一种重组新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白、其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种重组新型冠状病毒s-rbd三聚体蛋白、其制备方法和应用 (Recombinant novel coronavirus S-RBD trimer protein, and preparation method and application thereof ) 是由 李启明 梁宇 苏计国 杜丽芳 侯俊伟 张学峰 张靖 靳玉琴 唐芳 刘兆明 韩子泊 于 2021-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白,所述三聚体蛋白由三聚体形式的新型冠状病毒S蛋白RBD区第308～603位氨基酸片段构成。本发明制备的疫苗以S-RBD三聚体蛋白为抗原,辅以佐剂后,免疫机体,可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体,可以用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病。(The invention discloses a recombinant novel coronavirus S-RBD trimer protein, which is composed of 308-603 amino acid segments of a trimer-shaped novel coronavirus S protein RBD region. The vaccine prepared by the invention takes S-RBD tripolymer protein as antigen, is supplemented with adjuvant, immunizes organism, can generate high-titer protective neutralizing antibody aiming at novel coronavirus, and can be used for treating and/or preventing novel coronavirus (SARS-CoV-2) infection and/or novel coronavirus diseases.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体 蛋白、其制备方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正 冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、类SARS病毒种、单股 正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大部分编码非结构蛋白， 参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白，如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白 (nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b和orf14，这些 蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引起免疫反应的主 要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和S2亚基之间的边界 处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保持非共价结合。S2 亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主细胞的融合。远端 S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1和CTD2，其中 RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒侵染宿主细胞， 因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
截至目前，全球获批上市的疫苗共有7款，分别是美国批准紧急使用授权 (EUA)的BNT162b2和mRNA-1273，英国批准紧急使用授权(EUA)的 AZD1222，中国国药中生(北京公司和武汉公司)和北京科兴各自附条件上市 的3款新冠灭活疫苗、康希诺生物腺病毒载体疫苗以及智飞生物重组蛋白疫苗， 印度批准紧急使用授权(EUA)国产灭活疫苗，以及俄罗斯批准上市的“卫星V”， 另外还有数十种疫苗处于临床研究不同阶段。利用基因工程技术研制重组疫苗 由于其高度的安全性和有效性已被广泛证实，加之当前新冠病毒变异株不断出 现并且占比持续上升，现有疫苗及中和抗体对特定突变株的保护效果大幅降低， 引发各界对新冠疫情走势及疫苗和药物有效性的担忧。
因此，开发一种可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体的重组 疫苗已成为当务之急。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中缺少可产生针对新型冠状病毒高滴 度的保护性中和抗体的重组疫苗的缺陷，提供了一种重组新型冠状病毒S-RBD 三聚体蛋白。
本发明提供的技术方案为：
一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，所述三聚体蛋白由三聚体形式 的新型冠状病毒S蛋白RBD区第308～603位氨基酸片段构成。
本发明基于新冠病毒S-RBD区结构学特征，利用计算生物学方法设计了一 种全新的融合蛋白，该蛋白包含有三个RBD结构域，在可以不引入任何外源连 接臂或其它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式，实现S-RBD蛋 白三聚化，利用基因工程技术重组表达并纯化出S-RBD三聚体蛋白后，与佐剂 混合制备成疫苗，免疫动物可产生针对新型冠状病毒高滴度的保护性中和抗体， 用于治疗和/或预防新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病 (COVID-19)。另外，由于RBD区功能明确，结构清楚，负责识别受体细胞的 ACE区，同时针对RBD产生的抗体功能明确，最大程度避免诱导机体产生抗体 依赖的增强作用(Antibody Dependent Enhancement，ADE)。
本发明中所述的三聚体蛋白可由三个相同序列的多肽亚基通过自组装形 成。在本发明的实施方式中，上述三个相同序列之间可以包含合适的连接体 (Linker)或间隔区，其可以为寡肽或多肽，其作用可以为增加柔性。
但作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述三聚体蛋白的一级结构为 三个所述氨基酸片段按照N末端至C末端的顺序连接。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示或与其具有95％以上同源性的序列。
