装置60中省去进料辊42和络筒44,而仅由水浴46构成加工装置。在使用具有这种加工装置的制造装置的情况下,例如蛋白质纤维以所谓的分批式制造。另外,图6(b)所示的干燥装置62并不是必须的。
〔利用加热松弛来进行的收缩工序〕
使原料纤维不可逆收缩的收缩工序也可以通过使原料纤维加热松弛来进行。原料纤维的加热松弛能够通过加热原料纤维,并使处于加热后的状态下的原料纤维松弛并收缩来进行。以下,在原料纤维通过加热松弛而收缩时,将加热原料纤维的工序称作“加热工序”,将使处于加热后的状态下的原料纤维松弛并收缩的工序称作“松弛收缩工序”。加热工序及松弛收缩工序能够通过例如图7及图8所示的高温加热松弛装置140来进行。
(加热工序)
加热工序中,原料纤维36的加热温度优选为用作原料纤维36的蛋白质的软化温度以上。本说明书中的蛋白质的软化温度是指通过缓和原料纤维36的应力而开始收缩的温度。蛋白质的软化温度以上的加热松弛收缩中,纤维收缩至仅通过分离纤维中的水分而无法获得的程度,其结果,能够除去由纺丝过程中的拉伸所产生的纤维中的残余应力。
作为与上述的软化温度相对应的温度,可列举例如180℃。在于180℃以上的高温度范围下实施了加热松弛收缩的情况下,松弛倍率越大或温度越高,越能够高效地去除原料纤维中的残余应力。因此,原料纤维36的加热温度优选为180℃以上,更优选为180℃~280℃,更进一步优选为200℃~240℃,特别优选为220℃~240℃。
从不会损害加热处理后的纤维的伸长率的观点出发,加热工序中的加热时间、即高温加热炉143内的停留时间优选为60秒以下,更优选为30秒以下,进一步优选为5秒以下。一般认为该加热时间的长度不会对应力产生太大的影响。需要说明的是,若加热温度200℃下加热时间为5秒以下,则能够防止加热处理后的纤维的伸长率降低。
(松弛收缩工序)
松弛收缩工序中,松弛倍率优选为超过1倍,更优选为1.4倍以上,更进一步优选为1.7倍以上,特别优选为2倍以上。松弛倍率是指原料纤维36的输出速度与卷绕速度的比率,更具体而言,输出辊141的输出速度与卷绕辊142的卷绕速度的比率。
在使用高温加热松弛装置140进行的加热松弛方法中,只要原料纤维36可以在加热状态下松弛,则可以分别进行加热工序和松弛收缩工序。即,可以将加热装置设为与松弛装置分离独立的装置。在该情况下,在加热装置的后段(原料纤维36的输送方向上的下游侧)设有松弛装置,以在加热工序之后进行松弛收缩工序。
需要说明的是,针对原料纤维的加热松弛工序可以与原料纤维的制造工序分开实施。即,可以设有与高温加热松弛装置140相同的装置作为与纺丝装置25分离的独立的装置。可以采用将单独制造的原料纤维36置于输出辊上并从输出辊输出的方式。加热松弛工序可以针对一根原料纤维进行,或者也可以针对捆扎后的多根原料纤维进行。
(交联工序)
还可以进一步针对如上所述那样得到的具有不可逆收缩的收缩履历的蛋白质纤维或者针对不可逆收缩前的原料纤维进行交联工序,即是使纤维内的多肽分子间化学交联。能够交联的官能团可列举例如:胺基、羧基、硫醇基及羟基等。例如,多肽中所含的赖氨酸侧链的胺基能够通过脱水缩合与谷氨酸或天冬氨酸侧链的羧基由酰胺键交联。可以通过在真空加热下进行脱水缩合反应以进行交联,也可以通过碳二亚胺等脱水缩合剂进行交联。
多肽分子间的交联可以使用碳二亚胺、戊二醛等交联剂进行,也可以使用谷氨酰胺转胺酶等酶进行。碳二亚胺为通式R1N=C=NR2(其中,R1及R2分别独立地表示包含碳原子数1~6的烷基、环烷基的有机基团。)所示的化合物。作为碳二亚胺的具体例,可列举:1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺(DIC)等。其中,EDC及DIC的多肽分子间的酰胺键形成能力高且容易进行交联反应,所以优选。
作为交联处理,优选向纤维赋予交联剂并在真空加热干燥进行交联。作为交联剂,可以将纯品赋予纤维,也可以用碳原子数1~5的低级醇及缓冲液等稀释至0.005~10质量%的浓度后赋予纤维。交联处理优选在温度20~45℃下进行3~42小时。能够通过交联处理赋予纤维更高的应力(强度)。
本实施方式中,蛋白质组合物的制造方法可以进一步具备使原料组合物即纤维,与介质即水溶液接触而卷曲的卷曲工序。若具备卷曲工序,则能够通过纤维与水分的接触来同时实施酯基的除去及纤维的卷曲。
本实施方式中,蛋白质组合物的制造方法可以进一步具备使原料组合物即纤维,与介质即水溶液接触而防缩的防缩工序。通过与水分接触而卷缩后的纤维与未与水分接触的纤维相比,其与水分接触时收缩的程度得到控制。即,如具备防缩工序,则能够通过纤维与水分接触来同时实施酯基的除去及纤维的防缩。
