具体实施方式

1、实验材料

HEK293T细胞、ALL细胞株Nalm-6由中科院上海细胞所引进保存。感受态细胞DH5α购自南京诺维赞生物科技有限公司。外周血T细胞来源于健康捐献者。慢病毒载体采用三质粒系统：psPAX2、pMD2.G和Lenti-EF1α。B-NSG小鼠：6-8周龄，购自百奥赛图基因生物技术有限公司，浙江大学药物安全评价研究中心SPF级环境常规饲养。

2、实验仪器

流式细胞仪Cytoflex(美国Beckman公司)；CytoFLEX LX流式细胞分析仪(美国Beckman公司)；流式细胞分选仪(美国Beckman公司)；小动物活体成像仪(美国Perkin-Elmer公司)。

3、主要试剂

RPMI 1640培养基(美国Corning公司)；DMEM(High Glucose)培养基(美国Corning公司)；胎牛血清(FBS)(美国GIBCO公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；质粒抽提试剂盒(美国Life Biotechnology公司)；Genomic DNAPurification Kit(Lifetech，CAT#K0512)；PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(日本Takara公司，CAT#6210A)；Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseHPlus)，ROX plus(日本Takara公司，CAT#RR42WR(LR×5))；IL-2(美国Peprotech公司)；anti-CD3/CD28磁珠：临床研究级别Cat#40203D(美国Thermo公司)；Bright-GloTMLuciferase Assay system(美国Promega公司，Cat：E2620)；D-Luciferin Firefly，potassium salt(美国Perkin-Elmer公司，Cat：#122799)；Goat Anti-Mouse IgG，F(ab')₂fragment特异性抗体(美国Jackson公司，货号：115-066-006)；streptavidin FITC，(美国Biolegend公司)；polybrene(美国Sigma-Adrich公司)；聚乙烯亚胺盐酸(PEI)(美国Polysciences公司)；曲美替尼粉剂(美国Selleck公司)；流式荧光抗体：anti-human CD3(PE-cy7)、anti-human CD19(APC)、anti-human CD4(APC-cy7)、anti-human CD8(PE-cy7)、anti-human CD62L(PE)、anti-human CD45RO(APC)、anti-human CD25(APC)、anti-humanCD69(PE-cy7)、anti-human PD-1(APC)、anti-human TIM-3(PE)、anti-human LAG-3(PE-cy7)、anti-human FASL(PE)、Annexin V(APC)；PE、APC、PE-cy7、APC-cy7同型对照均购自美国Biolegend公司。EasySep^TM人T细胞阴选试剂盒(美国Stem Cell公司，CAT#17951)；10×Annexin V binding buffer(美国BD bioscience公司，CAT51-66121E)。

4、溶液配制

(1)RPMI 1640完全培养基：RPMI 1640+10％FBS+1％青链霉素；

(2)DMEM(高糖)完全培养基：DMEM(高糖)培养基+10％FBS+1％青链霉素；

(3)FBS：使用前56℃水浴30min，室温冷却后分装至50ml离心管，-20℃贮存；

(4)转染试剂PEI溶液：准确称量线性化聚乙烯亚胺盐酸(Polyethylenimine，Linear，mw-25000)50mg，转移至50ml离心管中，加入50mL ddH2O，置于80℃水浴箱中将其充分溶解。调节pH至7.0，超净台内0.22um滤膜过滤除菌，分装于无菌的1.5mLEP管中，-20℃保存；

(5)IL-2溶液配制：取1支500μg IL-2冻干粉剂，溶于1ml浓度为100mM的乙酸中，进一步加入含0.1％BSA的PBS 49mL，储存浓度为1×10⁶IU/ml，分装后-80℃保存；

(6)羊抗鼠IgG，F(ab')₂片段特异性抗体配置：使用500μL无菌ddH2O溶解该抗体冻干粉末，配置浓度为1.5mg/ml，分装至100μL EP管，-80℃保存；

(7)Bright-Glo^TM Luciferase Assay反应液配置：室温下将100ml Bright-Glo^TMLuciferase Assay Buffer添加至1vial Bright-GloTM Luciferase Assay Substrate中，充分溶解后分装至15ml离心管-80℃保存；

(8)体外培养所用曲美替尼溶液配制：将曲美替尼粉剂，溶于DMSO配制成浓度为10mmol/L的贮存液，分装后-80℃贮存。临用前使用DMSO稀释成需要的不同浓度，确保所有实验中DMSO终浓度为千分之一；

