一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架及其制备方法与应用 (Mechanical property enhanced acellular spinal cord biomaterial stent and preparation method and application thereof ) 是由 曾湘 马瑗锾 曾园山 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学材料技术领域,具体涉及一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架及其制备方法与应用,为克服现有脱细胞脊髓支架机械性能不足的问题,本发明采用电纺技术在脱细胞脊髓(DSC)外电纺一个聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)外壳,构建得到一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架。相比单纯的DSC支架,本发明的生物材料支架具有增强的机械性能,抗压能力更好,可以防止移植后材料的塌缩和被周围组织的压迫；经研究发现,将本发明的生物材料支架移植到大鼠全横断脊髓损伤区可以有效修复脊髓损伤,从而解决了脱细胞脊髓机械性能不好的问题,进一步促进脊髓损伤的原位修复。(The invention belongs to the technical field of biomedical materials, and particularly relates to a mechanical property enhanced acellular spinal cord biomaterial scaffold as well as a preparation method and application thereof. Compared with a pure DSC bracket, the biomaterial bracket has enhanced mechanical property and better pressure resistance, and can prevent the material from collapsing and being pressed by surrounding tissues after being transplanted; researches show that the spinal cord injury can be effectively repaired by transplanting the biomaterial scaffold to a rat full-transection spinal cord injury area, so that the problem of poor mechanical property of the decellularized spinal cord is solved, and the in-situ repair of the spinal cord injury is further promoted.)
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架及其制备方法与应用。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种中枢神经系统损伤疾病，随着经济的发展和社会老龄化的加剧，发病率进一步升高。据统计，世界范围内脊髓损伤每年的发病率为23/百万，亚洲国家尤其中国和韩国发病率较高，为12.06-61.6/百万。目前我国约有200万脊髓损伤导致的截瘫患者，并且每年以约5万人的速度增加，而且呈现出高发病率、高致残率、低龄化的趋势，给家庭和社会带来了巨大的经济压力。仅在中国，因脊髓损伤导致的政府直接经济支出高达数十亿，因此脊髓损伤的研究与治疗成为世界各国研究的热点。