在上述实施方式中，本发明三聚体蛋白在可以不引入任何外源连接臂或其 它无关成分情况下，形成抗原构象稳定的三聚体形式。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述融合蛋白的氨基酸序列具 有95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。本领域技术人员可以对本 说明书中所述融合蛋白的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突 变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的 氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述重 组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述融合蛋白还包含选自信号肽、标 签或免疫增强肽中的一种或几种。所述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的 表达；所述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱 甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上 述功能性序列可任意组合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上 述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，发明人对所述三聚体蛋白的密码 子进行了优化，得到的所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示或与其具有95％以 上同源性的序列。
上述与其具有95％以上同源性的序列是指与所述核苷酸序列具有95％、 96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述核苷酸序列，通过化学合成或 PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进 行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知 文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒 等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中 可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述载体为本发明中所述核酸分 子的表达载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述核 酸分子或上述载体。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母细胞、 昆虫细胞或哺乳动物细胞；
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体 蛋白或上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤A)制备所述核酸分子，构建所述表达载体，将表达载体转化或转染 至所述宿主细胞内；
步骤B)利用步骤A)的产物进行蛋白质表达；
步骤C)纯化步骤B)中获得的表达产物，得到所述重组新型冠状病毒S-RBD 三聚体蛋白或融合蛋白。
其中，步骤A)所述核酸分子包含编码上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚 体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示或与其具有95％以上同源性的序列。
可使用任意合适的分子生物学方法根据本说明书中所述核苷酸序列制备所 述核酸分子。
其中，步骤A)所述构建表达载体可以使用任意合适的方法将上述核苷酸 序列构建在宿主细胞相应的表达载体中。
然后将表达载体转化或转染至所述宿主细胞内。作为优选，在本发明的一 个实施方式中，发明人在构建CHO细胞表达载体后将其转染至293FT细胞或 CHO细胞内构建重组细胞株。
其中，步骤B)所述蛋白质表达可以根据所使用的不同表达系统对重组蛋白 进行表达。进一步地，在本发明的一个实施方式中，发明人通过有限稀释法筛 选得到能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白的细胞株。
其中，步骤C)所述纯化可以为任意合适的方法。例如，盐析法、沉淀法、 透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析、疏水层析法、亲和层析法，等等。 作为优选，在本发明的一个实施方式中，采用离子交换和疏水层析的方法纯化 上述S-RBD三聚体蛋白或融合蛋白。
当然，根据现有技术，在进行纯化步骤之前，还应包含对目标蛋白质的收 集过程，例如，对富含目标蛋白质的细胞培养液上清的收集；对已表达目标蛋 白质后的所述宿主细胞进行破碎后收集的过程，所述破碎可以使用例如，超声 波破碎、反复冻融破碎、化学处理法等任意合适的破碎方法。上述对宿主细胞 的收集过程也应理解为包含在所述纯化的范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了所述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、 所述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体或所述宿主细胞在制备用于治疗和/或 预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种疫苗，所述疫苗包含所述重组新型冠 状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白，以及佐剂。
在本发明的实施方式中，所述疫苗为重组蛋白疫苗(或称基因工程亚单位 疫苗)。进一步地，在本发明的另外一些实施方式中，所述疫苗还可以为基因工 程载体疫苗，或者可以为核酸疫苗，上述疫苗包含本说明书中所述核苷酸序列。
在本发明所述疫苗中，可以包含任意合适的佐剂。但作为优选，在本发明 的实施方式中，所述佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG。更优选地，所述 佐剂为氢氧化铝。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗的制备方法，将纯化所得的所述 重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白或所述融合蛋白与所述佐剂混合。
本发明的另一个方面，是提供了一种基因工程载体疫苗，所述基因工程载 体疫苗包含上述核酸分子。
在本发明的实施方式中，所述基因工程载体疫苗中的载体可以为复制型或 非复制型载体，例如，腺病毒、痘苗病毒、霍乱弧菌、沙门氏菌、卡介苗，等。
本发明的另一个方面，是提供了一种核酸疫苗，所述mRNA疫苗包含编码 上述重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白，或编码上述融合蛋白的核苷酸序列。
所述核酸疫苗可以为DNA疫苗或RNA疫苗，特别是mRNA疫苗。
本发明的另一个方面，是提供了上述疫苗在治疗和/或预防新型冠状病毒感 染和/或新型冠状病毒引起的疾病中的用途。
所述新型冠状病毒引起的疾病优选为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所 述疫苗，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐 水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定 剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
