一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶
阅读说明：本技术 一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶 (Injectable temperature-controllable antibacterial hydrogel ) 是由 汪少芸 陈惠敏 蔡茜茜 陈旭 程静 游力军 王建华 于 2021-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶及其制备方法,包括：水凝胶的制备；利用流变仪测定水凝胶的流变性能；利用涂布平板法测定水凝胶的抗菌性能。本发明利用物理交联得到一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶,该方法简单方便、快速高效,得到的水凝胶具有良好的抗菌性能、温敏快速成胶特点,并且可通过注射方式来实现对不规则和深度伤口的生物医用敷料需求。本发明为制备可注射型的温敏抗菌肽基水凝胶提供一种思路及方法,有助于肽基水凝胶材料的开发利用,以便其应用在生物材料、组织工程等领域。(The invention relates to an injectable temperature-controllable antibacterial hydrogel and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: preparing a hydrogel; measuring the rheological property of the hydrogel by using a rheometer; the antibacterial properties of the hydrogels were determined by the coating plate method. The injectable temperature-controllable antibacterial hydrogel is obtained by physical crosslinking, the method is simple, convenient, rapid and efficient, the obtained hydrogel has the characteristics of good antibacterial performance and temperature-sensitive rapid gelling, and the requirements on biomedical dressings for irregular and deep wounds can be met by an injection mode. The invention provides a thought and a method for preparing injectable temperature-sensitive antibacterial peptide-based hydrogel, which is beneficial to development and utilization of peptide-based hydrogel materials and is convenient to apply to the fields of biological materials, tissue engineering and the like.)
技术领域
本发明涉及一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶，属于生物材料领域。
背景技术
水凝胶是一类具有三维聚合物或超分子聚合物网络结构的材料，其中多肽水凝胶是一种通过物理缠结形成的非共价水凝胶。它们独特的性质（如生物相容性，多孔性，可逆性和高含水量等）促使它们广泛应用于各种生物医学领域，包括组织工程，再生医学，免疫学和药物传递等领域。然而，多肽水凝胶的机械性能弱，大大限制了多肽水凝胶在生物医用材料领域的应用。因此提高多肽水凝胶的机械性能具有重要意义。
医用敷料是一种重要的伤口复愈材料，其中水凝胶是一种新型医用敷料。对于深度伤口、不规则伤口需要水凝胶具有形状可控性，因此制备一种可注射的水凝胶作为伤口敷料具有广大的发展前景。并且目前有报道的水凝胶伤口敷料的制备含有生物不相容的合成高分子、有毒的交联剂、复杂的操作流程，因此，开发一种简单、快速、高效的制备可注射型抗菌水凝胶的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述领域研究的不足，提供一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶及其制备方法，该方法操作简单、快速、高效，且得到的水凝胶具有可注射性、温度可控性、抗菌性。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶，包括以下质量浓度的原料组分：3-10 mg/mL多肽、5.0-10.0mg/mL 聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM）、0.1-0.5wt.% 抗菌物质。