近年来，再生医学在治疗脊髓损伤方面具有广阔的前景，再生医学中有两大要素：一是种子细胞，二是生物材料。选择理想的生物材料对于组织工程修复脊髓损伤来说至关重要，目前运用在脊髓损伤研究领域的包括天然来源的生物材料(以胶原、明胶、海藻酸盐等为代表)、可降解高分子合成材料(以聚左旋乳酸(poly D,L-lactic acid,PLLA)为代表)以及脱细胞材料(以脱细胞坐骨神经、脱细胞视神经、脱细胞脊髓为代表)。一般认为，用原位的器官脱细胞来修复相应的器官损伤最符合器官原有的结构和细胞外基质成分，目前已有大量的脱细胞材料应用于相应的器官的研究，例如血管，骨，肺，心脏，皮肤以及周围神经等。同理，可通过构建脱细胞脊髓(DSC)作为脊髓组织工程的支架用于治疗脊髓损伤。尽管有研究表明，在脊髓损伤后，将DSC植入脊髓显示出一定的结构或功能改善，但这种支架的一个重大障碍是其较弱的机械性能。事实上，新鲜DSC的弹性模量只有0.564MPa，由于柔软，机械性能差，从而不能很好的维持支架形状。通过交联法(如使用京尼平交联)改良后，其弹性模量提高到1.541MPa，但也只是正常脊髓灰质和白质弹性模量的一半，这种机械强度很难克服创伤性SCI后浸润性纤维性瘢痕引起的组织收缩。因此，仅在脊髓内植入DSC会导致支架塌陷，并且会在在植入位点出现明显纤维化。可见，研制机械性能优良的脱细胞脊髓支架显得尤为重要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架，该支架包括内部的脱细胞脊髓(DSC)以及环绕在脱细胞脊髓外围的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D,L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)外壳，通过在DSC外围喷射PLGA静电纺丝形成薄壳后制备得到，与单纯的DSC支架相比，其机械性能提高10倍左右，解决了脱细胞脊髓机械性能不好的问题，可以有效推进脊髓损伤的原位修复。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架，包括内部的脱细胞脊髓以及环绕在脱细胞脊髓外围的PLGA外壳。
优选地，所述PLGA外壳通过电纺的方式喷在脱细胞脊髓的外围，并形成紧密的一体化结构。
本发明通过添加PLGA外壳，增强了整个生物支架的机械性能，维持脱细胞脊髓支架的形状，而电纺的方法可以使得外壳和内部的材料连接的更好，更牢固，内部支架不易滑脱，机械性能的增强可以防止支架移植到脊髓损伤处后塌陷，可作为一种有效治疗脊髓损伤的新型生物材料。
本发明还提供了上述的机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用。
本发明还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，该产品包括上述的机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架。
本发明还提供了上述的机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、采用萃取法制作脱细胞脊髓材料，所述脱细胞脊髓材料为去除了细胞和主要抑制成分，保留了中枢神经系统的其他细胞外基质；
S2、配制PLGA溶液，然后在脱细胞脊髓材料外电纺PLGA外壳，得到机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架。
PLGA具有很好的生物相容性，属于可降解高分子生物材料，且可电纺成需要的形状，具有很好的机械性能。因此本发明采用电纺技术在脱细胞脊髓(DSC)外电纺一个PLGA外壳，制备得到一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架(PLGA-DSC)，PLGA-DSC的PLGA外壳增强了该生物材料的整体机械性能，提高了材料的抗压能力，与DSC材料相比，PLGA-DSC的应力增加，压缩模量也大大提高，提高大约10倍左右；PLGA外壳的机械加固显著增强了PLGA-DSC抵抗α-SMA阳性肌成纤维细胞入侵的能力(这种细胞是一种纤维瘢痕中的主要张力生成细胞)，防止移植后材料的塌缩和被周围组织的压迫，从而维持神经源性的生态环境，有利于SCI后内源性神经干细胞的靶向迁移和驻留。由于内部的DSC去除了细胞和主要抑制成分，保留了中枢神经系统的其他细胞外基质，从而可以更好修复中枢神经系统的损伤，解决了脱细胞脊髓机械性能不好的问题，进一步推进脊髓损伤的原位修复。
