一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法
阅读说明：本技术 一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法 (Method for extracting yeast cell wall polysaccharide with high immunocompetence ) 是由 江建梅 徐婷婷 李丹丹 姜峰 刘立娟 周雪玲 杨文娇 刘银升 陈志颖 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然产物有效成分的提取领域,提出了一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法,包括以下步骤：S1、啤酒酵母预处理S2、冻融法破壁：将预处理的啤酒酵母泥置于-20℃下冷冻1～2h,再置于80℃水中骤然升温使其融化,后4000r/min离心5～10min,如此反复3次,得沉淀物；S3、酶解：将S2所得的沉淀物与蒸馏水按1:(10～15)的体积混合,用盐酸调pH值为6～8,加入蛋白酶、多糖酶、复配促进剂,进行超声波处理,将混合物5000r/min离心5～10min,收集上清液；S4、洗涤干燥：上清液用1～2倍体积的质量浓度为60％～85％乙醇沉淀,沉淀物丙酮洗涤两次,真空干燥至恒重即得酵母细胞壁多糖干品。通过上述技术方案,解决了现有技术中的纯度、提取率低,免疫活性不佳的问题。(The invention relates to the field of extraction of active ingredients of natural products, and provides a method for extracting yeast cell wall polysaccharide with high immunocompetence, which comprises the following steps: s1, beer yeast pretreatment S2, freeze-thaw method wall breaking: freezing the pretreated beer yeast paste at-20 ℃ for 1-2 h, then placing the frozen beer yeast paste in 80 ℃ water to suddenly raise the temperature to melt the beer yeast paste, centrifuging the beer yeast paste for 5-10 min at 4000r/min, and repeating the steps for 3 times to obtain a precipitate; s3, enzymolysis: mixing the precipitate obtained in the step S2 with distilled water according to the volume of 1 (10-15), adjusting the pH value to 6-8 by using hydrochloric acid, adding protease, polysaccharidase and a compound accelerator, carrying out ultrasonic treatment, centrifuging the mixture at 5000r/min for 5-10 min, and collecting supernatant; s4, washing and drying: precipitating the supernatant by using 1-2 times volume of 60-85% ethanol, washing the precipitate twice by using acetone, and drying in vacuum to constant weight to obtain the dried yeast cell wall polysaccharide. Through the technical scheme, the problems of low purity, low extraction rate and poor immunocompetence in the prior art are solved.)
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分的提取领域，具体的，涉及一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法。
背景技术