其他的一种实施方式中的蛋白质组合物的制造方法具备使包含经酯化的蛋白质与酸或碱的原料组合物与水蒸气而将酯基水解的工序。
〔蛋白质组合物〕
本实施方式中的蛋白质组合物包含蛋白质,且具有酯基的水解履历。蛋白质优选为结构蛋白质。蛋白质组合物可以为纤维(蛋白质纤维)、薄膜(蛋白质薄膜)、模塑成型体(蛋白质模塑成型体)、凝胶(蛋白质凝胶)、多孔体(蛋白质多孔体)、粒子(蛋白质粒子等)。
水解履历优选为通过与酸性或碱性的包含水分的介质接触而将酯基水解的履历。
本实施方式中,包含水分的介质的温度可以为例如40℃以上、50℃以上、60℃以上、70℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上或95℃以上。包含水分的介质的温度可以为例如180℃以下,优选为沸点以下。
本实施方式中,酯基可以包含于甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯等,优选包含于甲酸酯。
蛋白质组合物可以进一步具有不可逆收缩的收缩履历。需要说明的是,蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)的“不可逆收缩”表示纺丝后最初与水分接触时的收缩,相当于由酯基的水解处理时与水分接触而产生的收缩(防缩)。
<收缩率>
在蛋白质组合物为蛋白质纤维的情况下,蛋白质纤维的由下述式(1)定义的收缩率优选为-5%~+5%。
式(1):收缩率[%]={1-(由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度/制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度)}×100。
关于纤维通过与水分接触而产生的收缩性,能够将例如由上述式(1)求得的收缩率作为指标来进行评价。“制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度”及“由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度”能够通过例如以下的方法来测定。
将长度约30cm的多根蛋白质纤维捆扎制成纤度150旦尼尔的纤维束。能够将其长度作为“制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度”。将该纤维束在40℃的水中浸渍(湿润)15分钟,并在室温下将其干燥2小时。干燥后,测定纤维束的长度。能够将干燥时的长度作为“由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度”。
在蛋白质纤维中,这样的收缩越少越优选,特别是在由蛋白质纤维构成的纺织物等产品中,优选该收缩较少的产品。
由式(1)定义的收缩率可以为例如-4.5%~+4.5%、-4%~+4%、-3.5%~+3.5%、-3%~+3%、-2%~+2%、-1%~+1%、0%~+5%、0%~+4%、0%~+3%、0%~+2%、或0%~+1%。
作为本实施方式中的蛋白质纤维的剖面形状,可以根据喷丝头的形状的不同而采用各种形状,蛋白质纤维的剖面形状可以为圆形或楕圆形。
蛋白质纤维可以具有哑光色调的外观,也可以具有光泽色调的外观。通过适当调节纺丝工序中的脱溶剂速度和/或凝固速度,能够调节纤维的外观的光泽度。需要说明的是,本说明书中,“哑光色调的外观”是指外观为低光泽。
另外,蛋白质纤维的纤维直径的下限值不受特别限定,可以为10μm以上、15μm以上、20μm以上、25μm以上、28μm以上、30μm以上、32μm以上、33μm以上、超过33μm、34μm以上、35μm以上、36μm以上、38μm以上、或40μm以上。通过使下限值为10μm以上,能够更加提高生产性。
蛋白质纤维的纤维直径的上限值不受特别限定,可以为120μm以下。蛋白质纤维的纤维直径可以为10μm~120μm、12μm~40μm、10μm~40μm、12μm~30μm、10μm~30μm、10μm~20μm、12μm~20μm、20μm~30μm、超过25μm~120μm、30μm~120μm、超过33μm~120μm、34μm以上~120μm、35μm~120μm、40μm~120μm、45μm~120μm、48μm~120μm、50μm~120μm、55μm~120μm、60μm~120μm、65μm~120μm、55μm~100μm、55μm~80μm、或60μm~80μm。通过使纤维直径为10μm以上,能够更加提高生产性。通过使纤维直径为120μm以下,能够更加提高酯基的水解反应速度。
