发明背景

具有临床影响的晚期骨关节炎治疗的金标准是假体置换。这在年轻患者中尤其成问题，因为关节假体的持续时间有限，而且是昂贵的操作，这一问题证明了探索新的可能更有效的治疗方法的合理性。

骨髓中有一群非造血干细胞，称为基质祖细胞或间充质干细胞(MSC)。这些细胞的特征在于其多能性，即它们分化为其他细胞类型的能力。MSC具有成纤维细胞梭形形态群体，其表达CD73、CD90和CD105抗原，并显示缺乏造血抗原，单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的标志物。另外，当保持在适当的调节环境中时，它们保留了向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的体外分化能力。

根据其公认的再生和抗炎潜力，骨髓间充质干细胞(MSC)的关节内输注，例如在骨关节炎中的关节内输注，是这些新的研究领域之一。

在动物模型中对MSC的研究已证明，所述MSC在人体关节环境(如椎间盘、膝盖等)中输注后能够存活，并能够以剂量依赖性方式修复软骨。

因此，MSC具有再生受损或破坏的组织(例如骨骼、软骨和其他组织)的能力。此外，它们对T淋巴细胞的作用证明了它们调节免疫反应和控制炎症的能力。

MSC可以从不同的器官和组织获得，但是骨髓代表了其最佳和最容易获得的来源之一。

但是，骨髓中MSC的频率很低，仅占骨髓单核细胞的0.001％至0.01％。对于单次全身治疗，通常每公斤体重使用1.0×10⁶至2.0×10⁶个MSC，而在局部治疗中，局部给药的单剂量可高达20-40×10⁶个细胞，因此，该事实使得不可能从骨髓中原位直接收集如此大量的细胞。

冷藏可使骨髓间充质干细胞的一些等分试样仅以一剂施用，从而避免了对患者的连续干预并降低了部分制造成本。另外，它使我们最终可以进行不同剂量的治疗，从而提高了治疗的功效。

此外，与使用自体MSC相比，冷藏对于进行MSC的同种异体施用，降低成本并提供更有效的方式以治疗患者至关重要，而自体MSC需要从待治疗的同一患者新鲜制备，从而使治疗效率更低、更昂贵且后勤上更为复杂。

然而，冷藏不是一个直接的过程，通常会导致严重的细胞损伤，以及隐藏的损伤，这种损伤不会在细胞解冻时显现出来，而只是在后期才显现出来。这在其分化能力、其再生受损组织的能力以及进行所述再生的速度方面都损害了MSC的功能。此外，如果在施用MSC时冷冻保存剂(例如二甲基亚砜(DMSO))保持悬浮状态，则已经报告了不良反应，例如恶心、心动过速、心动过缓、低血压等。另一方面，以低至0.5％的浓度添加到细胞培养物中的DMSO会降低MSC的体外增殖速率。

另一方面，同种异体途径为患有自身免疫性疾病的患者提供了治疗的可能性，这些患者自身的细胞可能携带要治疗的疾病，因此没有治愈作用。此外，MSC的免疫原性远低于其他细胞类型，并且通常不会引发排斥反应，甚至针对供体的抗HLA抗原的产生通常也很低或无法检测到(J García-Sancho等人,Transplantation direct 3(9):e205)。

目前，有几项描述解冻后直接并且无预先处理，在血流中的冷藏的间充质细胞注射的工作。然而，总是优选将MSC局部接种在骨关节炎治疗的关节腔中，或接种在退行性椎间盘疾病中的椎间盘中，因为当采用同种异体治疗时，所有细胞都能够到达要治疗的部位，并且几乎不容易受到宿主免疫系统的攻击。另一方面，局部治疗要求事先去除冷冻保护剂，否则，冷冻保护剂(通常为二甲基亚砜(DMSO))会干扰MSC的增殖。即使去除了DMSO，也无法通过活力或代谢测定法检测到具有隐藏损伤的细胞，并且正如所解释的，一旦给药所述隐藏损伤就损害了它们的活力以及在其分化能力、其再生受损组织的能力以及进行所述再生的速度方面的功能。

例如，Marquez-Curtis等人(Cryobiology 71(2015)181-197)提供了有关用于冷藏和解冻间充质干细胞的不同条件/过程如何导致所获得的细胞产物的不同细胞活力和生长能力的综述。特别地，该综述提出了多种解决方案，以改善冷藏后获得的细胞产物的性质。一方面，Marquez-Curtis等人描述了调节使用二甲基亚砜(DMSO)的冷藏条件(冷冻速率、储存温度、冷冻保护剂的百分比)的不同方案，以改善解冻后的细胞产物质量并限制DMSO的毒性。另一方面，作者还提出了其他冷冻保护剂，例如：甘油；糖，例如海藻糖，棉子糖，乳糖，蔗糖等；抗氧化剂；凋亡抑制剂或其混合物；以及以下过程：玻璃化；在磁场中冷冻；等，以试图保持解冻后获得的细胞产物的质量，同时避免毒性问题，特别是来自使用DMSO的毒性问题。在综述冷藏的状态时，该文章指出，已知解冻后在活细胞的恢复中发生了重大损失，作者仅提出了多种可能的解决方案，其中包括培养解冻后的细胞(没有指明培养条件)，在冷藏之前培养细胞，使用化学调节剂(如白藜芦醇或salubrinal)以减少细胞凋亡，在这些建议中未提供任何具体指导。