优选地，所述电纺的转速为300rpm，X轴移动速度为5.3mm/s，注射泵流量为1mL/h，电压为21.86kV，运行不少于40分钟。
优选地，所述PLGA溶液的质量浓度百分比为8％-15％。所述PLGA的分子量为10,0000。
优选地，所述脱细胞脊髓材料的制作包括以下步骤：
S11、获取新鲜脊髓，切成小段，浸泡于抗生素溶液中，-80℃放置过夜；
S12、从-80℃取出，仍浸泡于抗生素溶液中，震荡至大量组织细胞析出；
S13、转移至含1％双抗的水溶液中，震荡(5-7)h；
S14、转移至含3％Triton-X-100和1％双抗的水溶液中，震荡(10-14)h；
S15、取出洗涤后浸泡于4％脱氧胆酸钠的水溶液中，震荡(12-36)h；
S16、重复步骤S15；
S17、取出洗涤后浸泡于酶的水溶液中，37℃恒温震荡(1-3)h；
S18、取出洗涤后浸泡于水中冷冻过夜，再经冷冻干燥得到脱细胞脊髓材料。
进一步地，步骤S11和S12所述抗生素溶液包含2％(质量浓度百分比)双抗、10μg/mL庆大霉素和2.5μg/mL两性霉素B。具体地，所述双抗为青霉素和链霉素。
进一步地，步骤S17所述酶的水溶液包含50U/mL DNA酶、1KU/mL RNA酶、50mM Tris和10mM MgCl2·6H2O。
进一步地，步骤S11为将脊髓切成1-2cm长的小段。
进一步地，步骤S13的震荡时间为6h，步骤S14的震荡时间为12h，步骤S15的震荡时间为24h，步骤S17的震荡时间为2h。
进一步地，步骤S15-S17所述的洗涤为用水洗3次，每次10min。
进一步地，步骤S18所述的洗涤为用水洗3次，每次20min。
进一步地，步骤S18所述冷冻过夜的温度为-80℃。
进一步地，本发明所用的水均为无菌超纯水。
进一步地，在制作脱细胞脊髓材料时，所述震荡所用的转速均为150r/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用电纺技术在脱细胞脊髓(DSC)外电纺一个PLGA外壳，即通过在DSC外围喷射PLGA静电纺丝形成薄壳作为柔软DSC的外层，从而构建得到一种机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架。相比单纯的DSC支架，本发明的生物材料支架具有增强的机械性能，抗压能力更好，可以防止移植后材料的塌缩和被周围组织的压迫；经研究发现，将本发明的生物材料支架移植到大鼠全横断脊髓损伤区可以有效修复脊髓损伤，从而解决了脱细胞脊髓机械性能不好的问题，进一步推进脊髓损伤的原位修复。
附图说明
图1为PLGA-DSC支架的结构示意图；
图2为PLGA-DSC支架的制作流程图和SEM形态图；
图2中，A为制作流程图(显示了PLGA-DSC支架的结构和整体设计，即将成年大鼠脊髓脱细胞后冻干得到DSC材料，然后将所得的DSC通过电纺的方法在外围纺一个PLGA外壳，得到PLGA-DSC支架)；B为PLGA-DSC支架的立体图(正面图和侧面图；图中的D为PLGA外壳，高倍下为交织成网络的静电纺丝，E为脱细胞脊髓，高倍下为网状基质，F为两者交界区，显示交织成网的丝将两者紧密连接起来)；C为PLGA-DSC支架整体形态的SEM图；D为静电纺的PLGA纳米纤维的SEM图；E为DSC脱细胞的细胞外基质网络的SEM图；F为电纺PLGA外壳与DSC基质的结合部位的SEM图。
图3为PLGA-DSC支架的机械性能测试图；
图3中，A为PLGA-DSC支架(a)和DSC支架(b)对压缩产生响应力的应力-应变曲线；B为PLGA-DSC支架和DSC支架压缩模量值的柱状图(n＝5,*p<0.05)。
图4为PLGA-DSC支架植入脊髓损伤大鼠7天后周围结缔组织浸润进入支架的情况检测图；