作为本实施方式中的蛋白质纤维,优选使原料纤维不可逆收缩的收缩工序前后纤维直径的变化较少的。具体而言,优选相对于不可逆收缩前的原料纤维的纤维直径,蛋白质纤维具有低于±20%的纤维直径。相对于原料纤维的纤维直径,蛋白质纤维的纤维直径优选低于±20%,可以为±19%以下、±18%以下、±17%以下、±16%以下、±15%以下、低于±15%、±12%以下、±10%以下、低于±10%、±5%以下、低于±5%、±4%以下、低于±4%、±3%以下、低于±3%、±2%以下、低于±2%、±1%以下、低于±1%、±0.9%以下、±0.8%以下、±0.7%以下、±0.7%以下、±0.6%以下、±0.5%以下、低于±0.5%、±0.45%以下。需要说明的是,上述值能够通过(蛋白质纤维的纤维直径-原料纤维的纤维直径)/原料纤维的纤维直径×100%的算式求得。
〔酯基除去方法〕
本实施方式中的酯基除去方法具备使包含经酯化的蛋白质(具有酯基的蛋白质)的原料组合物与酸性或碱性的包含水分的介质接触的工序。
本实施方式中,蛋白质及原料组合物能够应用与上述的蛋白质组合物的制造方法中所说明的相同的方案。
本实施方式中,上述工序中得到的蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)由下述式(1)定义的收缩率可以为-5%~+5%。下述式(1)定义的收缩率能够应用与上述的蛋白质组合物中所说明的收缩率相同的方案。
式(1):收缩率={1-(由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度/制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度)}×100[%]
本实施方式中,包含水分的介质的温度及性质、以及与包含水分的介质的接触时间可以应用与上述的蛋白质组合物的制造方法中所说明的相同的方案。
〔产品〕
本实施方式中的蛋白质组合物(例如,蛋白质纤维)能够应用于各种产品。作为产品,能够列举例如:纤维、纱线、布帛、针织物、编织物、无纺布、纸张、棉、及衣料产品。作为纤维,能够列举例如:长纤维、短纤维、单丝、或复丝等,作为纱线,能够列举:纺纱、捻纱线、假捻纱、加工纱、混合纱、或混纺纱等。此外,也能够由这些纤维或纱线来制造织物等布帛、针织物、编织物、或者无纺布等、纸张及棉等。这些产品能够通过公知的方法来制造。另外,还可以应用于绳索、手术用缝合丝,电气部件用的柔性紧固件、以及移植用生理活性材料(例如,人工韧带及主动脉带)等高强度用途。本实施方式中的蛋白质组合物能够用于纱线(纺纱、捻纱线、假捻纱、加工纱、混合纱、或混纺纱等)、织物(布帛)、针织物、编织物、无纺布、纸张及棉等。另外,还可以应用于绳索、手术用缝合丝,电气部件用的柔性紧固件、以及移植用生理活性材料(例如,人工韧带及主动脉带)等高强度用途。这些能够依据公知的方法来制造。
[实施例]
以下,基于实施例对本发明进行更具体的说明。但是,本发明不限定于以下的实施例。
〔试验例1〕
(1)目标蛋白质表达株(重组细胞)的制作
合成核酸,该核酸编码具有序列号15所示的氨基酸序列的改性蛛丝丝心蛋白(PRT799)。该核酸在5’端于NdeI位点及终止密码子下游添加有EcoRI位点。
将上述核酸分别克隆至克隆载体(pUC118)。然后,用NdeI及EcoRI对该核酸进行酶切处理将其切除后,分别重组至蛋白质表达载体pET-22b(+),从而得到表达载体。用分别重组有该核酸的pET-22b(+)表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3),得到表达目标蛋白质的转化大肠杆菌(重组细胞)。
(2)目标蛋白质的表达
将上述转化大肠杆菌用包含氨苄青霉素的2mL的LB培养基培养15小时。将该培养液添加至包含氨苄青霉素的100mL的种子培养用培养基(表4),使OD600达到0.005。将培养液温度保持为30℃,进行烧瓶培养直至OD600达到5(约15小时),得到种子培养液。
[表4]
种子培养用培养基(培养开始时的每1L)
添加氨苄青霉素使其最终浓度达到100mg/L,从而制得种子培养用培养基。