Wei等人(Veterinary surgery,2018；47:19-29)还认识到DMSO的毒性问题，并承认去除DMSO的实际复杂性，指出使用所述冷冻保护剂会导致细胞损失并减少菌落形成单位的数量。从这个意义上讲，该文章指出了不同于DMSO的其他冷冻保护剂的开发，作为开发具有合适的表型、分化和活力概况(viability profile)的干细胞产品的向导，这些干细胞产品可在解冻后直接使用，避免了DMSO的毒性问题。

同样地，Yuan等人(Cryotherapy,2016:18:860-869)同意由于其毒性问题而需要替代DMSO，并提出4.5(一种蛋白质补充剂)作为冷冻保护剂来替代DMSO并获得细胞产物，该细胞产物在解冻后直接具有合适的表型、分化和活力概况。

国际专利申请公开WO 2010/064054 A1也遵循相同的发展路线，其描述了常用冷冻保护剂DMSO的毒性。作为替代，该出版物提出了一种含有和抗氧化剂6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(trolox)的组合物，以储存包括间充质干细胞在内的干细胞，并冷藏它们，无需DMSO作为冷冻保护剂。再次，文献WO 2010/064054 A1提出在解冻后直接使用细胞。

国际专利申请公开WO 2017/068140 A1描述了基于脂肪来源的细胞的干细胞疗法。该公开提出了一种方法，其中将从脂肪抽吸物(lipoaspirate)的基质血管部分获得的干细胞在生物反应器中培养，然后冷冻和解冻至少两次，并在解冻后直接施用。

因此，发现现有技术建议代替DMSO以避免所遇到的活力和毒性问题，以及解冻后直接使用细胞产品，以此作为开发细胞产物(包括冷藏后用于治疗的间充质干细胞产物)的一般指导。

另一方面，Alves等人(Tissue Engineering；part A,vol.19,numbers 7 and 8,2013)分析了MSC在离体培养过程中遭受的氧化应激的影响以及分化潜能的逐渐丧失和降低的临床疗效。为此，作者提出使用trolox作为抗氧化剂来防止所述氧化损伤。然而，作者得出的结论是，尽管补充trolox可以减低早期培养期间的氧化损伤，但抗氧化剂显示出的有益作用仍无法挽救体外扩增后的人MSC分化能力。

为此，很明显，开发有效且标准化的基于MSC的疗法的主要关键问题是确保对所述细胞的操作(如冷藏或扩增)不会损伤细胞，以致损害其活性，例如施用后增殖和分化的能力。

此外，必须以能够在运输过程中直至施用时保持其功能性和活力的组合物的形式配制MSC，其功能性和活力通常会在数小时内丧失。

本发明提供了一种获得冷藏的，恢复的和运输调节的功能性MSC的富集群体的方法，其被配制成被开发用于低温运输和局部施用的组合物，其解决了上述问题。

发明概述

本发明涉及一种用于获得组合物的方法，所述组合物包括适于在治疗中施用的冷藏、恢复和运输调节的功能性间充质干细胞富集群体，所述方法包括以下步骤：

a.将骨髓间充质干细胞的离体样品以5×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮在含有5％至10％二甲基亚砜的冷冻保护培养基中；

b.冷藏骨髓间充质干细胞样品，先将其冷却至-70℃至-90℃至少24小时，然后再将样品存储在液氮中；

c.通过执行以下步骤来恢复骨髓间充质干细胞样品：

c1.在1至5分钟内将温度逐步升高至高达35-39℃，以解冻骨髓间充质干细胞样品；

c2.用合适的培养基将样品稀释至初始样品体积的10至30倍；

c3.离心样品，丢弃上清液并将间充质干细胞沉淀重悬于合适的培养基中；

c4.选择活力至少为70％的间充质干细胞；

c5.将步骤(c4)中选择的间充质干细胞接种到塑料支持体上，并在35-39℃的适当培养条件下，以1000-5000个细胞/cm²的细胞浓度，用包含7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的合适培养基温育所述间充质干细胞，

c6.以固定时间间隔更换含有7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的新鲜的合适培养基，并在细胞占据支持体表面的80％至100％时从支持体分离冷藏和恢复的功能性间充质干细胞；

d.将在步骤(c6)中分离的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体悬浮于用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基中，以获得包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体的组合物，其中所述用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基是等渗培养基，其包含0.25至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。

本发明进一步涉及一种组合物，其包含通过本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体。

此外，本发明还涉及一种组合物，其包含通过本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，其用作药物。