本发明所述药物组合物也可以和其他治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/ 或新型冠状病毒引起的疾病的药物在有效安全的剂量下联合使用。
本发明的另一个方面，是提供了一种引发受试者针对新型冠状病毒的免疫 应答或治疗受试者的新型冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的 所述疫苗或所述药物组合物。
所述受试者可以为人类或者其他动物。
所述施用可以为肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
本发明的有益效果：
本发明制备的疫苗以S-RBD三聚体蛋白为抗原，辅以佐剂后，免疫机体， 可产生针对新型冠状病毒的高滴度保护性中和抗体，可以用于治疗和/或预防新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染和/或新型冠状病毒疾病。
附图说明
图1为本发明实施例1中新型冠状病毒S蛋白结构分析图，其中，A为S 蛋白单体结构(基于PDB代码为6zgg的坐标文件，采用UCSF Chimera软件绘 制)，S1结构单元包括NTD、RBD、SD1和SD2结构域；B为RBD与ACE2 受体复合物结构(基于PDB代码为6m0j的坐标文件，采用UCSF Chimera软件 绘制)；
图2为本发明实施例1中S-RBD三聚体蛋白设计图，其中，A为S-RBD单 体蛋白结构；B为S-RBD三聚体蛋白结构；
图3为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的SDS-PAGE图，其 中，泳道1为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道2-7为纯化过程中的S-RBD 三聚体蛋白；泳道M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、150、100、 70、50、40、30、20、15、10、5)；
图4为本发明实施例2中纯化所得S-RBD三聚体蛋白的Western-blot鉴定 图，其中，泳道1为阴性对照；泳道2为纯化获得的S-RBD三聚体蛋白；泳道M为蛋白质marker(分子量标准为：kDa：250、130、100、70、55、35、25、 15、105)；
图5为本发明实施例3中纯化所得S-RBD三聚体蛋白与MM43和MM57 中和性单克隆抗体结合曲线图；
图6为本发明实施例5中血清特异性IgG滴度检测结果图；
图7为本发明实施例5中针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图；
图8为本发明对比例1中血清特异性IgG滴度检测结果图；
图9为本发明对比例1中针对野病毒的血清中和抗体滴度检测结果图。
序列说明
SEQ ID No.1为本发明实施例中重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的氨 基酸序列；
SEQ ID No.2为本发明实施例中重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的核 苷酸序列；
SEQ ID No.3为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的氨基酸 序列；
SEQ ID No.4为本发明对比例中新型冠状病毒S-RBD二聚体蛋白的核苷酸 序列。
具体实施方式
本发明公开了一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应 用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指 出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都 被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围 的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技 术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领 域技术人员所通常理解的含义。下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
术语“新型冠状病毒”，即SARS-CoV-2，属巢病毒目(Nidovirales)、冠状 病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、 类SARS病毒种、单股正链RNA病毒，有包膜，基因组全长约为29.9kb，绝大 部分编码非结构蛋白，参与病毒复制和翻译等功能，少部分序列编码结构蛋白， 如：刺突蛋白(spike protein，S)、M蛋白(membrane protein)、E蛋白(envelope protein)和N蛋白(nucleo protein)，此外还有若干附属蛋白：3a,3b,p6,7a,7b,8b,9b 和orf14，这些蛋白均参与病毒组装。S、M和E蛋白构成病毒囊膜，是病毒引 起免疫反应的主要表面抗原。其中S蛋白是一种跨膜糖蛋白，分子量约为 150kDa，在病毒表面形成突出的同源三聚体。S由两个功能亚基组成，在S1和 S2亚基之间的边界处(S1/S2裂解点)被切割，这两个亚基在融合前构象中保 持非共价结合。S2亚基也由多个结构域构成，它的功能主要是介导病毒与宿主 细胞的融合。远端S1亚基在结构上分为四个不同的结构域：NTD、RBD、CTD1 和CTD2，其中RBD是受体结合结构域，主要负责与宿主细胞表面的受体血管 紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)结合，从而介导病毒 侵染宿主细胞，因此S蛋白及RBD均为目前基因工程疫苗研发的主要靶标。
术语“三聚体形式”，是蛋白质四级结构中的一种类型。蛋白质四级结构是 指蛋白质亚基相对于彼此的数目和排列(Chou,Kuo-Chen；Cai,Yu-Dong. Predicting proteinquaternary structure by pseudo amino acid composition.Proteins: Structure,Function,and Bioinformatics.1November 2003,53(2):282–289.)。其中 含有三个蛋白质亚基即为三聚体形式。
术语“一级结构”，是肽或蛋白质中氨基酸的线性序列。按照惯例，蛋白质 的一级结构被报道从氨基末端(N)端到羧基末端(C)端。
术语“融合蛋白”，fusion protein，是指通过DNA重组技术得到的一个、两 个或多个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而 进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，利用融合蛋白技术，可构建和表 达具有多种功能的新型目的蛋白。
