一种脱细胞真皮基质及其制备方法
阅读说明：本技术 一种脱细胞真皮基质及其制备方法 (Acellular dermal matrix and preparation method thereof ) 是由 李东升 谢则平 邵月华 张淑敏 李诚博 宫世周 曲承蕾 申胜标 宋国梁 韩梦禹 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脱细胞真皮基质及其制备方法,该脱细胞真皮基质以罗非鱼皮为原材料,经过去除鳞衣、脱细胞、溶液保存、辐照灭菌等工艺制备而成。制备方法包括：1)刮除鱼鳞、残肉及脂肪等杂质；2)化学溶胀后采用片皮机刮除鳞衣层；3)采用表面活性剂和酶溶液洗涤；4)漂白与消毒；5)采用含有抗氧化剂的高盐溶液浸泡,进行保存液置换；6)低温下低剂量辐照灭菌。本发明产品无需冷冻干燥处理,生产成本低,易于规模化生产,并且去除鳞衣工艺可以高效率、较彻底地除去黑色杂质,大大改善产品外观、提高产品的患者接受度。本发明同时公开了该保存液配方,该保存液可以降低辐照对产品性能的负面影响,确保产品在常温运输与保存下质量稳定。(The invention discloses an acellular dermal matrix and a preparation method thereof, wherein the acellular dermal matrix is prepared by taking tilapia skin as a raw material through the processes of removing scales, acellular preservation, solution preservation, irradiation sterilization and the like. The preparation method comprises the following steps: 1) removing fish scales, residual meat, fat and other impurities; 2) scraping the scale coating layer by using a peeling machine after chemical swelling; 3) washing with surfactant and enzyme solution; 4) bleaching and sterilizing; 5) soaking in high-salt solution containing antioxidant for replacement of the preservation solution; 6) sterilizing by low-dose irradiation at low temperature. The product of the invention does not need freeze drying treatment, has low production cost and easy large-scale production, and the process for removing the scale coat can remove black impurities more thoroughly with high efficiency, greatly improve the appearance of the product and improve the patient acceptance of the product. The invention also discloses a formula of the preservative fluid, which can reduce the negative influence of irradiation on the performance of products and ensure the stable quality of the products during normal-temperature transportation and storage.)
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种新型的罗非鱼皮脱细胞鱼皮基质材料及其制备方法，以及制备工艺中所使用的保存液。
背景技术