(9)小动物成像用luciferin注射液配置：临用前根据3mg/鼠计算总需要量，称取相应质量的D-Luciferin Firefly，potassium salt粉剂溶于相应体积的DPBS，配置浓度为15mg/ml，并予0.22um滤器过滤后使用。

(10)1×Annexin V binding buffer：临用前取适量体积的10×Annexin Vbinding buffer加入9倍体积的ddH₂O稀释为1×溶液后贮存于4℃冰箱。

实施例1携带CAR慢病毒载体的构建制备

1、根据目的基因设计合成CAR基因片段

以靶向CD19的鼠源抗体重链和轻链可变区序列为基础(克隆号FMC63，https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589097001442)，以CD28和CD3ζ作为T细胞激活信号，构建第二代CAR序列，并在CAR的3’端通过2A多肽连接红色荧光蛋白Mcherry。CAR片段组成示意图如图1所示，上述CAR片段(序列如SEQ ID No.1所示)直接进行全基因合成，并将合成后的片段作为PCR扩增模板。

2、构建CAR慢病毒载体

(1)使用上述合成的片段作为PCR扩增的模板，使用下表1中的引物序列扩增CAR-mcherry片段，同时在序列两端通过PCR分别引入EcoRI酶切位点和XbaI酶切位点用于慢病毒表达载体构建。

表1 CAR克隆引物

(2)按照下表2配置PCR反应体系：

表2 PCR反应体系

(3)配置好PCR反应体系后，按照如下程序设置PCR仪：98℃预变性5min；98℃变性1min，60℃退火2.5min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

(4)PCR反应结束，使用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并将目的片段进行胶回收。

(5)将慢病毒表达载体Lenti-EF1α及上述胶回收的PCR产物片段使用EcoRI-XbaI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切后的载体及PCR产物片段，进行T4 DNA连接酶连接。连接体系如下表3所示：

表3克隆连接体系

(6)将上述T4 DNA连接体系置于16℃连接过夜后，取10μL转化至大肠杆菌感受态stbl3细胞中，涂布氨苄抗性的LB平板后，将LB平板置于37℃过夜培养，第二天挑取单克隆细胞进行小规模摇菌培养约5mL，使用质粒小提试剂盒提取质粒DNA后，进行Sanger测序。慢病毒载体结构如图2所示。

实施例2携带CAR慢病毒载体质粒的转化、扩增和抽提

1、质粒的转化

(1)-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞，置于冰上缓慢融化；(2)混匀感受态细胞，10μL/管分装至无菌的200μL EP管内，加入1μL携带CAR的载体质粒，冰浴20min；(3)42℃水浴锅热激60s，转移至冰上静置5min；(4)将转化好的感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素的固体LB培养皿中；(5)倒置培养皿于37℃培养箱中培养16-24小时。

2、细菌扩增

(1)取15mL离心管，加入4mL含氨苄青霉素的LB培养基；(2)使用无菌10μL枪头，挑取固体LB培养皿中生长的单个菌落克隆，放入到上述离心管中，摇床培养4-6小时(37℃，200rpm)；(3)4-6小时后若离心管中有出现絮状悬浮的细菌，再将其转移至500ml含氨苄青霉素的LB培养基的锥形瓶中，摇床继续振荡培养12-16小时。

3、质粒抽提(大抽)

(1)500mL菌液分装至无菌离心瓶内，4000g离心10min，弃上清收集沉淀菌体；(2)添加含RNA酶的R3溶液10ml重悬沉淀；(3)加入10ml Lysis Buffer(L7)，充分混匀后室温静置5min，裂解菌体；(4)加入10ml Precipitation Buffer(N3)，混匀后室温12000g离心10min；(5)收集上清悬液，置于柱子中过滤；(6)加入60ml Wash Buffer(W8)于柱子中，清洗吸附在柱子中的质粒；(7)将柱子放置于新的无菌50ml离心管上，加入15ml ElutionBuffer(E4)洗脱，离心管中得到质粒悬液；(8)加入10.5ml异丙醇，混匀，4℃离心(12000g，30min)；(9)弃去上清，加入5ml 70％乙醇，4℃离心(12000g，10min)；(10)弃去上清后自然干燥10min，根据得到的质粒的量，加入适当体积的ddH2O重悬质粒，测定DNA浓度，将浓度调整为500-1000ng/μL，-20℃储存。