图4中，A,B分别表示PLGA-DSC支架和DSC支架植入脊髓损伤大鼠7天后移植区域的H&E染色图(方框显示支架在受伤/植入区域中的大概位置，双箭头指示支架的纵轴，PLGA-DSC支架的纵轴“平行”平行于宿主脊髓，而植入的DSC支架被挤压到损伤/植入区域的中心，并且其纵轴与宿主脊髓的纵轴形成一定角度)；C为PLGA外壳在高倍镜下H&E染色图像(带星号*的虚线框内为PLGA外壳，显示PLGA薄壳保留在支架的外层，而脑膜来源的成纤维细胞位于PLGA薄壳的外面)；D为DSC支架植入区域在高倍镜下的H&E染色图像(显示大量的成纤维细胞聚集在脑膜下，往损伤区迁移，可见迁移轨迹[箭头所示])；E为PLGA外壳及周围α-SMA表达情况的免疫荧光染色图(带星号*的虚线框内为PLGA外壳，表明PLGA外壳外侧的细胞强烈表达α-SMA[箭头所示]，而PLGA壳内侧缺少α-SMA阳性细胞)；F为DSC支架植入区域α-SMA表达情况的免疫荧光染色图(显示大量α-SMA阳性出现在细胞支架周围和损伤区内部[箭头所示])。(A和B)中比例尺＝1mm，(C–F)中为40μm。
图5为PLGA-DSC支架植入脊髓损伤大鼠8周后损伤区免疫细胞的极化和空洞情况检测图。
图5中，A,B分别为PLGA-DSC组和对照组的CCR7和CD68免疫染色图(标记M1型巨噬细胞/小胶质细胞；其中A1-A3和B1-B3分别为A和B中方框区域的高倍放大图像，显示CCR7和CD68双重标记的细胞[箭头所示])；C,D分别为PLGA-DSC组和对照组的CD206和CD68免疫染色图(标记M2型巨噬细胞/小胶质细胞；其中C1-C3和D1-D3分别为C和D中的方框区域的高倍放大图像，显示CD206和CD68双标记细胞[箭头所示])；E为CCR7/CD68以及CD206/CD68的柱形图(*P<0.05[n＝5])；F为像显示PLGA-DSC组和对照组脊髓损伤区域空洞情况的H&E染色图；G为空洞面积的统计图(*P<0.05[n＝5])。(A，B和F)中比例尺＝500μm,(A1-A3，B1-B3，C1-C3和D1-D3)中比例尺＝20μm。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架的制备及其在脊髓全横断大鼠中的应用
按照图2所示的操作流程图进行脱细胞脊髓生物材料支架的制备及其在脊髓全横断大鼠中的应用，具体操作方法如下：
1、动物信息
大鼠：SD大鼠，由中山大学实验动物中心提供。
2、主要仪器和试剂
高压静电纺丝仪(深圳通力微纳科技，TL-01)，电子万能试验机(UTM6104)，冰冻切片机(Thormo)，荧光显微镜(Leica)，扫描电镜(FIE)，PLGA粉(sigma，分子量为10,0000)，0.01M PBS(中杉金桥)，Hoechst33342染料(Sigma)，山羊血清(GIBCO)，一抗(α-SMA，Abcam)，二抗(Alex-555，Invitrogen)。
3、脱细胞脊髓材料的制作
(1)将SD大鼠麻醉致死后，在冰上快速取出整个脊髓，切成1-2cm的小段，浸泡于抗生素溶液(含2％双抗[青霉素和链霉素的比例为1:1]+10μg/mL庆大霉素+2.5μg/mL两性霉素B，溶剂为无菌超纯水)中，-80℃冰箱过夜；
(2)从冰箱取出，仍浸泡于抗生素溶液中，摇床(250r/min)震荡至大量组织细胞析出。
(3)取出转移至含1％双抗(青霉素和链霉素)的无菌超纯水，摇床(250r/min)震荡6h，每2h换一次。
(4)取出再转移至含3％Triton-X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)+1％双抗(青霉素和链霉素)的水溶液中，摇床(250r/min)震荡12h；
(5)取出用无菌超纯水洗3次，每次10min；
(6)取出浸泡于4％脱氧胆酸钠水溶液中，摇床(250r/min)震荡24h；
(7)取出用无菌超纯水洗3次，每次10min；
(8)重复步骤(6)-步骤(7)1次；
(9)取出浸泡于酶的水溶液(DNA酶50U/mL+RNA酶1KU/mL+Tris50mM+MgCl2·6H2O10mM)中，37℃恒温摇床(150r/min)震荡2h；
(10)取出用无菌超纯水洗3次，每次20min；
(11)冷冻干燥：脱细胞材料放于刚好够舒展开的水(无菌超纯水)中，在负80度冰箱冷冻过夜，再上冻干机冷冻干燥过夜，制备得到脱细胞脊髓材料(DSC)。
4、往脱细胞脊髓材料上电纺PLGA外壳