鱼胶原材料因其良好的生物相容性和无人畜共患病毒传播风险，近年来受到越来越多的关注。专利WO 2011/042794提出一种脱细胞鱼皮基质，是以鳕鱼皮为原材料，经化学试剂脱细胞、胰蛋白酶消化、冷冻干燥和环氧乙烷灭菌制得。该工艺因为鳕鱼尚未实现大规模的人工养殖、原料来源有限，加之冷冻干燥工序对设备的要求较高、不易规模化生产。专利CN108355172A描述了一种罗非鱼皮脱细胞基质的制备方法，但所述生产流程繁琐、未设置去除黑色鳞衣工艺步骤，并且所述的保护液为生理缓冲液、细胞培养液、组织保存液、透明质酸溶液、壳聚糖溶液、右旋糖酐溶液、甘油等试剂，未验证其能否用于湿态样品的常温保存。因此研制一种既有大量的原料供应、生产工艺易于规模化放大、又可去除黑色鳞衣、并且无需冷冻干燥可直接常温保存、临床即用型的脱细胞真皮基质材料，成为目前医用胶原产业化亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是以罗非鱼皮为原材料，研究一种新型的脱细胞鱼皮基质。该脱细胞鱼皮基质在未经化学试剂交联的情况下，具有优异的热稳定性，生产过程无需干燥，可在常温下运输与保存。该产品可用作创面敷料、外科补片、软组织填充修复材料等，具有广阔的临床应用前景。
本发明公开了一种制备罗非鱼皮脱细胞真皮基质的方法，具体而言包括如下步骤：
1)前处理：刮除罗非鱼皮表面的鱼鳞、残肉及脂肪等杂质；
2)刮除鳞衣：化学溶胀后采用片皮机刮除鳞衣层，然后用缓冲液浸泡；
3)脱细胞：先后采用表面活性剂和核酸酶溶液振荡洗涤；
4)漂白处理：采用化学漂白剂对鱼皮进行漂白与消毒；
5)保存液置换：采用含有抗氧化剂与高浓度盐的保存液对其进行浸泡；
6)后处理：在低温下采用较低的辐照剂量进行灭菌处理。
在上述方法中，具体在步骤2)中，所述化学溶胀处理即将鱼皮浸泡于甘油溶液中，于4-20℃处理2-24小时；然后将鱼皮用酸性溶液或碱性溶液喷洒在鱼皮外侧，充分接触5-30分钟后，再用片皮机刮除鱼皮表面的黑色鳞衣层。所述酸性溶液是0.1％-3％浓度的醋酸溶液、柠檬酸溶液或磷酸溶液，所述碱性溶液是0.05M-0.2M的NaOH、KOH或氨水溶液。刮除鳞衣之后将鱼皮置于酸碱度为pH6.0-pH8.0的缓冲液中，使之恢复到溶胀前的致密状态。
在上述方法中，具体在步骤3)中，所述核酸酶溶液为浓度20-200U/mL的核酸酶溶液，核酸酶处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间2-24小时。
在上述方法中，具体在步骤4)中，所述化学漂白剂为质量百分含量0.5-5％过氧化氢的水溶液，或质量百分含量0.5-5％过氧乙酸的乙醇溶液，优选地，采用3％过氧化氢的水溶液；其中化学漂白剂处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，处理时间1-6小时。
在上述方法中，具体在步骤5)中，所述保存液置换所使用的溶液含有浓度0.2mg/mL-5mg/mL抗氧化剂和100mg/mL-350mg/mL氯化物。所述抗氧化剂为D-异抗坏血酸钠，或抗坏血酸钠，或两者的任意比例混合物；所述氯化物为氯化钠，或氯化钾，或氯化钙，或三者的任意比例混合物。
在上述方法中，具体在步骤6)中，所述低温辐照的温度范围为-50℃至8℃，优选地，该温度为-20℃；所述低剂量辐射的剂量范围为10kGy至20kGy，优选地，该剂量为12kGy。
本发明同时公开了一种罗非鱼皮脱细胞真皮基质，该产品以罗非鱼皮为原材料，经过机械化去除鳞衣、核酸酶脱细胞处理、高浓度盐溶液保存、低温低剂量辐照灭菌等工艺制备而成。
另外，脱细胞真皮基质的保存液也在本发明的保护范围内。该保存液含有酸碱度接近中性的抗氧化剂和高浓度的氯化物盐分。所述抗氧化剂为D-异抗坏血酸钠，或抗坏血酸钠，或两者的任意比例的混合物；优选地，该抗氧化剂为D-异抗坏血酸钠；所述氯化物为氯化钠，或氯化钾，或氯化钙，或三者的任意比例的混合物；优选地，该氯化物为氯化钠；另外所述氯化物的浓度为100mg/mL-350mg/mL，优选地，其浓度为200mg/mL。
总之，本发明提供的一种罗非鱼皮的脱细胞鱼皮基质的制备方法，具有以下技术优势：
(1)与传统的脱细胞技术相比，本发明综合采用酶法处理、辐照保护剂、低温辐照等技术，所制备的湿态罗非鱼皮脱细胞基质热稳定性较高，无需冷冻干燥处理，易于规模化生产；
(2)创新的黑色鳞衣去除技术，综合应用溶胀处理与自动化设备刮除技术，溶胀后鱼皮变厚、黑色鳞衣变软，易于片皮机的操作，刮皮后置于缓冲液中可使之恢复致密状态。该工艺可在保持鱼皮原有机械性能的前提下，高效率、较彻底地除去黑色鳞衣，大大改善产品外观、提高产品的患者接受度；
(3)研制了高浓度盐复合抗氧化剂的保存液，配方简单易得，高浓度盐可以保证产品在灭菌前不易滋生细菌，在低温灭菌过程中溶液不会结冰、可避免反复冻融对胶原蛋白造成的破坏，且在灭菌后可保持样品更佳的热稳定性。而抗氧化剂则作为辐照保护剂，减少自由基对产品的氧化破坏。因此该工艺所制备的产品无需冷链管理，可以常温运输与保存；
(4)与脱细胞猪皮或牛皮等陆生动物来源的生物材料相比，本发明的脱细胞罗非鱼皮无人畜共患病毒传播的风险，生产成本更低，且与冻干的剂型相比使用前无需水化、临床使用更方便，易于在临床大范围推广应用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。除非有特殊说明，用液体制备的溶液浓度用体积比表示(v/v)，用固体制备的溶液浓度用重量体积比表示(w/v)，此处所述质量体积比的单位形式为g/mL。