所述多肽序列为EIWLK、GIWLG或DIWLR。
所述的抗菌物质为季铵盐壳聚糖QCS、聚赖氨酸、万古霉素中的一种。
所述季铵盐壳聚糖的制备方法为：称取一定量的壳聚糖，于85℃下分散于去离子水中，不断搅拌，称取三份等量的2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，往壳聚糖溶液中加入一份2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，之后每隔2h加入一份，直至三份全部加完，继续于85℃下反应12h，将混合液进行透析，截留分子量3500，最后样品进行冷冻干燥，得到季铵盐壳聚糖（QCS）。
具体的所述季铵盐壳聚糖的制备方法为：称取0.5g的壳聚糖，加入9.5mL去离子水，于85℃下搅拌，称取三份0.6255g的 2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，往壳聚糖溶液中加入一份2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，之后每隔2h加入一份，直至三份全部加完，继续于85℃下反应12h，将混合液进行透析，截留分子量3500，先用10mM NaCl溶液，然后用去离子水，透析结束后，将样品进行冷冻干燥，得到季铵盐壳聚糖QCS。
本发明一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
（1）PNIPAM溶液的制备：利用低温溶解法制备；
（2）抗菌物质溶液的制备：将抗菌物质溶于去离子水中。
（3）水凝胶的制备：多肽粉末溶于抗菌物质溶液中，再与PNIPAM溶液在低温条件下充分混匀后，室温下放置成胶。
步骤（1）中PNIPAM溶液制备如下：取一定量的PNIPAM，加入PBS缓冲液，4℃下搅拌溶解，得到PNIPAM溶液；所述PNIPAM溶液的PNIPAM质量浓度为10.0-20.0mg/mL。
步骤（2）中抗菌-PNIPAM溶液的制备如下：称取一定量的抗菌物质，加入去离子水充分溶解，所述抗菌物质质量分数为0.2%-1%。
步骤（3）中所述水凝胶制备具体操作如下：多肽粉末溶于抗菌物质溶液中，多肽浓度为6-20 mg/mL，再与PNIPAM溶液在4℃条件下充分混匀后，室温下放置成胶；各成分最终浓度为3-10 mg/mL多肽、5.0-10.0mg/mL 聚(N-异丙基丙烯酰胺)、0.1-0.5wt.% 抗菌物质。
本发明的优点在于：
本发明以多肽、PNIPAM和抗菌物质（壳聚糖、聚赖氨酸、万古霉素）为原材料，通过简单的物理复合方法制备一种具有可注射、温度响应的复合水凝胶。本发明的水凝胶制备方法操作简便，制备得到的水凝胶抗菌性能良好、可快速通过温度响应成胶，并且水凝胶的可注射性能可满足不规则和深度伤口的生物医用敷料需求，为制备可注射型的温敏抗菌肽基水凝胶提供一种思路及方法，有助于肽基水凝胶材料的开发利用，以便其应用在生物材料、组织工程等领域。
附图说明
图1为EK-QCS-PNIPAM水凝胶从溶液到凝胶转变的形貌示意图，其中EK和PNIPAM浓度均为10mg/mL，QCS质量浓度为0.3%。
图2为GG-QCS-PNIPAM水凝胶的流变性能图，其中GG浓度为4mg/mL，PNIPAM浓度为10mg/mL，QCS质量浓度为0.3%。
图3为EK-QCS-PNIPAM，GG-QCS-PNIPAM，DR-QCS-PNIPAM水凝胶的抗菌实验结果图，菌为耐甲氧西林-金黄色葡萄球菌，其中EK浓度为10mg/mL，GG浓度为8mg/mL，DR浓度为10.2mg/mL，PNIPAM浓度为10mg/mL，QCS质量浓度为0.3%；a，b分别为菌液稀释100及1000倍后涂布平板实验结果图。
具体实施方式
实施例1
称取20mg PNIPAM粉末，加入1mL PBS 溶液（pH7.0，0.2M），于4℃下搅拌溶解得到PNIPAM溶液；称取6mgQCS，加入1mL去离子水，震荡直至完全溶解，得到QCS溶液；称取10mgEK（序列EIWLK）粉末，加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到EK-QCS溶液；EK-QCS溶液与PNIPAM溶液以体积比1:1，4℃下混合均匀，并在37℃下放置即得到EK-QCS-PNIPAM水凝胶。
EK-QCS-PNIPAM水凝胶从溶液到凝胶转变的形貌示意图如图1所示。当EK-QCS-PNIPAM溶液处于4℃时为溶液状态，可用注射器进行吸取，然后注射器注射出的EK-QCS-PNIPAM溶液于37℃下（接近人的体温）可在1min内形成水凝胶，从而可通过水凝胶的温敏性实现其可注射性。
实施例2