(1)PLGA溶液的配制：称取1mg PLGA粉溶于10mL HFIP(六氟异丙醇)中，配制成质量分数为10％的PLGA溶液，置于小瓶子中，放在磁力搅拌器上，搅拌过夜，使其充分溶解；
(2)将溶解好的PLGA溶液吸入2.5mL的针管中，静置一会待气泡完全消失；
(3)将步骤3制作好的脱细胞脊髓材料用细铁丝穿过，将铁丝安装在高压静电纺丝仪原先滚轴的位置，固定针管，针头到铁丝的距离为7cm。
(4)高压静电纺丝仪操作流程：
依次打开main switch，light；设置转速Drum(转速)：300rpm；设置X-axiortsliding(X轴移动速度)：5.3mm/s；设置注射泵流量：1mL/h；电压：21.86kV，然后开始运行40分钟。
(5)结束时，先关闭注射泵、电压、滑台，再关闭收丝器，小心取出材料；
(6)将制作完成的材料置于真空干燥箱，抽真空，抽两次(每次过夜)，得到机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架(PLGA-DSC)，其结构如图1所示。
5、扫描电子显微镜(SEM)检测
通过SEM(FEI Quanta 200)检查PLGA-DSC支架的形态学特性。为了准备成像样品，将支架粘贴到导电胶带上，冷冻干燥，并在其上涂金120s，置于扫描电镜下观察。
如图2所示，将成年大鼠脊髓脱细胞后冻干得到脱细胞脊髓材料(DSC)，然后将所得的DSC通过电纺的方法在外围纺一个PLGA外壳，得到PLGA-DSC支架，PLGA外壳和脱细胞脊髓(DSC)形成紧密的一体化结构。
6、材料机械性能的检测
将将带有或不带有PLGA薄壳的DSC支架材料(即PLGA-DSC支架和步骤3制备得到的DSC材料)在电子万能试验机(UTM6104，Sunstest Corp.，中国))上进行材料的压缩力学性能测试，预载荷为0.1N，最大压缩应变10％，压缩速率为1mm/min，计算机屏幕上显示为应力-应变曲线，分析材料(n＝5)的力学性能。计算应力应变的线性区域的斜率，可以得到压缩模量。
如图3所示，随着应变增加，PLGA-DSC的应力比DSC增加，压缩模量也大大提高，提高大约10倍左右。可见，PLGA-DSC支架材料的机械性能得到了提高。
7、将机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架移植于脊髓全横断大鼠中
大鼠术前腹腔内注射戊巴比妥钠(0.064mg/10g)进行麻醉。经固定体位、备皮消毒后，在无菌条件下切开皮肤、浅筋膜，用器械沿T8-T10(T表示胸椎的节段)两侧棘突顺腰棘肌群走向钝性分离肌肉和韧带，用自制拉钩固定手术区域，清晰暴露T9棘突和椎弓，然后用有齿镊轻提T9棘突，用眼科持针钳沿T9-T10椎弓间隙轻轻咬开椎弓根部，并逐渐咬下T9椎弓，暴露T10段脊髓。用直尖小梁剪剪开硬脊膜后，将一侧刀脚插到底部，快速全横断整个脊髓，在距头端横断处2mm的地方再次横断脊髓，将中间的脊髓组织用显微镊小心取出，确保横断完全，充分止血后，将步骤4构建好的机械性能增强型脱细胞脊髓生物材料支架(PLGA-DSC支架)填塞入脊髓组织缺损区(以DSC支架为对照)，依肌层、皮下组织、皮肤顺序逐层缝合。术后做好标记，每只动物肌肉注射青霉素(16万单位)1mL/d，连续3天，用手在膀胱区适度按压进行人工排尿，每日1-2次。为防止未长好的伤口被咬开，术后单笼喂养。此后，依据膀胱功能恢复情况，可逐渐减少排尿次数，动物饲养到7天和2个月(8周)后取材检测，期间给以保温，自然光照以及充分的饮食。
7.1、急性期(7天)周围结缔组织浸润进入支架的情况检测
将PLGA-DSC和DSC支架植入大鼠脊髓全横端损伤部位(缺损区域2毫米)后，在急性期(7天)通过组织学(H&E染色和免疫荧光染色)检查评估周围结缔组织浸润进入支架的情况。
(1)H&E(苏木精和伊红)染色
H&E染色包括以下步骤：
1)将包含损伤/移植区的3厘米的大鼠脊髓用冰冻切片机行水平切，片厚30微米。切好的冰冻切片储存在－30℃保存。染色之前，将脊髓组织冰冻切片在室温复温15分钟，然后在0.01MPBS中漂洗3次，每次10分钟；2)将切片在蒸馏水中洗1分钟，然后在苏木精中染色10分钟；3)将样品用蒸馏水洗涤1分钟以除去过量的染料溶液；4)切片在1％酸性酒精(含70％酒精的1％HCl)浸泡持续20秒；5)将样品洗净用自来水冲洗约30分钟，直到颜色变成蓝色；6)将切片在95％的酒精中浸泡5分钟；7)在1％伊红溶液浸泡1分钟；8)将样品在80％的酒精中浸泡两次，每次20秒；(9)样品以递增浓度的酒精脱水(90％的酒精20秒钟；95％的酒精2分钟；100％的酒精两次，每次5分钟)；10)将切片在二甲苯中两次透明化15分钟；11)最后，用中性树脂盖住样品，用盖玻片封住切片，干燥后在显微镜下观察样品。