将该种子培养液添加至添加有500mL生产培养基(表5)的发酵罐中,使OD600达到0.05。将培养液温度保持为37℃,将pH稳定控制至6.9进行培养。另外,将培养液中的溶解氧浓度保持为溶解氧饱和浓度的20%。
[表5]
生产培养基(培养开始时的每1L)
生产培养基中的葡萄糖被完全消耗完之后,立刻以1mL/分钟的速度添加料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物120g/1L)。将培养液温度保持为37℃,将pH稳定控制至6.9进行培养。另外,将培养液中的溶解氧浓度保持为溶解氧饱和浓度的20%,培养20小时。然后,以相对于培养液使异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷最终浓度达到1mM的方式添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),从而诱导目标蛋白质。在添加IPTG后经过了20小时时,离心分离培养液,回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液所制备的菌体进行SDS-PAGE,通过依赖于添加IPTG而出现的目标蛋白质尺寸的条带,确认目标蛋白质作为不溶体被表达。
(3)蛋白质的纯化
将添加IPTG2小时后所回收的菌体用20mM Tris-HCl buffer(pH7.4)清洗。将清洗后的菌体悬浮于包含约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中,通过高压均质机(GEA Niro Soavi公司制造)破碎细胞。离心分离破碎后的细胞,得到沉淀物。将得到的沉淀物用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗至高纯度。将清洗后的沉淀物用8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)悬浮使其达到100mg/mL的浓度,在60℃下用搅拌器搅拌30分钟使其溶解。溶解后,使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)用水进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色的凝聚蛋白质,用冻干机除去水分,回收冻干后的粉末状的蛋白质。
(4)蛋白质纤维的成型
使改性蛛丝丝心蛋白的干燥粉末溶解于甲酸,得到纺丝液(纺丝液中的蛋白质浓度:25质量%)。使用公知的纺丝装置通过齿轮泵将纺丝液向凝固液(甲醇)喷出。纺丝条件如下所述。由此,得到蛋白质纤维(丝心蛋白纤维)。
(纺丝条件)
纺丝液温度:25℃
热辊温度:60℃
(5)水解处理
在以下的i~iv的工序中进行水解处理。
i.将蛋白质纤维在酸性或碱性水溶液中浸渍搅拌不同时间。
ii.浸渍在相对于蛋白质纤维过量的纯水中并搅拌2分钟。
iii.更换纯水,再实施ii的操作两次。
iv.将蛋白质纤维在室温下风干。
需要说明的是,各实施例、比较例中使用的酸性或碱性水溶液的pH、反应时间如表6所述。
(6)通过FT-IR确认甲酸酯基的减少行为
用FT-IR显微透射法测定水解处理并干燥后的各纤维,以确认甲酸酯基的减少行为。针对在各pH条件下处理后的各个样本,求取并记录峰高比P1/P2。此时,将(P1/P2)≤0.01作为除去完成的判定标准。将结果示于表6。需要说明的是,P1、P2相对与如下波数的峰高,吸光度比P1/P2的值越小,表示结构上的酯基的数量越少。
P1:1725cm-1(基于酯的C=O的峰)的峰高
P2:1445cm-1(基于蛋白质的酰胺III的峰)的峰高
(7)伸长率的保持率
用粘结剂将水解处理并干燥后的各纤维固定在夹持夹具间距离为20mm的试验纸片上,在温度20℃、相对湿度65%的条件下,使用英斯特朗公司制造的拉伸试验机3342,以10cm/分的拉伸速度进行应力(强度)及伸长率测定。负荷传感器的容量为10N,夹持夹具采用夹子式。测定经酸性或碱性水溶液处理后的蛋白质纤维的伸长率、及经pH=7的水处理后的蛋白质纤维的伸长率,由下面的算式计算伸长率的保持率。将结果示于表6。
[伸长率的保持率]=[经酸性或碱性水溶液处理后的蛋白质纤维的伸长率]÷[用pH=7的水处理后的蛋白质纤维的伸长率]×100
[表6]
pH
浸渍时间[min]
甲酸酯吸光度比(P1/P2)
伸长率的保持率[%]
实施例1-1
1
180(70deg)
0.00
99
实施例1-2
8
2400(r.t.)