实施例3携带CAR慢病毒的包装

1、HEK293T细胞的复苏和培养

(1)从液氮罐中取出HEK293T细胞，并迅速放入37℃水浴锅中解冻；(2)细胞解冻后，在超净工作台内将冻存管中的细胞悬液转移至15ml离心管，并向离心管内加入5mLDMEM(高糖)完全培养基。细胞悬液混匀后置于离心机中，设置离心参数100g，室温离心8分钟；(3)离心结束后，弃去上清，加入10mL DMEM(高糖)完全培养基，轻轻吹打重悬细胞后转移至10cm培养皿中，混匀后置于37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养；(4)倒置显微镜下每天观察细胞形态和汇合度，若细胞汇合度不足80％，则将细胞放回培养箱继续培养；若细胞汇合度>80％，则进行细胞传代扩大培养；(5)传代培养：将培养皿中的培养基弃去，加入5mL的PBS轻轻润洗细胞一次以去除残留培养基，加入1mL 0.05％胰酶，轻轻晃动培养皿，确保所有的细胞表面被胰酶润洗过，将培养皿放在37℃、5％CO₂培养箱中2分钟，取出并置于倒置显微镜下观察，直至细胞形态变圆或从培养皿底部脱离；(6)向培养皿中加入5mL DMEM(高糖)完全培养基，混匀后将细胞转移至15ml离心管中300g离心5分钟；(7)离心后弃上清，DMEM(高糖)完全培养基重选后置于37℃、5％CO₂培养箱中继续扩大培养。

2、慢病毒包装

(1)上述培养的HEK293T细胞，在细胞汇合度60-70％时用于病毒包装；(2)计算所需各质粒用量，配置PEI/DNA复合物(以10cm培养皿10ml体系计算)：不含血清和青链霉素的高糖DMEM培养基(200μL)+CAR(7.5μg)+psPAX2(5.625μg)+pMD2.G(1.875μg)+PEI(45μg)轻轻摇晃混匀后，室温静置20分钟；(3)将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到10cm培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀。将培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱，培养6-8小时后，将含有转染试剂的培养基吸取弃去，更换为新鲜的DMEM(高糖)完全培养基；(4)48小时后收集培养皿中的培养基，并更换新鲜的DMEM(高糖)完全培养基继续培养；(5)72小时再次收集培养皿中的培养基，与48小时收集的培养基混合，400g离心5分钟，弃去培养基中的细胞碎片，并予0.45um的滤膜过滤；(6)将收集的培养基转移至超速离心管中(25ml/管)，电子天平上准确称量配平，使用Beckman超速离心机，60000g 4℃离心2小时；(7)离心结束后，在超净工作台中，将离心管中的液体弃去，加入100μL不含FBS和青链霉素的RPMI 1640培养基(添加的体积按照250倍比例浓缩)，培养基覆盖离心管中的沉淀物，并将其置于4℃冰箱中浸泡过夜；(8)第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬。按100μL/管分装，将病毒悬液置于-80℃保存。

3、慢病毒滴度测定

(1)将293T细胞按照2×10⁵/孔接种于6孔板过夜；(2)次日观察六孔板中293细胞形态，确认细胞生长良好后取一孔细胞用胰酶消化后计数；(3)解冻一支分装的浓缩病毒液20μL，混匀，在EP管中配制病毒稀释液(含6μg/mL的polybrene)；(4)将病毒浓缩液稀释10倍至200μL终体积并混匀，并按下列浓度配制病毒稀释液：

孔1∶100μL稀释10倍的病毒液+400μL细胞培养液(含浓缩病毒液10μL)；

孔2∶30μL稀释10倍的病毒液+470μL细胞培养液(含浓缩病毒液3μL)；

孔3∶10μL稀释10倍的病毒液+490μL细胞培养液(含浓缩病毒液1μL)；

取10μL稀释10倍的病毒液加入90μL细胞培养液再次稀释10倍。

孔4∶30μL稀释100倍的病毒液+470μL细胞培养液(含浓缩病毒液0.3μL)；

孔5∶10μL稀释100倍的病毒液+490μL细胞培养液(含浓缩病毒液0.1μL)；

孔6∶500μL细胞培养液(对照)；

(5)弃去6孔板各孔中原有的细胞培养液，加入以上配置的各浓度病毒稀释液；(6)6小时后沿孔壁小心加入2.5ml新鲜培养液至各孔中；(7)72小时后消化各孔中的293细胞，洗涤，流式检测各孔中Mcherry阳性细胞比例；(8)病毒滴度计算：病毒颗粒数/ml＝加病毒液时每孔293T细胞数×Mcherry阳性细胞比例/每孔实际添加病毒原液体积(ml)。