(2)免疫荧光染色(荧光核染料染色)
免疫荧光染色包括以下步骤：
1)将包含损伤/移植区的3厘米的大鼠脊髓用冰冻切片机行水平切，片厚30微米。切好的冰冻切片储存在－30℃保存。染色之前，将脊髓组织冰冻切片在室温复温15分钟，然后用0.01MPBS洗10分钟；2)用10％山羊血清在37℃下封闭30分钟；3)再加上0.3％TritonX-100稀释的一抗(α-SMA，CD206，CD68，CCR7等)孵育在4℃下过夜；4)第二天，将切片用PBS洗三次，每次10分钟；5)在37℃下与二抗孵育1小时；6)用核染料Hochst33342复染细胞核；7)最后，用封片剂和盖玻片封片后在共聚焦显微镜(Zeiss LSM800，德国)下观察。
如图4所示的H&E染色显示，PLGA薄壳保留在支架的外层，还未降解，PLGA-DSC支架的纵轴与宿主脊髓的纵轴处于同一平行线。在损伤/植入区域没有观察到由周围组织引起的明显压迫(如图4A中的箭头所示)。但是，不受保护PLGA外壳，DSC支架被挤压到受伤/植入的中心区域，周围是致密层的嗜碱性细胞和嗜酸性细胞胶原蛋白丰富的区域，植入的DSC塌陷变形且丢失它们的原始方向(图4B)。这表明PLGA薄外壳提供足够的机械强度以承受源自周围的纤维化疤痕的压力。高倍图像(图4C/D)显示了PLGA外壳外的薄层脑膜成纤维细胞，少数细胞迁移到PLGA外壳并穿透了此屏障。相反，对照材料DSC组则有大量的成纤维细胞积聚在脑膜下，并在受伤/植入区域的中心有明显的迁移轨迹。α-SMA的免疫染色(一种成肌纤维细胞标记，是疤痕的主要介质，通过针对α-平滑肌肌动蛋白的免疫染色来检测)结果显示，PLGA外壳外侧的细胞表现出很强的α-SMA表达，与之形成鲜明对比的是，在PLGA外壳的内侧(即在DSC矩阵内部)只能观察到可忽略不计的α-SMA阳性细胞(图4E)，证明PLGA外壳能为DSC提供回弹力屏障，以防止纤维化组织的侵袭。但是，在对照组，如果没有PLGA屏障，肌纤维母细胞会直接渗入DSC支架(如图4F所示，α-SMA阳性免疫染色出现在支架内)。这些结果表明，薄的PLGA外壳可以作为隔离脑膜成纤维细胞浸润的有效屏障，微环境中神经再生的纤维化侵袭会相对较少。
7.2、慢性期(2个月)损伤区免疫细胞的极化和空洞情况检测
将PLGA-DSC和DSC支架植入大鼠脊髓全横断损伤部位，在慢性期(2个月)通过CCR7和CD68，以及CD206和CD68免疫荧光双标法评估损伤区免疫细胞的极化情况，并通过H&E染色评估损伤区空洞的情况。H&E染色和免疫荧光染色方法同7.1。
如图5的结果显示，PLGA-DSC支架的植入可诱导巨噬细胞/小胶质细胞从M1型向M2型极化(M1和M2巨噬细胞/小胶质细胞两种状态中，M1型被认为是促炎型，M2型被认为是抑炎型)，相对于SCI组(图5B、D和E)，在PLGA-DSC组(图5A、E)中观察到较少的CCR7/CD68双阳性细胞(M1型)；同时，发现更多的CD206/CD68双阳性细胞(M2型，如图5C、E所示)。而在SCI组中，M1仍然是主要的巨噬细胞/小胶质细胞亚型，M1亚型(促炎型)对M2亚型(抑炎型)表现出极化现象。表明PLGA-DSC支架可能有助于浸润到巨噬细胞中的巨噬细胞/小胶质细胞变成抑炎型，这与典型的慢性病的炎性环境相比，有利于SCI后组织修复的微环境。HE染色显示，PLGA-DSC支架的植入有利于缩小脊髓损伤区的空腔区域，PLGA-DSC组的脊髓腔面积明显小于SCI组(P<0.05，n＝5；图5F、G)。以上结果说明，PLGA-DSC支架植入可减轻炎症并减少脊髓损伤后的空洞形成。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
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