实施例1一种脱细胞鱼皮基质的制备方法
1、前处理
取新鲜罗非鱼皮100g，用刀刮除掉鱼鳞、残肉及脂肪，10℃下用1％NaCl浸泡6小时，料液比1:10(w/v)，并重复一次，沥干。
2、刮除鳞衣
首先将鱼皮浸泡于足量的50％甘油溶液中，10℃处理6小时使其充分溶胀，拭去表面的甘油溶液；然后将鱼皮铺展于操作台上，采用喷雾器将0.1％乙酸溶液喷洒在鱼皮外侧，充分接触15分钟后，用片皮机刮除鱼皮表面的黑色鳞衣层，纯水漂洗3次后暂存于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，使之恢复溶胀之前的致密状态。
3、表面活性剂洗涤
将上一步骤的鱼皮沥干，加入0.1％Triton×100(w/w)溶液，料液比1:10(w/v)，10℃，100rpm振荡24小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。此步骤可起到脱细胞作用。
4、酶法脱细胞
向鱼皮中加入50U/mL DNA酶溶液，料液比1:10(w/v)，10℃，100rpm振荡24小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。此步骤可起到脱细胞、去除核酸等抗原物质的作用。
5、漂白
向鱼皮中加入0.5％过氧化氢溶液，料液比1:10(w/v)，10℃,100rpm振荡3小时，沥干，然后用pH7.4的磷酸盐缓冲液漂洗3次，沥干。此步骤除了漂白功能之外，还起到一定的杀菌消毒与病毒灭活作用。
6、保存液置换
采用注射用水配制保存液，其配方为：200mg/mL氯化钠，1mg/mL抗坏血酸钠。将步骤5处理的鱼皮置于足量的保存液中，10℃，100rpm振荡3小时，沥干；重复上述步骤3次，使样品内部充分置换为保存液。
7、后处理
将鱼皮裁剪成所需大小，用医用包装袋密封，然后置于-12℃至-18℃的医用保温箱中，经15kGy剂量的钴60辐照灭菌即得。
实施例2一种脱细胞鱼皮基质的制备方法
1、前处理
取冷冻罗非鱼皮100g化冻，4℃下用5％NaCl浸泡0.5小时，料液比1:30(w/v)，并重复一次，沥干。
2、刮除鳞衣
首先将鱼皮浸泡于足量的10％甘油溶液中，4℃处理24小时使其充分溶胀，拭去表面的甘油溶液；然后将鱼皮铺展于操作台上，采用喷雾器将3％柠檬酸溶液喷洒在鱼皮外侧，充分接触5分钟后，用片皮机刮除鱼皮表面的黑色鳞衣层，纯水漂洗3次后暂存于pH6.0的MES缓冲液中，使之恢复溶胀之前的致密状态。
3、表面活性剂洗涤
向鱼皮中加入1％吐温80(w/w)溶液，料液比1:30(w/v)，4℃，250rpm振荡2小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。
4、酶法脱细胞
向鱼皮中加入20U/mL核酸酶溶液，料液比1:30(w/v)，4℃，250rpm振荡2小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。此步骤可起到脱细胞、去除核酸等抗原物质的作用。
5、漂白
向鱼皮中加入5％过氧化氢溶液，料液比1:30(w/v)，4℃静置处理6小时，沥干，然后用pH6.0的MES缓冲液漂洗3次，沥干。此步骤除了漂白功能之外，还起到一定的杀菌消毒与病毒灭活作用。
6、保存液置换
采用注射用水配制保存液，其配方为：100mg/mL氯化钾，0.2mg/mL抗坏血酸钠。将步骤5处理的鱼皮置于足量的保存液中，4℃，250rpm振荡0.5小时，沥干；重复上述步骤3次，使样品内部充分置换为保存液。
7、后处理
将鱼皮裁剪成所需大小，用医用包装袋密封，然后置于2℃至8℃的医用保温箱中，经10kGy剂量的钴60辐照灭菌即得。
实施例3一种脱细胞鱼皮基质的制备方法
1、前处理
取新鲜罗非鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，20℃下用3％NaCl浸泡12小时，料液比1:20(w/v)，并重复一次，沥干。
2、刮除鳞衣
首先将鱼皮浸泡于足量的80％甘油溶液中，20℃处理2小时使其充分溶胀，拭去表面的甘油溶液；然后将鱼皮铺展于操作台上，采用喷雾器将0.4％氢氧化钠溶液喷洒在鱼皮外侧，充分接触30分钟后，用片皮机刮除鱼皮表面的黑色鳞衣层，纯水漂洗3次后暂存于pH8.0的Tris-Hcl缓冲液中，使之恢复溶胀之前的致密状态。
3、表面活性剂洗涤
向鱼皮中加入0.3％脱氧胆酸钠溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡48小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干。
4、酶法脱细胞