术语“载体”，是可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使 插入的多核苷酸编码的蛋白质获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过 转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获 得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯 质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1 来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用 作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关 病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于， 启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体 还可含有复制起始位点。
术语“宿主细胞”，是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。， 这些技术包括转染病毒载体，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和 粒子枪加速引入裸DNA。
术语“治疗”，是指减少疾病病理的可能性，减少疾病症状的发生，例如在 一定程度上受试者具有更长的存活期或减少的不适。治疗可以是指当向受试者 给予疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至 少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发 作。
术语“受试者”是指接受预防、治疗、诊断的任何人或其他动物，特别是 其他哺乳动物。其他哺乳动物可以包括，例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、 山羊、兔子、大鼠、豚鼠、小鼠等。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实 施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：基于结构生物学设计重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白
通过对天然S蛋白三聚体空间结构分析(如图1所示)、并对RBD结构域 的N端和C端的空间距离进行计算，发现在不引入外源载体或序列的情况下， 可以利用RBD自身的结构特征实现三聚化，同时不会存在较大的空间位障，受 体结合位点和主要中和抗体表位也不会被遮蔽。基于此，截取新型冠状病毒 (Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片段(308～603位氨基酸)， N端和C端的间距为将三个相同RBD区片段首尾串联，形成一个新的融 合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用多聚体结构预测软件(initiodomain assembly，AIDA)和分子动力学模拟(GROMACS)，显示该融合蛋白包 含有三个独立RBD结构域，形成抗原构象稳定的三聚体形式(如图2所示)， 即为重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白。
实施例2：重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白的表达、纯化及鉴定
按照CHO细胞表达系统的密码子偏爱性，对SEQ ID NO.1氨基酸序列进行 密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示，构建CHO细胞表达载体 后转染至293FT细胞或CHO细胞内构建重组细胞株，通过有限稀释法筛选得到 能够稳定分泌表达S-RBD三聚体蛋白的细胞株。
经系列层析纯化后获得纯度≥90％的S-RBD三聚体蛋白。SDS-PAGE检测结 果如图3所示，蛋白分子量大小在100～150kD之间，同时可见有部分产品相关 物质，如二聚体蛋白和单体蛋白。将纯化后蛋白SDS-PAGE电泳后电转至PVDF 膜上，利用RBD特异性抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40591-T62；稀释度：2000倍)进行Western-blot鉴定(结果如图4所示)，纯化 后的蛋白可与RBD特异性抗体发生结合，具有良好的免疫原性。
实施例3：重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白与中和性单克隆抗体结合 生物学分析
将纯化后的S-RBD三聚体蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、 0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0.015625μg/ml、0.007813μg/ml，100μl/ 孔，包被至96孔酶标板上，4℃，8～12h，以空白孔为阴性对照；PBST溶液洗 板后加入封闭液，37℃封闭3h；PBST溶液洗板后分别加入稀释后的MM43单 克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号：40591-MM43，稀释度： 2000倍)或MM57单克隆抗体(厂家：北京义翘神州科技有限公司；货号： 40592-MM57；稀释度：2000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加 入稀释后的HEP标记的羊抗鼠IgG(厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司； 货号：ZB-2305；稀释度：10000倍)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板 后先后加入显色液(厂家：万泰生物)A和B，室温下显色5～10min，加入终 止液C；酶标仪上进行双波长(OD450nm和630nm)读值，确定cutoff值，并 绘制蛋白浓度-吸光度值曲线，结果如图5所示，可见S-RBD三聚体蛋白与MM43和MM57两种中和性单克隆抗体均具有良好的结合活性。
实施例4：重组新型冠状病毒疫苗制备
将纯化后的S-RBD三聚体蛋白稀释至2倍目标抗原浓度，与1.2mg/ml氢氧 化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附，并于磁力搅拌器上搅拌40～120min，转 速为200～300rpm，获得疫苗半成品，上清残留蛋白含量应低于总蛋白含量的 10％，半成品每瓶按0.5ml装量无菌分装后即为疫苗成品。
实施例5：重组新型冠状病毒疫苗免疫学效果评价
将实施例4中制备的重组新型冠状病毒疫苗按照表1所示动物试验方案经 腹腔注射免疫BALB小鼠，0.5ml/只。利用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的特异性IgG抗体滴度，利用野病毒微量中和试验检测中和抗体滴 度，可见免疫3针后可刺激小鼠产生较高滴度的抗体水平，血清特异性IgG结 果如图6所示，针对RBD蛋白的IgG抗体GMT值达到120万，野病毒微量中 和如图7所示，针对野病毒的中和抗体滴度GMT值为707。
血清特异性IgG抗体检测：采用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋 白的特异性IgG抗体水平，将RBD蛋白(购自北京义翘神州科技股份有限公司， 货号为40592-V08B)稀释至1μg/ml，并以100μl/孔包被于酶标板中，封闭后， 加入经系列稀释的血清，利用酶标记抗体(鼠源)检测信号，确定cut-off值， 阳性血清最高稀释倍数即为该血清样品的特异性IgG抗体滴度。