0.00
94
实施例1-3
10
80(r.t.)
0.00
101
实施例1-4
11
20(r.t.)
0.00
99
实施例1-5
12
10(r.t.)
0.00
55
比较例1-1
7
90(r.t.)
0.09
100
在经酸性或碱性水溶液处理的蛋白质纤维中,甲酸酯吸光度比减少。由该结果显示,通过用酸性或碱性水溶液进行处理,蛋白质纤维中所含的酯基被水解,进而除去酯基。另外,若酸性或碱性水溶液的pH为11以下(低于12),则也保持处理后的蛋白质纤维的伸长率。
(8)卷曲性的评价
在实施例1-2的条件(pH及浸渍时间)下进行蛋白质纤维的水解处理,并针对水解处理前的蛋白质纤维和水解处理后的蛋白质纤维,比较卷曲状态。卷曲状态的比较通过用尺子测定各蛋白质纤维来进行。将结果示于图9。
图9(A)及(C)为水解处理前(卷曲前)的蛋白质纤维的照片。图9(B)及(D)为水解处理后(卷曲后)的蛋白质纤维的照片。水解处理前为300mm的蛋白质纤维在水解处理后变为200mm(图9(C)及(D))。另外,同时参考图9(A)及(B)可知,与水解处理前相比,水解处理后的蛋白质纤维被卷曲。
(9)防缩性的评价
即使将上述水解处理后的蛋白质纤维(200mm)进一步浸渍在水中,其也不会进一步收缩。
另一方面,将比较例1-1的水解处理前的蛋白质(300nm)浸渍在水中后,蛋白质变为200mm。因此可知,与水解处理前的蛋白质纤维相比,水解处理后的蛋白质纤维被防缩。
(10)利用水蒸气的水解
在湿度80%、60℃的条件下静置蛋白质纤维,使用FT-IR(NICOLET公司制造,FT-IRiS50)测定每天的吸光度比P1/P2。将结果示于表7。
[表7]
图10为将表7的数据、吸光度比P1/P2作为纵轴,并将处理时间(单位为天)作为横轴所绘制的图。
如表7及图10所示,若使蛋白质纤维与水分接触,则吸光度比P1/P2减少。该结果表示,通过与水分接触,以残存的甲酸为催化剂进行酯水解反应,从而导致附加于蛋白质纤维的酯基减少。
〔试验例2〕
(1)表达载体的制作
基于来自络新妇蛛(Nephila clavipes)的丝心蛋白(GenBank登录号:P46804.1,GI:1174415)的碱基序列及氨基酸序列,设计具有序列号40的蛛丝丝心蛋白(以下,也称为“PRT966”。)。需要说明的是,序列号40所示的氨基酸序列具有以提高疏水度为目的将序列号7所示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域重复两次而成的序列中的QQ全部取代为VF,并将剩余的Q全部取代为I而成的序列,而且在N端添加有序列号11所示的氨基酸序列(标签序列及铰链序列)。
接着,合成核酸,该核酸用于编码所设计的蛋白质(蛛丝丝心蛋白),通过与试验例1相同的方法,得到表达目标蛋白质的转化大肠杆菌(重组细胞)。
(2)蛋白质的表达
将上述转化大肠杆菌用包含氨苄青霉素的2mL的LB培养基培养15小时。将该培养液添加至包含氨苄青霉素的100mL的种子培养用培养基(表8),使OD600达到0.005。将培养液温度保持为30℃,进行烧瓶培养直至OD600达到5(约15小时),得到种子培养液。
[表8]
种子培养用培养基
将该种子培养液添加至添加有500mL生产培养基(试验例1的表5)的发酵罐中,使OD600达到0.05。将培养液温度保持为37℃,将pH稳定控制至6.9进行培养。另外,将培养液中的溶解氧浓度保持为溶解氧饱和浓度的20%。
生产培养基中的葡萄糖被完全消耗完之后,立刻以1mL/分钟的速度添加料液(葡萄糖455g/1L、Yeast Extract 120g/1L)。将培养液温度保持为37℃,将pH稳定控制至6.9进行培养。另外,将培养液中的溶解氧浓度保持为溶解氧饱和浓度的20%,培养20小时。然后,以相对于培养液使异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷最终浓度达到1mM的方式添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),从而诱导改性丝心蛋白表达。在添加IPTG后经过了20小时时,离心分离培养液,回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液所制备的菌体进行SDS-PAGE,通过依赖于添加IPTG而出现的目标重组蛋白尺寸的条带,确认目标蛋白质(蛛丝丝心蛋白)的表达。
(3)蛋白质的纯化
通过与试验例1相同的方法纯化蛋白质,并回收冻干后的粉末状的蛋白质(蛛丝丝心蛋白的干燥粉末)。
(4)原料纤维的制造
使蛛丝丝心蛋白的干燥粉末溶解于甲酸,通过开口1μm的金属过滤器过滤,得到纺丝液(纺丝液中的蛋白质浓度:30质量%)。使用公知的纺丝装置通过齿轮泵将纺丝液向凝固液喷出。纺丝条件如下所述。由此,得到原料纤维(原料蛛丝丝心蛋白纤维)。
(纺丝条件)
喷嘴孔径:0.1mm
凝固液:甲醇
凝固液的温度:25℃
水清洗浴的温度:25℃
热辊温度:60℃
(5)原料纤维的酯水解处理(蛋白质纤维的制造)
将(4)中得到的原料纤维200g制成卷筒(线团)状,使用公知的卷筒处理机,通过以下的工序[i]~[x]进行水解处理。在表9中示出工序[iii]中的处理时间、处理温度及处理介质。工序[v]为在处理介质使用碱性介质时所进行的中和处理工序。工序[vii]及[viii]根据需要适当地进行即可。另外,表9的处理介质中的油剂除去剂是为了除去附着于纤维表面的油剂而添加的,根据需要适当地使用即可。
[i]将卷筒安装于卷筒处理机。
[ii]用自来水清洗卷筒。
[iii]将卷筒含浸在表9的处理介质中并搅拌。处理时间如表9所示。
[iv]更换为自来水并清洗卷筒。
[v]在浓度1%乙酸水溶液中将卷筒进行中和处理。
[vi]更换为自来水并清洗卷筒。
[vii]在软化剂水溶液中含浸并搅拌卷筒。
[viii]更换为自来水并清洗卷筒。
[ix]将卷筒脱水。
[x]将卷筒在50~60℃下风干2小时。
[表9]
(6)利用FT-IR评价酯基的除去
使用傅里叶变换红外分光光度计通过ATR法(全反射法)测定(5)中得到的各纤维,进行甲酸酯基的除去评价。针对各纤维(实施例2-1~2-3及比较例2-1~2-3),由IR光谱确认波数1730cm-1(归属于酯基的C=O的峰)的峰高,并评价是否检测到峰(图11)。在未检测到峰的情况下,判定除去了甲酸酯基。