称取20mg PNIPAM粉末，加入1mL PBS 溶液（pH7.0，0.2M），于4℃下搅拌溶解得到PNIPAM溶液；称取6mgQCS，加入1mL去离子水，震荡直至完全溶解，得到QCS溶液；称取4mg GG（序列GIWLG）粉末，加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到GG-QCS溶液；GG-QCS溶液与PNIPAM溶液以体积比1:1，4℃下混合均匀，并在37℃下放置即得到GG-QCS-PNIPAM水凝胶。
经过检测GG-QCS-PNIPAM处于4℃时为溶液状态，可用注射器进行吸取，然后注射器注射出的GG-QCS-PNIPAM溶液于37℃下（接近人的体温）可在1min内形成水凝胶，从而可通过水凝胶的温敏性实现其可注射性。
利用流变仪对水凝胶进行测试得到GG、GG-QCS-PNIPAM水凝胶的流变性能，如图2所示。从图2可知，GG水凝胶的储能模量（G׳）为130Pa左右，GG- QCS-PNIPAM水凝胶的储能模量（G׳）为10000Pa左右，提高了约77倍，通过简单的物理交联，可显著提高多肽水凝胶的力学性能。
实施例3
称取20mg PNIPAM粉末，加入1mL PBS 溶液（pH7.0，0.2M），于4℃下搅拌溶解得到PNIPAM溶液；称取6mgQCS，加入1mL去离子水，震荡直至完全溶解，得到QCS溶液；称取4mg DR（序列为DIWLR）粉末，加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到DR-QCS溶液；DR-QCS溶液与PNIPAM溶液以体积比1:1，4℃下混合均匀，并在37℃下放置即得到DR-QCS-PNIPAM水凝胶。
经过检测DR-QCS-PNIPAM处于4℃时为溶液状态，可用注射器进行吸取，然后注射器注射出的DR-QCS-PNIPAM溶液于37℃下（接近人的体温）可在1min内形成水凝胶，从而可通过水凝胶的温敏性实现其可注射性。
实施例4
称取0.5g的壳聚糖，加入9.5mL去离子水，于85℃下搅拌，称取三份0.6255g的 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，往壳聚糖溶液中加入一份2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，之后每隔2h加入一份，直至三份全部加完，继续于85℃下反应12h，将混合液进行透析（截留分子量3500），先用10mM NaCl溶液，然后用去离子水，透析结束后，将样品进行冷冻干燥，得到QCS。
称取20mg PNIPAM粉末，加入1mL PBS 溶液（pH7.0，0.2M），于4℃下搅拌溶解得到PNIPAM溶液；称取6mgQCS，加入1mL去离子水，震荡直至完全溶解，得到QCS溶液；称取8mg GG粉末，加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到GG-QCS溶液；称取10mg EK粉末，加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到EK-QCS溶液；称取10.2mg DR粉末（序列DIWLR），加入0.5mLQCS溶液，充分混匀，得到DR-QCS溶液；往多肽-QCS溶液中加入PNIPAM溶液，体积比1:1，4℃下混合均匀，吸取1mL注入24孔板中，并在37℃下放置即得到多肽-QCS-PNIPAm水凝胶，再将多肽-QCS-PNIPAm水凝胶于紫外线下灭菌。往水凝胶表面滴加200μL 菌液（浓度为108CFU/mL），置于37℃培养箱中培养6h，待样品与细菌培养结束后，将孔板取出，吸出菌液，用生理盐水清洗两遍，再用4mL生理盐水将菌洗脱下来，取50μL洗脱下来的菌液加入到LB固体培养基中进行涂布，置于37℃培养箱中培养12h后，拍照记录菌落生长情况；contol：LB固体培养基，实验组分别为EK-QCS-PNIPAM、GG-QCS-PNIPAM、DR-QCS-PNIPAM水凝胶。
每组样品的菌落生长情况如图3所示。从图3可以看出，空白对照组的菌数量最多，实验组的菌数明显少于对照组，说明多肽-QCS-PNIPAm水凝胶具有比较好的抗菌效果，其中抗菌效果EK组最好，其次DR组，最后为GG组。
以上所述仅为本发明的较佳实施实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种可注射的温度可控性抗菌水凝胶
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Ile Trp Leu Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Ile Trp Leu Gly
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Asp Ile Trp Leu Arg
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