野病毒微量中和试验：该试验于BSL3级实验室完成，病毒株为2020XN4276 株，将系列稀释后的血清与病毒(100TCID50)等体积混合孵育，37℃温箱中和 2小时，加入到含有Vero-E6细胞(2×105/ml)的细胞培养板中，同时设置细胞 对照和病毒对照，37℃温箱中培养3～5天，观察细胞病变情况，采用 Reed-Muench法计算50％感染抑制率时血清稀释倍数，即为该血清样品的中和 抗体滴度。
表1.S-RBD三聚体蛋白免疫原性评价动物试验方案
对比例1：S-RBD三聚体蛋白和二聚体蛋白比较
截取新型冠状病毒(Genebank编号：MN908947.3)S蛋白RBD区序列片 段(319～537位氨基酸)，将两个相同RBD区片段首尾串联，形成一个二聚体融 合蛋白，氨基酸序列如SEQID NO.3所示，按照CHO细胞表达系统的密码子偏 爱性，对SEQ ID NO.3氨基酸序列进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.4所示，构建CHO细胞表达载体后转染至293FT细胞后，获得能够表达二 聚体蛋白的细胞株，经系列层析纯化后获得纯度≥95％的S-RBD二聚体蛋白，与 1.2mg/ml氢氧化铝佐剂按1:1比例(w/w)混合吸附后制备二聚体蛋白免疫物，与相同工艺制备的三聚体蛋白免疫物，经腹腔注射免疫BALB/c小鼠，抗原含量 为6.0μg/剂，铝佐剂含量为0.30mg/剂，按照0w，1w和2w免疫3针次，全程 免后2w采集并分离血清，利用ELISA方法检测免后血清中针对S-RBD蛋白的 特异性IgG抗体滴度，检测结果如图8所示，利用野病毒微量中和试验检测中 和抗体滴度，检测结果如图9所示，可见三聚体蛋白产生的抗体水平与二聚体 蛋白水平相当，特异性IgG抗体和中和抗体滴度差异均无统计学差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 国药中生生物技术研究院有限公司
<120> 一种重组新型冠状病毒S-RBD三聚体蛋白、其制备方法和应用
<130> /
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 887
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Met Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
20 25 30
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
35 40 45
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
50 55 60
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
65 70 75 80
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
85 90 95
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
100 105 110
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
115 120 125
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
130 135 140
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
145 150 155 160
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
165 170 175
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
180 185 190
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195 200 205
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
210 215 220
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly
225 230 235 240
Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro
245 250 255
Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
260 265 270
Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly
275 280 285
Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln
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Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
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Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
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Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
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attgtgagat tcccaaatat caccaacctt tgtccttttg gagaggtctt taatgccaca 120
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gggggtaact ataattacct gtacagattg ttcagaaaaa gcaaccttaa gccttttgag 480
agagacattt ccacagagat atatcaagct ggctctaccc cttgtaatgg agtggaaggt 540
ttcaactgct attttcctct gcagagctat ggctttcagc ccaccaatgg agtgggctat 600
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ggccctaaaa agagcaccaa cctggtaaag aacaaatgtg tcaattttaa tttcaatggc 720
cttactggca ctggagtgct aacagagtcc aataagaagt tcctaccttt tcaacagttt 780
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tatgcctgga atagaaagag aatcagcaac tgtgtagctg actactctgt tttgtataat 1080
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