实施例4 CAR-T的制备

1、健康供者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的分离。

(1)采集健康供者外周血10-20ml；(2)使用等体积的PBS将外周血进行稀释；(3)取15ml离心管，加入5ml ficoll分离液，使用移液枪将稀释后的血样10ml沿管壁缓慢添加至ficoll分离液的上方，避免ficoll分离液与血样的混合；(4)将离心机设置为400g，设置转速上升为4档，转速下降为0档，室温离心30分钟；(5)离心结束后，轻轻吸取处于血清与ficoll分离液界面的絮状单个核细胞层并转移至一个新的离心管中，PBS洗涤细胞2次。

2、使用EasySep^TM人T细胞阴选试剂盒从PBMC中分离T细胞(美国Stem Cell公司，CAT#17951)

(1)计数获取的单个核细胞，以含2％FBS的PBS重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁷/ml。(2)将样本转移到5ml无菌流式管里，每毫升样本加入50μL分离抗体组合并混匀，室温下孵育5min。(3)震荡RapidSpheres^TM 30s，每毫升样本中加入40μL RapidSpheres^TM并混匀，室温下孵育30s。(4)加入一定量含2％FBS的PBS至总体积为2.5mL。(5)将装有样本的无菌流式管放入EasySep^TM磁极(加拿大StemCell公司，Catalog#18000)中室温下静置3min。(6)取一根新的15ml离心管，倾倒磁极和与之相连的无菌流式管，以将无菌流式管里的细胞悬液倒入15ml离心管中。该细胞悬液即包含富集的T细胞(给细胞标记anti-human CD3 PE-cy7流式抗体，流式细胞仪检测纯度在90％以上)。(7)设置离心机参数为300g，5min，离心沉淀T细胞团块。

3、使用antiCD3/CD28 Dynabeads激活T细胞

(1)计数获取的T细胞，含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至10⁷/ml。(2)用1％BSA/PBS溶液洗涤anti-CD3/CD28磁珠(临床研究级别：Cat#40203D，Thermo)2遍；洗涤方法：取5ml1％BSA/PBS溶液置于50ml离心管中，加入计算后所需要的anti-CD3/CD28磁珠的量，充分混匀后置于磁力架上静置1分钟，磁珠贴于两侧离心管壁，吸取弃去1％BSA/PBS溶液。重复洗涤1次。(3)按照T细胞纯度为95％，磁珠∶CD3(+)T细胞＝3∶1，将洗涤后的anti-CD3/CD28磁珠与T细胞充分混匀，移至T25细胞培养瓶中，置摇床轻轻摇晃30分钟，使磁珠与CD3(+)T细胞充分结合。(4)用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬结合磁珠的CD3(+)T细胞，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养24小时。

4、慢病毒感染T细胞

(1)离心并计数结合磁珠的CD3(+)T细胞，用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至4×10⁶/ml，按500μL/孔接种于12孔板。(2)按照MOI＝3，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量＝(MOI×细胞数量)/病毒滴度。(3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在12孔板中加入上述计算所得的病毒量，预留一孔T细胞不加入病毒作为未感染CAR的T细胞对照(untransduced T)，给上述各孔细胞添加终浓度为6μg/mL的polybrene，充分混匀后置于37℃，5％CO₂的培养箱中，6-8小时后补充含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基至2ml，继续培养24小时。(4)24小时后，300g离心5分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至六孔板或培养瓶中，以后当培养基变黄或细胞密度超过2.5×10⁶/ml时，对细胞进行换液，以新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基培养。(5)加入病毒感染4天后，使用5ml移液枪吹打培养瓶中CAR-T细胞，并将细胞移入50ml离心管中，置于磁力架上静置1min，磁珠被吸附于管壁后，将细胞混悬液转移至新的离心管中，离心并添加新鲜含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基继续扩大培养。(6)取部分细胞使用流式细胞仪检测细胞表面CAR分子的表达。

5、流式细胞仪检测CAR-T细胞比例

(1)细胞悬液制备：收集体外制备扩增培养的CAR-T细胞离心洗涤计数后，取3×10⁵个细胞加入流式管中，使用100μL PBS缓冲液重悬细胞成单细胞悬液。(2)标记抗体：向相应流式样品管中加入1.5μL Goat Anti-Mouse IgG，F(ab')2fragment特异性抗体4℃避光孵育30min。(3)洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清。(4)流式管中添加100μL PBS，混匀后加入streptavidin FITC 1.5μL，4℃避光孵育30min。(5)洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清。(6)检测与分析：使用500μL PBS缓冲液重悬标记后的细胞，流式细胞仪上机检测。(7)FlowJo X 10.0.7r2软件分析数据，结果以阳性细胞比例表示，CAR-T细胞的比例为RFP/CAR双阳性细胞比例。