向鱼皮中加入200U/mL核酸酶溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡6小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。此步骤可起到脱细胞、去除核酸等抗原物质的作用。
5、漂白
向鱼皮中加入含1％过氧乙酸的乙醇溶液，料液比1:20(w/v)，20℃处理1小时，沥干,然后用pH8.0的Tris-Hcl缓冲液漂洗3次，沥干。此步骤除了漂白功能之外，还起到一定的杀菌消毒与病毒灭活作用。
6、保存液置换
采用注射用水配制保存液，其配方为：350mg/mL氯化钙，5mg/mL D-异抗坏血酸钠。将步骤5处理的鱼皮置于足量的保存液中，20℃，175rpm振荡1小时，沥干；重复上述步骤3次，使样品内部充分置换为保存液。
7、后处理
将鱼皮裁剪成所需大小，用医用包装袋密封，然后置于-44℃至-50℃的医用保温箱中，经20kGy剂量的电子束辐照灭菌即得。
对比例1采用传统脱细胞工艺制备罗非鱼皮脱细胞真皮基质
为了考察本发明所采用的机械化除鳞衣、酶法脱细胞和保存液的作用，特别设计次该对比例。借鉴专利201811232737.0所采用的传统生产工艺并稍作修改，即采用手工刮鳞衣、碱法洗涤脱细胞、不添加保护液直接辐照灭菌的方法。
1、前处理
同实施例1的步骤1。
2、手工刮除鳞衣
首先取一张滤纸使其充分浸润0.1％乙酸溶液，然后将鱼皮铺展于该滤纸上，使含有鳞衣的一侧与该滤纸充分接触，15分钟后取出，用刀刮除黑色的鳞衣，直至鳞衣基本刮除干净，纯水漂洗3次后暂存于pH7.4的磷酸盐缓冲液中。采用该手工刮皮工艺，2名员工处理100张鱼皮约需要3小时，而若采用实施例1所述的机械化工艺，用片皮机刮100张皮在1小时内即可完成。
3、表面活性剂洗涤
同实施例1的步骤3。
4、碱法脱细胞
向鱼皮中加入0.05M NaOH溶液，料液比1:10(w/v)，10℃，200rpm振荡24小时，沥干；用纯水漂洗3次，再次沥干。此步骤可起到脱细胞、去除杂蛋白等抗原物质和灭活病毒等作用。
5、漂白
同实施例1的步骤5。
6、后处理
未经过保存液置换环节，直接进行包装与辐照灭菌，具体工艺同实施例1的步骤7。
对比例2采用传统灭菌工艺制备罗非鱼皮脱细胞真皮基质
为了考察低温、低剂量辐照灭菌的效果，故设计此对比例。即采用常温下对样品进行辐照灭菌，灭菌剂量采用医疗行业通常使用的25kGy。具体地，步骤1至步骤6与实施例1的对应的处理步骤相同。而步骤7后处理方法调整为：将鱼皮裁剪成所需大小，用医用包装袋密封，然后置于常温的医用保温箱中，进行25kGy剂量的钴60辐照灭菌。
实施例4不同工艺脱细胞真皮基质的性能比较
分别采用本发明实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2所述方法制备罗非鱼脱细胞真皮基质，对其进行性能测试：
1、DNA残留量检测：按照YY/T 0606.25-2014规定的方法检测DNA残留。
2、外观检查：每种样品选取6个样本(n＝6)，在正常光照下观察表面的颜色，并进行评分，计分方法为：完全白色、无杂色斑点记为0分，较少的杂色斑点记为1分，一定数量的杂色斑点记为2分，较多的杂色斑点记为3分。评分越低，去除黑色鳞衣的效果越好。
3、热变性温度：用差示扫描量热分析仪进行测定，剪取5mg样品并用生理盐水充分润湿，置于铝坩埚中加盖密封，以空坩埚作为参比，从20℃加热至80℃，温速率5℃/mi n，样品室的氮气流量20mL/mi n。
4、热稳定性的测定：将三种样品置于37℃环境中进行稳定性实验，放置6个月后采用上述差示扫描量热法再次测定热变性温度。
5、力学性能：将样品裁剪成哑铃状试样，用生理盐水充分润湿，在电子万能试验机上测定拉伸强度，拉伸速度设定为15mm/mi n。
表1罗非鱼与鳕鱼的脱细胞鱼皮基质性能对比
结果显示(表1)，本发明实施例1、实施例2和实施例3的样品的各项性能接近，相互之间无显著性差异，表明本发明制备方法在一定的参数范围内可以保持产品的质量稳定可控。另外本发明产品的DNA残留量与对比例1无显著性差异，均符合行业公认的50ng/mg的限度，这表明与碱法工艺相比，酶法工艺也能达到良好的去除核酸残留的效果；本发明所制备的产品外观检查评分显著低于对比例1样品的评分(p＜0.05)，表明本发明的去除黑色鳞衣效果更好；另外热变性温度和拉伸强度显著优于两个对比例，表明本发明的工艺可以最大程度地保护产品的热力学和机械性能；热稳定性实验也验证了这一点，在37℃环境放置6个月后，本发明样品的热变性温度变化不大，表明其热力学性质相当稳定，而其他两个对比例的热变性温度均显著降低，样品可能存在蛋白降解行为。
上文中描述了本发明的具体实施方式，但在本领域中的普通技术人员能够理解、不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都属于本发明权利要求书限定的范围内。