酵母细胞壁主要由碳水化合物及蛋白质组成，碳水化合物主要为葡聚糖和甘露聚糖。酵母细胞壁多糖能被动物体内有益菌利用的功能性寡糖，作为一种绿色非营养调控物质，影响糖代谢，促进肠道功能，人体消化道中稳定性好，活性高，具有一定的免疫调节功能，如对沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肉毒梭状芽孢杆菌和肉毒梭状芽孢杆菌等有很好的抑制作用。此外，酵母细胞壁多糖对沙门氏肠炎杆菌、摩氏变形菌、柠檬酸杆菌具有100％的截取作用；其通过物理吸附或直接结合霉菌毒素而不影响其他成分。
由于酵母细胞中的蛋白质和脂类等物质与细胞壁多糖以大分子糖类聚合物的形式存在，因此需要对细胞壁多糖进行分离、提取后再利用。目前，酵母多糖有效成分提取的方法较多，如研磨法、冻融法、高压均质法、超声波法、碱溶法、常规水提法、索氏提取法等，这些传统方法存在着提取率低、纯度不高等不足。
发明内容
本发明提出一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法，解决了现有技术中的纯度、提取率低，免疫活性不佳的问题。
本发明的技术方案如下：
一种高免疫活性酵母细胞壁多糖的提取方法，包括以下步骤：
S1、啤酒酵母预处理：将啤酒酵母与水按照质量体积比为1:(10～20)的比例混合，充分搅拌均匀，4000r/min离心5～10min，反复洗涤，经100目筛过滤，去除可见杂质，后加入与水等体积的5％酒石酸溶液，搅拌静置除味，4000r/min离心5～10min，得到啤酒酵母预处理物；
S2、冻融法破壁：将预处理的啤酒酵母泥置于-20℃下冷冻1～2h，再置于80℃水中骤然升温使其融化，后4000r/min离心5～10min，如此反复3次，得沉淀物；
S3、酶解：将S2所得的沉淀物与蒸馏水按1:(10～15)的体积混合，用盐酸调pH值为6～8，加入蛋白酶、多糖酶、复配促进剂，进行超声波处理，将混合物5000r/min离心5～10min，收集上清液；
S4、洗涤干燥：上清液用1～2倍体积的质量浓度为60％～85％乙醇沉淀，沉淀物丙酮洗涤两次，真空干燥至恒重即得酵母细胞壁多糖干品。
作为进一步的技术方案，所述步骤S3中超声波处理的条件为温度45℃，超声波功率50W，时间4S，间歇5S，超声时间30min。
作为进一步的技术方案，所述步骤S3多糖酶包括2.5～5‰甘露聚糖酶、0.2～1‰葡聚糖酶、0.2～1‰纤维素酶，所占比例按照啤酒酵母干料质量比计算。
作为进一步的技术方案，所述蛋白酶包括无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或多种。
作为进一步的技术方案，所述蛋白酶加入量为啤酒酵母干料的0.1～0.5％。
作为进一步的技术方案，所述复配促进剂为葡萄糖酸锰和葡萄糖酸钴，其质量比为(4～5):1。
作为进一步的技术方案，所述复配促进剂的质量为蛋白酶的5～10％。
本发明的有益效果为：
1.本发明通过超声波与酶解协同作用，从啤酒酵母细胞壁中提取多糖，提取率高，所得多糖纯度高，多糖的免疫活性高。
2.本发明通过超声波的空化作用，原料细胞壁易于破碎，从而有助于多糖的溶出，提高多糖的提取率，超声波辅助提取可以减少提取时间，降低提取温度优点。
3.本发明添加蛋白酶，通过酶的水解作用，为加速细胞壁的破解，使细胞壁的蛋白质层水解，水解细胞内的大分子蛋白质，使其成为能渗透到细胞外的比细胞壁上的孔隙更小的分子。通过添加促进剂葡萄糖酸锰和葡萄糖酸钴能溶解细胞壁上脂类物质及其他组分从细胞内渗透出来，促进多糖的提取率和纯度，同时，葡萄糖酸锰和葡萄糖酸钴的金属离子能够促进细胞壁中蛋白酶对蛋白质的酶解作用，加快酶解效率，提高纯度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
啤酒酵母100g加水1L充分搅拌均匀，4000r/min离心5min，反复洗涤，经100目筛网过滤，去除可见杂质，然后加入与1L 5％的酒石酸溶液，搅拌静置除味，4000r/min离心5min，得到啤酒酵母预处理物；将预处理的啤酒酵母泥置于-20℃下冷冻1h，再置于80℃水中骤然升温使其融化，后4000r/min离心5min，如此反复3次，得沉淀物；在沉淀物中加入15倍蒸馏水，用盐酸调pH值为6，加入无花果蛋白酶100mg、葡萄糖酸锰4mg、葡萄糖酸钴1mg、甘露聚糖酶250mg、葡聚糖酶20mg、纤维素酶20mg，45℃下进行超声波处理30min，超声波功率50W，时间4S，间歇5S，将混合物5000r/min离心5min，收集上清液；上清液用1～2倍体积的95％无水乙醇沉淀，沉淀物丙酮洗涤两次，真空干燥至恒重即得酵母细胞壁多糖干品，多糖纯度91.24％，多糖提取率25.13％。
其中多糖纯度测定采用苯酚-硫酸比色法，多糖提取率计算公式如下：
多糖提取率＝C*V/m×100％
式中：C为上清液中多糖质量浓度，mg/L；V为上清液的总体积，L；m为酵母泥干质量，g。
实施例2
啤酒酵母100g加水1L充分搅拌均匀，4000r/min离心10min，反复洗涤，经100目筛过滤，去除可见杂质，后加入与1L 5％的酒石酸溶液，搅拌静置除味，4000r/min离心10min，得到啤酒酵母预处理物；将预处理的啤酒酵母泥置于-20℃下冷冻2h，再置于80℃水中骤然升温使其融化，后4000r/min离心10min，如此反复3次，得沉淀物；在沉淀物中加入15倍蒸馏水，用盐酸调pH值为7，加入木瓜蛋白酶500mg、葡萄糖酸锰41.6mg、葡萄糖酸钴8.4mg、甘露聚糖酶500mg、葡聚糖酶100mg、纤维素酶100mg，45℃下进行超声波处理30min，超声波功率50W，时间4S，间歇5S，将混合物5000r/min离心10min，收集上清液；上清液用1～2倍体积的95％无水乙醇沉淀，沉淀物丙酮洗涤两次，真空干燥至恒重即得酵母细胞壁多糖干品，多糖纯度为92.19％，多糖提取率25.88％。