结果如图3所示，按MOI＝3加入病毒感染T细胞，感染效率可达50％及以上，细胞表面CAR分子表达良好，使用Goat Anti-Mouse IgG，F(ab')2fragment特异性抗体检测鼠源scFv效果佳。

实施例5 CAR-T细胞的流式分选

(1)T细胞感染携带CAR的慢病毒后4-5天，流式检测确定细胞表面CAR表达后收集细胞。(2)流式细胞分选缓冲液(含2％FBS和2％青链霉素的PBS)将CAR-T细胞重悬，配制细胞浓度为3-5×10⁷ml。(3)上机，无菌环境下选取收集Mcherry阳性细胞于含40％FBS+2％青链霉素RPMI1640培养液中，分选结束取少量细胞回测确定分选纯度是否大于90％。(4)将分选后的CAR-T细胞置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中孵育20min。(5)设置离心参数为200g，离心20min后弃上清，使用含2％青链霉素和IL-2200IU/ml的RPMI 1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度至0.5-1×10⁶ml置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养。

实施例6 Nalm-6细胞株培养和冻存

(1)肿瘤细胞常规培养，采用RPMI 1640完全培养液，在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，2-3天换液传代一次，取对数生长期细胞用于实验。(2)细胞冻存：取对数生长期的细胞株，300g离心5min，弃上清，加入冻存液(由90％FBS+10％DMSO)，调整密度至1×10⁷/mL。按照1ml细胞悬液/冻存管分装，封口膜封闭冻存管。将冻存管放入细胞冻存盒中，在负80℃冰箱放置24小时后，转移到液氮中。

实施例7建立过表达luciferase和GFP的Nalm-6细胞株

(1)Nalm-6细胞株常规培养于RPMI 1640完全培养液，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中。(2)pHIV-Luc-ZsGreen慢病毒载体质粒(货号：39196)购买自addgene公司。(3)按照前述方法转化质粒、扩增细菌、抽提质粒，并储存于-20℃冰箱。(4)按照前述方法进行病毒包装并储存于-80℃冰箱。(5)取对数生长期的Nalm-6细胞株，调整细胞浓度至4×10⁶/ml，按500μL/孔接种于12孔板，按照MOI＝3，计算所需要的病毒量。(6)加入病毒后，添加终浓度为6μg/mL的polybrene，充分混匀后置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养6-8小时，补充RPMI1640完全培养液至2ml，继续培养24小时。(7)24小时后300g离心5分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至六孔板或培养瓶中，继续培养3-6天。(8)流式细胞仪测定GFP阳性Nalm-6细胞比例。(9)流式细胞分选仪分选并收集GFP阳性Nalm-6细胞，确保GFP阳性Nalm-6细胞比例大于90％，长期培养并取部分细胞冻存。

如图4所示，过表达GFP和luciferase的Nalm-6细胞株显绿色荧光，说明转染成功。

实施例8体外评估CAR-T细胞的杀伤功能

(1)收集培养的CAR-T和untransduced T细胞，离心后用含IL-2(200IU/ml)的RPMI1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×10⁵/ml。(2)收集培养的luciferase(+)Nalm-6细胞，离心后用含IL-2(200IU/ml)的RPMI 1640完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×10⁵/ml。(3)在圆底96孔板中加入100μL的luciferase(+)Nalm-6细胞。(4)按照效靶比1∶1，0.5∶1，0.25∶1分别在圆底96孔板中加入相应数量的效应细胞(CAR-T和T细胞)，吸取体积分别为100μL，50μL，25μL，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养8小时。(5)按照400g，10min离心圆底96孔板，弃去上清，每孔加入50μL PBS。(6)混匀后将细胞转移至黑色不透光96孔板。(7)每孔均加入50μL Bright-Glo^TM Luciferase Assay System，混匀避光2min，酶标仪检测各孔荧光值。(8)杀伤率计算方法：杀伤率(％)＝(T细胞孔荧光值-CART细胞孔荧光值)/T细胞孔荧光值×100％。