(7)伸长率的评价
通过粘结剂将(5)中得到的各纤维固定在夹持夹具间距离为20mm的试验纸片上,在温度20℃、相对湿度65%的条件下,使用英斯特朗公司制造的拉伸试验机3342,以10cm/分的拉伸速度进行伸长率测定(表9)。负荷传感器的容量为10N,夹持夹具采用夹子式。
如表9所示,仅在用碱性的包含水分的介质(碱性水溶液)处理原料纤维的情况下确认到,使甲酸酯基的水解反应进行,从而除去了纤维中的甲酸酯基(实施例2-1~2-3)。此外还显示,通过使处理温度为高温(90℃~98℃、实施例2-2及2-3),可以在更短时间内将甲酸酯基水解除去。通过以卷筒状实施水解处理,能够更进一步提高水解工序的生产性。另外也确认到,通过水解处理而降低了伸长率。
(8)对于水分的收缩性的评价
按照以下的步骤对(5)中得到的酯水解处理后的蛋白质纤维对于水分的收缩性(尺寸稳定性)进行评价。对于水分的收缩性作为收缩率通过下述式(1)算出并进行评价。将算出后的值示于表10。使用未与上述相同地进行酯水解处理的纤维(比较例2-1)以用作比较来评价收缩性。
将(5)中得到的纤维切割为长度约30cm并将多根捆扎,制成纤度为150丹尼尔的纤维束。将该纤维束的长度作为“制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度”。将该纤维束在90℃的水中浸渍(湿润)15分钟,并在室温下静置2小时使其干燥,并测定长度。将该长度作为“由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度”,通过下述式(1)算出收缩率。测定值采用样品数n=3的平均值。
式(1):收缩率={1-(由湿润状态干燥后的蛋白质纤维的长度/制成湿润状态前的蛋白质纤维的长度)}×100[%]。
[表10]
如表10所示,与未进行酯水解处理的蛋白质纤维(比较例2-1)的收缩率相比,在经酯水解处理的蛋白质纤维(实施例2-2)中,确认到收缩率减少,针对水分的收缩性降低。这表示通过酯水解处理,能够同时进行防缩(收缩)处理,从而得到防缩效果。
符号说明
1…挤压装置、2…未拉伸纱制造装置、3…湿热拉伸装置、4…干燥装置、6…纺丝液、10…纺丝装置、20…凝固浴槽、21…拉伸浴槽、25…纺丝装置、36…原料纤维、38…蛋白质纤维、40…制造装置、42…进料辊、44…络筒、46…水浴、48…干燥机、54…加热器、56…张力辊、58…热辊、60…加工装置、62…干燥装置、64…干热板、140…松弛收缩机构(加热机构)、141…输出机构、142…卷绕机构、146…速度调节机构、147…温度调节机构。
序列表
<110> 丝芭博株式会社
<120> 蛋白质组合物的制造方法
<130> FP19-0981-00
<150> JP2018-185614
<151> 2018-09-28
<150> JP2019-177553
<151> 2019-09-27
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 1
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn Tyr Gly
20 25 30
Ala Ser Ala Gln Tyr Thr Gln Met Val Gly Gln Ser Val Ala Gln Ala
35 40 45
Leu Ala
50
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 2
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val Ser Ile Leu Gly Ser Ser Ser Ile Gly Gln Ile Asn
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 十字园蛛
<400> 3
Ser Gly Cys Asp Val Leu Val Gln Ala Leu Leu Glu Val Val Ser Ala
1 5 10 15
Leu Val Ser Ile Leu
20
<210> 4
<211> 1154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组蛛丝蛋白ADF3KaiLargeNRSH1
<400> 4
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Ala Arg Ala Gly Ser Gly Gln Gln
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gln Gln Gly Pro Gly Gln
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
165 170 175
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Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln
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Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln
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<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多聚组氨酸标签和起始密码子
<400> 5
Met His His His His His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
20
<210> 6
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT380
<400> 6
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595
<210> 7
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT410
<400> 7
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195 200 205
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Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser
325 330 335
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
340 345 350
Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln
355 360 365
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly
370 375 380
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
385 390 395 400
Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala
405 410 415
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420 425 430
Gly Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro
435 440 445
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450 455 460
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly
485 490 495
Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
515 520 525
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly
530 535 540
Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser
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Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
580 585 590
<210> 8
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT525
<400> 8
Met Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
20 25 30
Pro Gly Gln Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
35 40 45
Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
50 55 60
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Gly
85 90 95
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
115 120 125
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
130 135 140
Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
180 185 190
Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser
195 200 205
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln
260 265 270
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser
275 280 285
Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
325 330 335
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Ala Ala Ala Gly Pro Gly Val Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser
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Tyr Gly Pro Gly Val Ile Gly Pro Gly Leu Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Val Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
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Gly Ile Phe Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
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Gly Ile Phe Gly Pro Gly Thr Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly
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595
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