实施例3
啤酒酵母100g加水1L充分搅拌均匀，4000r/min离心10min，反复洗涤，经100目筛过滤，去除可见杂质，后加入与1L 5％的酒石酸溶液，搅拌静置除味，4000r/min离心10min，得到啤酒酵母预处理物；将预处理的啤酒酵母泥置于-20℃下冷冻2h，再置于80℃水中骤然升温使其融化，后4000r/min离心10min，如此反复3次，得沉淀物；在沉淀物中加入15倍蒸馏水，用盐酸调pH值为7，加入中性蛋白酶250mg、葡萄糖酸锰20mg、葡萄糖酸钴5mg、甘露聚糖酶400mg、葡聚糖酶80mg、纤维素酶80mg，45℃下进行超声波处理30min，超声波功率50W，时间4S，间歇5S，将混合物5000r/min离心10min，收集上清液；上清液用1～2倍体积的95％无水乙醇沉淀，沉淀物丙酮洗涤两次，真空干燥至恒重即得酵母细胞壁多糖干品，多糖纯度为92.67％，多糖提取率26.24％。
对比例1
与实施例3的区别在于，不进行超声波处理，其他过程相同，得到的酵母细胞壁多糖纯度为87.34％，多糖提取率19.96％。
对比例2
与实施例3的区别在于，不添加葡萄糖酸钴，只添加葡萄糖酸锰25mg，其他过程相同，得到的酵母细胞壁多糖纯度为89.61％，多糖提取率22.52％。
对比例3
与实施例3的区别在于，不添加葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钴，其他过程相同，得到的酵母细胞壁多糖纯度为87.12％，多糖提取率19.42％。
免疫活性实验
本实验仅选取本发明的实施例与对比例中有代表性的例子进行。
将90只小鼠随机分成3组，分别为正常对照组、试验1组(实施例3组)、试验2组(对比例3组)，每组3个重复，每个重复10只。全部小鼠饲喂基础日粮，适应性喂养10天后，实验1组小鼠每天上午灌服0.2ml浓度为80mg/ml的实施例3制得酵母多糖溶液1次，实验2组小鼠每天上午灌服0.2ml浓度为80mg/ml的对比例2制得酵母多糖溶液1次，正常对照组小鼠每天上午灌服0.2ml 0.9％氯化钠溶液1次，连续喂药15天。
给药15天后，每组每个重复取2只小鼠称重，解剖摘取免疫器官脾脏和胸腺，去除筋膜和脂肪组织后称重，根据公式计算脾指数和胸腺指数：
免疫器官指数＝免疫器官重(mg)/体重(g)
给药15天后，每组每个重复取2只小鼠腹腔注射4％的淀粉溶液1ml，诱导巨噬细胞向腹腔趋化。24h后，每只小鼠腹腔注射新鲜的10％鸡红细胞悬液1ml，30min后，颈椎脱臼处死小鼠，迅速固定于小鼠操作板上。经腹腔注入2ml 0.9％氯化钠溶液，轻揉腹部1min。然后无菌打开小鼠腹腔，吸出1ml腹腔灌洗液，滴于洁净载玻片上，移至37℃温箱孵育30min。经0.9％氯化钠溶液漂洗，去除未贴片细胞，晾干。甲醇溶液固定后，用Giemsa—磷酸盐缓冲液染色20min，随后蒸馏水漂洗，晾干，在光学显微镜下观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬和清除情况，计算吞噬百分率和吞噬指数，计算公式如下：
吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100％；
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。
表1 3组免疫活性实验数据比较
本发明的对比例1没有进行超声波处理，在其他条件与实施例3相同的情况下，多糖的提取率较低，纯度较低，因为超声波的作用可以减少酶解时间，降低酶解温度，所以当没有进行超声处理时，相同的温度和时间不足以让酶解完全进行，可见本发明的超声波处理的工艺与酶解温度和时间起着相互辅助的协同作用，提高纯度和提取率。
对比例2没有添加葡萄糖酸钴，对比例3没有添加葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钴，对比例3所得的多糖纯度与提取率都低于对比例2，同时对比例2与实施例3相比，添加的促进剂的量是相同的，但是缺少了葡萄糖酸钴，纯度和提取率都低于实施例3，可见，当两者复配时，酶解效果最好，从而提高了纯度和提取率。
对比例3没有添加促进剂，所得多糖的提取率较低，纯度较低，同时与实施例3相比，提取的多糖的免疫活性较低，实施例3对小鼠巨噬吞噬细胞吞噬能力有显著提高作用，免疫器官指数也高于对比例3，说明本发明的实施例通过添加葡萄糖酸锰和葡萄糖酸钴，促进细胞壁蛋白质的酶解作用，加快酶解效率，提高纯度，通过纯度的提高，导致所得多糖的免疫活性也较高。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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