结果：CAR-T具有显著的体外杀伤Nalm-6细胞株的功能。且随着效靶比的增高，杀伤效应愈强(图5)。

实施例9细胞亚群检测

(1)取培养6天的mcherry阳性CAR-T细胞和untransduced T细胞，用含人IL-2200IU/mL的RPMll640完全培养基重悬并使用全自动细胞计数仪进行计数，按3×10⁵/孔接种至6孔板中，并添加等体积的不同浓度的曲美替尼及DMSO作为对照，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，每3天离心换液，重新添加曲美替尼，计数以后各组分别留取1×10⁶CAR-T细胞重新加药后继续培养。(2)实验分组：CAR-T+曲美替尼7.5nmol/L组、CAR-T+曲美替尼15nmol/L组、CAR-T+曲美替尼30nmol/L组、CAR-T+等体积DMSO组，untransduced T+等体积DMSO组。(3)采集时间点：分别于加药后第3天和第6天(相当于体外培养第9和第12天)进行流式细胞术检测。(4)流式细胞术检测操作步骤：①样本采集及处理：混匀六孔板中各组细胞悬液并计数后，各组分别吸取适量细胞悬液离心洗涤后按照3-4×10^5个细胞/管加入流式管中，使用100μL PBS缓冲液重悬细胞；②标记抗体：向相应流式样品管中加入1.5μL相应荧光标记的CD4、CD8、CD45RO、CD62L抗体，4℃避光孵育30min；③洗涤：每管加入1mLPBS缓冲液，混匀后常温下300g离心5min，弃上清；④检测与分析：使用500μL PBS缓冲液重悬标记后的细胞，流式细胞仪上机检测，使用FlowJo X 10.0.7r2软件分析，以mcherry阳性CAR-T为分析对象设门，分析各亚群的比例。(5)细胞各亚群定义为：杀伤性T细胞：CD8+，辅助性T细胞：CD4+，初始T细胞：CD45RO-CD62L+，中心记忆T细胞：CD45RO+CD62L+，效应记忆T细胞：CD45RO+CD62L-，效应T细胞：CD45RO-CD62L-，均以比例表示。

结果：我们在28z CAR-T体外培养第6天时加入曲美替尼连续培养28z CAR-T至第12天，然后在第9天和第12天时分别取样进行流式检测。我们发现：不管在第9天还是第12天，28z CAR-T的亚群构成均以TCM和TEM为主。在第9天时由于28z CAR-T尚未向下游分化，所以曲美替尼减少28z CAR-T终末分化的作用并不显著，但是到了第12天，28z CAR-T相比untransduced T在tonic signaling的驱动下发生了终末分化，曲美替尼减少28z CAR-T终末分化的作用得以显现，表现在经曲美替尼处理的28z CAR-T细胞TCM的比例显著增加，TEM的比例显著减少，且这种TCM的增加和TEM的减少在低浓度曲美替尼(7.5nM和15nM)处理时即可以明显出现，并呈现出剂量依赖效应，即变化的程度随着培养体系中曲美替尼浓度的增加而增加(图6)。

实施例10细胞活化和耗竭相关表面分子的检测

(1)实验分组，细胞培养，样本采集时间点及流式细胞术样本制备操作步骤均与实施例9一致。(2)按前述方法收集样本、标记CD25、CD69、PD-1、TIM-3和LAG-3的荧光标记抗体和相应的同型对照抗体，洗涤后重悬，流式细胞仪检测。(3)数据分析：使用FlowJo X10.0.7r2软件分析数据，以mcherry阳性CAR-T为分析对象设门，结果以阳性细胞比例表示。(4)活化标记以CD25、CD69阳性比例表示；耗竭相关标记以PD-1、TIM-3、LAG-3阳性比例表示。

结果：我们在28z CAR-T体外培养第6天时加入曲美替尼连续培养至第12天，然后在第9天和第12天时分别取样进行流式检测。我们发现：在第9天和第12天，曲美替尼均能降低CAR-T的活化程度，减少tonic signaling驱动的耗竭相关抑制性分子(PD-1、TIM-3、LAG-3)的表达。且这种耗竭和活化标记的减少在较低浓度曲美替尼(7.5nM和15nM)处理时即可以明显出现，并呈现出剂量依赖效应，即变化的程度随着培养体系中曲美替尼浓度的增加而增加(图7)。

实施例11 CAR-T细胞绝对数量计数及比例检测

(1)取培养6天的mcherry阳性CAR-T细胞和untransduced T细胞，用含人IL-2200IU/mL的RPMll640完全培养基重悬并使用全自动细胞计数仪进行计数，按3×10⁵/孔接种至6孔板中，并添加等体积的不同浓度的曲美替尼及DMSO作为对照，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，每3天离心换液，重新添加曲美替尼，计数及检测CAR-T细胞比例；各组分别留取1×10⁶CAR-T细胞重新加药后继续培养。(2)实验分组为CAR-T+曲美替尼7.5nmol/L组、CAR-T+曲美替尼15nmol/L组、CAR-T+曲美替尼30nmol/L组、CAR-T+等体积DMSO组，untransduced T+等体积DMSO组。(3)细胞计数及流式细胞术检测具体操作步骤：①采集时间点：分别于加药后第3天和第6天(相当于体外培养第9天和第12天)取样检测；②样本采集及处理：混匀六孔板中的各组细胞悬液后，将各组细胞悬液分别吸取至15ml离心管中，300g，5min离心后弃上清。各管分别加入1ml含IL-2 200IU/ml的RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀并混匀，而后各管分别吸取15μL细胞悬液，用15μL 0.8％台盼蓝进行1∶1稀释。取稀释后的细胞悬液加入细胞计数板中用Count Star全自动细胞计数仪计数活细胞的数量三次，取平均值；另外各组吸取适量CAR-T细胞按照实施例4中第5点所述步骤标记GoatAnti-Mouse IgG，F(ab')₂fragment特异性抗体；③样本检测：流式细胞仪检测样本中mcherry及CAR的比例及荧光强度，FlowJo X 10.0.7r2软件分析样本中mcherry/CAR双阳CAR-T细胞比例。④计算方法：CAR-T细胞扩增倍数＝活细胞数量×CAR-T细胞比例/初始细胞数量。

结果：曲美替尼会抑制体外培养的28z CAR-T细胞的增殖，且这种抑制增殖的效应呈现剂量依赖性，即培养体系中曲美替尼的浓度越高，它抑制28z CAR-T细胞增殖的效应越显著。另外曲美替尼抑制28z CAR-T细胞增殖的效应随体外培养时间的延长愈发显著。表现在第12天时曲美替尼处理组和DMSO处理组28z CAR-T细胞扩增倍数的差别较第9天时大(图8A，B，C)。由于我们是在28z CAR-T体外培养第6天时加入曲美替尼，所以这种扩增倍数的降低并不会影响临床上获得足够数量的28z CAR-T细胞。而且实施例9和实施例10的数据显示曲美替尼在低浓度(7.5nM和15nM)时就可以明显减少28z CAR-T的过度活化，耗竭，凋亡和终末分化，而在低浓度的情况下曲美替尼抑制28z CAR-T扩增的作用并不强，所以为了在28z CAR-T扩增和曲美替尼抗耗竭和终末分化的效应之间取得平衡，我们建议在28z CAR-T培养体系里加入15nM浓度的曲美替尼。

实施例12 Annexin V流式检测

(1)细胞培养，实验分组及样本采集时间点均与实施例9一致。(2)按实施例9所述收集样本加入流式管中以PBS离心洗去残余培养基后，每管加入100μL 1×Annexin Vbinding buffer重悬细胞。(3)每管加入1.5μL Annexin V APC在4℃避光孵育30min。(4)孵育毕直接加入500μL 1×Annexin V binding buffer混匀细胞后流式细胞仪上机检测。使用FlowJo X 10.0.7r2软件分析，结果以Annexin V阳性细胞比例表示。

结果：我们在28z CAR-T体外培养第6天时加入曲美替尼连续培养28z CAR-T至第12天，然后在第9天和第12天时分别取样进行流式检测。我们发现：在第9天时，28z CAR-T相比untransduced T并未发生明显凋亡，此时加入曲美替尼处理的组凋亡细胞比例反而有轻微升高，但是并没有统计学差异(图9A)。但是到了第12天，28z CAR-T相比untransduced T在tonic signaling的驱动下发生了明显凋亡，此时曲美替尼处理组的28z CAR-T相比DMSO处理组的28z CAR-T凋亡细胞的比例即有减少，且这种减少在低浓度曲美替尼(7.5nM和15nM)处理时即可以明显出现，差异有统计学意义(图9B)。

实施例13多功能酶标仪检测分析体外加入曲美替尼培养对CAR-T杀伤功能的影响

(1)实验分组：CAR-T+曲美替尼15nmol/L组，CAR-T+等体积DMSO组。(2)细胞培养和样本采集时间点与实施例11一致。(3)收集培养的各组CAR-T细胞，未转染的T细胞和luciferase(+)Nalm-6细胞，按配置细胞浓度，按照效靶比0.25∶1，0.5∶1，1∶1接种于圆底96孔板中；CAR-T与Nalm-6细胞在96孔板里培养时不添加曲美替尼，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养16小时。(4)16小时后，按照实施例8所述步骤离心，转移细胞，添加PBS和Bright-GloTM Luciferase Assay System，酶标仪检测各孔荧光值。(5)杀伤率计算方法：杀伤率(％)＝(T细胞孔荧光值-CART细胞孔荧光值)/T细胞孔荧光值×100％。

结果：含有曲美替尼的培养体系并不影响28z CAR-T的体外杀伤功能。因为观察到含有曲美替尼的28z CAR-T培养体系可以改变28z CAR-T中CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例，所以我们进一步评估这一培养体系是否会影响28z CAR-T的体外杀伤功能。我们在28zCAR-T体外培养第6天时加入曲美替尼连续培养CAR-T至第12天，然后在第9天和第12天时分别取样以0.25∶1，0.5∶1，1∶1的效靶比与带luciferase的Nalm-6细胞共培养16小时进行体外杀伤实验，在体外杀伤时不加入曲美替尼。我们发现：无论是在第9天还是第12天，含有曲美替尼的体外培养体系不会影响各个效靶比下28z CAR-T的杀伤功能(图10)。

实施例14 ALL-NSG小鼠体内评估经曲美替尼处理的CAR-T细胞的疗效。

(1)CAR-T细胞准备：制备untransduced T细胞和携带Mcherry的CAR-T细胞，取培养6天的CAR-T细胞，流式细胞仪检测CAR-T细胞的比例。分3组进行培养①CAR-T+曲美替尼15nM组，②CAR-T+等体积DMSO组，③untransduced T+等体积DMSO组，每3天更换培养基并重新添加药物，连续培养9天。(2)ALL-NSG小鼠模型准备：6-8周龄NSG小鼠饲养于SPF级动物研究中心。取对数生长期luciferase(+)Nalm-6细胞株，配制细胞浓度至5×10⁶/ml，按1×10⁶/鼠尾静脉注射，每只鼠注射总体积200μL。5天后小动物活体成像仪检测肿瘤负荷，按荧光强度随机分为3组，调整3组平均荧光强度无显著差异，次日尾静脉注射不同处理的CAR-T细胞。(3)实验分组：实验分成3组，每组4只小鼠，分别为①尾静脉注射经曲美替尼15nM处理9天的CAR-T细胞，②尾静脉注射经等体积DMSO处理9天的CAR-T细胞，③尾静脉注射经等体积DMSO处理9天的untransduced T细胞。(4)CAR-T细胞尾静脉注射：按照3×10⁶CAR-T细胞/鼠并根据CAR-T细胞比例计算每只鼠所需要的总细胞量，收集培养的CAR-T细胞离心后PBS重悬，配置浓度为1.5×10⁷CAR-T细胞/ml；使用untransduced T细胞将各组小鼠输入体内的总细胞量调为一致，将制备好的各组细胞悬液以尾静脉注射的方式接种至NSG小鼠体内，注射体积为200μL/鼠。(5)疗效及生存观察：①每周使用小动物活体成像仪给小鼠成像，比较三组小鼠肿瘤负荷差异；②对比观察各组小鼠毛色及活动状态；③记录各组小鼠死亡时间，绘制生存曲线。

我们在CAR-T体外培养第6天时加入15nM曲美替尼连续培养CAR-T 9天至第12天，然后在第12天时将CAR-T细胞回输到ALL肿瘤小鼠体内。定期通过小动物活体成像检测小鼠肿瘤负荷的变化并绘制小鼠生存曲线。我们发现：曲美替尼体外处理后的28z CAR-T由于含有更丰富的TCM，在体内的持续时间更长，在体内可以发挥更好的抗肿瘤效果(图11、图12A，B)。其中输注经DMSO处理的untransduced T细胞小鼠的中位生存期为27天，输注经曲美替尼处理的28z CAR-T小鼠的中位生存期为62.5天，输注经DMSO处理的28z CAR-T小鼠的中位生存期为41天，这三组小鼠的生存期两两之间进行比较有统计学差异，说明含有曲美替尼的CAR-T体外培养体系可以提高28z CAR-T细胞的体内疗效。

序列表

<110> 浙江大学

<120> MEK抑制剂在减少CAR-T细胞耗竭和终末分化中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatttctgg gtgctggtcg ttgtgggcgg cgtgctggcc 960

tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc atcatctttt gggtgaggag caagcggagc 1020

agactgctgc acagcgacta catgaacatg accccccgga ggcctggccc cacccggaag 1080

cactaccagc cctacgcccc tcccagggat ttcgccgcct accggagcag agtgaagttc 1140

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1464

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcgaattcg ccgccaccat ggcctt 26

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggtctagat tactacttgt acagctcgtc c 31